PLoS ONE: Silencing Nuclear Pore Protein Tpr fremkalder en ældede-Like Fænotype i Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Tpr er en stor coiled-coil protein ligger i den nukleare kurv af den nukleare pore kompleks for hvilke der er foreslået mange forskellige funktioner fra gær til menneske.

Metode /vigtigste resultater

Her viser vi, at udtømning af Tpr af RNA-interferens udløser G0-G1 anholdelse og i sidste ende inducerer en aldrende -lignende fænotype afhængig af tilstedeværelsen af ​​p53. Vi fandt også, at Tpr udtømning svækker NES [nuklear eksport sekvens] -afhængige nuklear eksport af proteiner og forårsager delvis co-udtynding af Nup153. I tilføjelse Tpr udtynding indvirkninger på niveau og funktion af SUMO-protease SENP2 hvilket påvirker SUMOylation regulering på det nukleare pore og overordnede SUMOylation i cellen.

Konklusioner

Vores data for første gang giver bevis for, at en kerneporen komponent spiller en rolle i kontrollen cellulær ældning. Vores resultater peger også på nye roller for Tpr i reguleringen af ​​SUMO-1 konjugering ved nukleare pore og direkte bekræfte Tpr involvering i den nukleare eksport af NES-proteiner

Henvisning:. David-Watine B (2011) silencing Nuclear Pore Protein Tpr fremkalder en ældede-Like Fænotype i kræftceller. PLoS ONE 6 (7): e22423. doi: 10,1371 /journal.pone.0022423

Redaktør: Michael Polymenis, Texas A M University, USA

Modtaget: April 1, 2011; Accepteret: 22 juni 2011; Publiceret: 19 juli 2011

Copyright: © 2011 Brigitte David-Watine. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Institut Pasteur. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatteren har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nuclear pore komplekser (NPCs) mægle alle selektiv tovejs transport mellem kernen og cytoplasmaet. Beviser er også nye peger på yderligere roller for NPC’ere, deres konstituerende proteiner (nucleoporins) og tilhørende transportproteiner, hvoraf nogle er uafhængige af klassisk transport [1], [2]. Det kan derfor med rimelighed hypotese, at NPC’ere er nøglen i patologiske celle tilstande, hvor abnorm cellevækst er et centralt element.

Proteinet Tpr (for omplantes promotor-regionen) og dets homologer er en konserveret komponent på den nukleare side af NPC . Hos pattedyr Tpr er et 267 kDa strukturelle protein med en lang N-terminalt domæne, der associerer i en dimer for at danne en parallel, to-strenget coiled-coil. Den C-terminale domæne er meget sure og forventes at være ustruktureret [3]. I pattedyrceller Tpr er begrænset til nucleoplasmic fibriller af NPC og det er blevet foreslået, at det fungerer som den primære arkitektonisk element i den nukleare kurven [4], [5]. Pattedyr Tpr er tøjret til NPC gennem interaktion med Nup153 [5], [6], [7], [8]. Mange funktioner er blevet tilskrevet Tpr og dets homologer i forskellige arter foruden en rolle i NPC arkitektur. Disse omfatter mRNA eksportkontrol [9], [10], nuklear protein eksport [4], [11], tavse telomert kromatin organisation og telomer længde kontrol [12], [13], [14]. Desuden har Drosophila og human Tpr blevet vist at være involveret i spindel checkpoint kontrol [15], [16], [17] og human Tpr i kontrollen af ​​Erk2 nucleo-cytoplasmatisk translokation [18].

TPR homologer i gær, Mlp1p-Mlp2p, er involveret i at fastgøre SUMO-protease Ulp1p til NPC [19], [20]. Denne funktionelle interaktion synes at være konserveret i Arabidopsis thaliana mellem ESD4 og NUA, som er homologer af Ulp1p og Tpr henholdsvis [21]. SUMOylation svarer til den post-translationelle konjugation af SUMO (lille ubiquitin-relateret modifier protein) til en specifik lysinrest i et målprotein. SUMOylation formidles af en enzymatisk kaskade reaktion, der involverer successivt en SUMO-aktiverende enzym eller E1 og en unik E2 SUMO-konjugerende enzym, Ubc9. SUMO ændring er reversibel, da SUMO-specifikke proteaser kan dekonjugere SUMO-delen fra modificerede proteiner tyder på, at protein SUMOylation er dynamisk reguleret i celler [22], [23]. Blandt de Ulp1p-relaterede SUMO-proteaser, der er blevet karakteriseret i pattedyr, SENP1 og SENP2 viser den største lighed med gær Ulp1 og er også forbundet med det nukleare kuvert. Ulp1p og SENP2 deler den egenskab at blive rettet mod NPC af deres ikke-katalytiske N-terminale domæner [24]. Men hos hvirveldyr, den N-terminale NPC-målretningsdomæne i SENP2 interagerer med den C-terminale domæne i Nup153, men ikke med Tpr [25], [26].

Cellulær senescens blev først beskrevet som ” replikativ senescens “på grund af den begrænsede levetid af humane diploide fibroblaster in vitro [27]. Studier i cancerceller har vist, at på trods af, at de er i stand til at dele sig uendeligt, kan en tilstand ligner replikativ senescens være akut induceres af forskellige stimuli, såsom kemoterapeutiske midler og stråling. Dette er derfor i en anden celle program, foruden apoptose, der kan begrænse celleproliferation [28], [29]. Aldrende celler er kendetegnet ved forstørret cellestørrelse, fladtrykt morfologi, manglende evne til at syntetisere DNA og ekspression af senescens-associerede (SA) -β-galactosidase, det biomarkør for senescens [30].

Vi rapporterer her, at Tpr er kritisk for celleproliferation og at Tpr udtynding fører til en senescens-lignende fænotype, der er afhængig af p53. Også Tpr nedregulering indvirkninger på den nukleare eksport af proteiner med en Crm1-afhængig nuklear eksport sekvens (NES). Niveauer af Nup153 og SENP2 funktion på den nukleare pore er også berørt. Som blev observeret følge heraf betydelige ændringer i mønstret for SUMO-1 konjugering ved NPC og inde i cellen.

Resultater

Tpr knockdown inducerer G0-G1 anholdelse og en aldrende fænotype i HeLa-celler

Tpr er for nylig blevet beskrevet at have flere forskellige funktioner, men dens rolle i cellecyklus, celle skæbne og spredning er aldrig blevet fuldt vurderet. Vi undersøgte således den virkning Tpr udtømning på cellecyklussen hjælp siRNA’er rettet mod Tpr i HeLa-celler. Vi fandt, at niveauet for Tpr protein specifikt blev reduceret efter 48 timers behandling med en af ​​de to syntetiske siRNA’er anvendes, som vist ved Western blot-analyse af totale celleekstrakter af behandlede HeLa-celler (fig. 1A og S1a).

HeLa-celler podet i 24-brønds plader ved 5 10

-4 celler pr brønd blev behandlet med Tpr eller mock siRNA’er. 1A. 48 timer efter siRNA behandling som anført på toppen af ​​figuren, blev en celleekstrakt fremstillet og analyseret ved western blotting under anvendelse af anti-Tpr Mab 203-37; tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. 1B. Lysfelt billede (højre panel) og konfokal billede (venstre panel), i HeLa-celler mærket med et anti-Tpr monoklonalt antistof efter 2 dages transfektion med Tpr eller mock siRNA. Målestok: 5 um. 1C. Vækst kurve af HeLa-celler transficeret med Tpr, mock siRNA eller ikke transfekteret: kontrol (Ctrl). 1D. Repræsentative FACS profiler af mock siRNA behandlet (venstre panel), Tpr siRNA’er behandlede celler (i midten) og ikke-transficerede celler eller kontrol (højre). Ethanol-fikserede celler blev inkuberet med PI og analyseret ved FACS for ploidi. Celle nummer er repræsenteret på den vertikale akse og DNA-indhold på den vandrette akse. G0-G1 og G2-M-faser er repræsenteret som første og andre toppe startende fra den lodrette akse, henholdsvis. Den mellemliggende stribet domæne svarer til S-fasen. 1E. Induktion af senescens: celler blev udpladet ved lav densitet og behandlet med Tpr eller mock siRNA’er. Efter 6 dage blev cellerne fikseret og farvet for SA-β-gal-aktivitet ved pH 6,0. Scale bar: 20 pm. 1F. Kvantificering af SA-β-gal-positive celler i kulturer udtømt for Tpr og farvet for SA-β-gal-aktivitet ved pH 6,0. 1G-1H. U2OS celler blev transficeret med Tpr eller mock siRNA’er. 1G: Efter 6 dage blev cellerne fikseret og farvet for BrdU-inkorporering og SA-β-gal-aktivitet ved pH 6,0. Målestok: 15 um. 1H: Efter 6 dage blev cellerne mærket med anti-HP1γ og anti-MacroH2A antistoffer og DAPI. Målestok: 5 um. 1I: A375-celler blev transficeret med Tpr eller mock siRNA’er. Efter 6 dage blev cellerne fikseret og farvet for SA-β-gal-aktivitet ved pH 6,0. Scale bar: 15 pm

Vi derefter bestemmes placeringen i HeLa celler ved konfokal mikroskopi (figur 1B.).. Optiske snit gennem midten af ​​kernen viste punktformig mønster karakteristisk for nucleoporins på NE. Udsættelse for siRNA’er rettet mod Tpr dramatisk reduceret punktformig Tpr mønster på NE (fig. 1B). Da Tpr blev effektivt nedreguleret under disse betingelser, var vi i stand til at analysere sin rolle i cellevækst og levedygtighed. Vi fandt, at behandling med Tpr siRNAs nedsat celleproliferation sammenlignet med mock siRNA-behandlede celler (fig. 1C). For at undersøge om dette skyldtes standset celleproliferation eller celledød, blev celler behandlet med Annexin-V og propidiumiodid at mærke kernerne i døde celler, og cellerne blev analyseret ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). Der sås ingen brutto forskel mellem de Tpr siRNA-behandlede celler og kontrollerne, hvilket indikerer, at væksten defekten ikke skyldtes apoptose (data ikke vist).

For yderligere at karakterisere virkningen af ​​Tpr knockdown på celleproliferation, analyserede vi cellecyklusfordeling af Tpr siRNA-behandlede celler og kontroller ved at måle deres DNA-indhold ved FACS. Vi bemærkede, at mock siRNA transfektion ikke påvirkede celle cyklus af HeLa-celler i forhold til ubehandlede celler. Derimod blev cellecyklus standset ved G0-G1-fasen i TPR Knockdown celler som vist i fig. 1D. Ca. 46% af den transficerede kontrol- og ikke-transficerede celler (2 dage efter transfektion) var i G0-G1-fasen af ​​cellecyklussen, mens 69% af TPR knockdown celler i G0-G1. Samtidig, ca. 37-38% af kontrolceller skred frem til S-fasen sammenlignet med kun 16% af TPR knockdown celler (fig. 1D). Den samme andel af celler blev set i G2-M-fasen under alle tre betingelser. Lignende resultater blev opnået med de to Tpr siRNA-sekvenser (fig. S1B).

Vi derefter udført en koloni-dannende assay som en uafhængig måling af proliferation defekt udløst af Tpr udtynding. En væsentlig nedgang (36%) i antallet af kolonier var synlige, når celler blev transficeret med Tpr siRNAs sammenlignet med mock-transficerede celler (fig. S1c). Disse resultater tyder på, at transfektion HeLa-celler med Tpr siRNA’er dramatisk bremset tumorceller spredning.

En mere omhyggelig undersøgelse af TPR siRNA-behandlede celler viste, at en brøkdel af disse havde en temmelig “alvorlig” fænotype i, at de havde udseendet af ældning med en groft ekspanderet cytoplasma. Dette førte os til at foretage yderligere undersøgelser fokuseret på netop denne reaktion. I forbigående RNAi analyser, tidsforløbet for effektiv udtømning af målet protein er ikke mere end fire dage, mens TPR Knockdown celler blev arresteret i G0-G1. I mellemtiden ikke-transficerede celler fortsætter med at dele sig og hurtigt overhale ikke-delende celler. Vi etablerede derfor betingelser, hvorunder cellerne blev udpladet ved lav densitet (5,10

4 til 10

5 pr brønd i en 6 brønd-plade) for at minimere virkningen af ​​tilgroning ikke-transficerede celler.

eksperimenter under disse betingelser viste, at en stor del af befolkningen begyndte at ændre morfologi 3-4 dage efter transfektion: celler blev udvidet og udfladet (figur 1E.). En vigtig test for senescens er SA-β-galactosidase-aktivitet målt ved sur pH [30] og 6 dage efter transfektion er de fleste af de forstørrede og udfladede celler blev β-gal positive og farvet blå (ca. 40%) i TPR Knockdown brønde , mens aldrende-lignende blå celler var sjældne (ca. 10%) i mock behandlede celle (fig. 1 F).

Tpr siRNA knockdown også induceret ældning i to andre tumorcellelinjer, U2OS, et menneske osteosarkom celle linje, og A375 humane melanomceller (fig. 1G-1I). BrdU-farvning viste, at SA-β-galactosidase-positive celler var BrdU negative (fig. 1G). Desuden blev Tpr siRNAs-behandlede U2OS celler og kontroller mærket med antistoffer specifikke for histon variant makro-H2A og HP1γ, to markører for heterochromatin konstitutiv af SAHF (senescens associeret heterochromatin foci), der først blev identificeret i ældede humane fibroblaster [31] , [32]. Mange makro-H2A og HP1γ positive og colocalizing foci blev observeret i U2OS aldrende celler kerner, mens de var fraværende i kontrol kerner. Lysere DAPI prikker indikerer heterochromatin colocalized med makro-H2A og HP1γ mærkning kan ses i fig. 1H.

Tpr udtømning inducerer nukleare akkumulering af p53

Som p53 vej ofte er involveret i at blokere tumor udvikling ved at udløse cellulær aldring eller apoptose som reaktion på stress, det var vigtigt at evaluere celle p53 status når Tpr er opbrugt.

Vi bruges første immuncytokemi til at analysere fordelingen af ​​p53 og samtidig undersøgte effekten af ​​Nup153 udtømning da dette har vist sig at udflytte Tpr fra kerneporen til den nukleare indre. Som vist i fig. 2A, p53 signal optrådte så intens punktformig mærkning i kerner af Tpr- og Nup153- udtømte celler. Intet signal blev observeret i kontrolceller. Til sammenligning, mens nedbrydningen af ​​Nup133, et stillads nucleoporin der spiller en vigtig rolle i den nukleare pore struktur og funktion, ikke inducerer nogen nukleare akkumulering af p53 [33], sådan akkumulering blev set i Tpr-udtømte U2OS celler (data ikke vist) . Disse resultater viser, Tpr udtømning eller mislocalization fører til nuklear akkumulering af p53.

2A. Analyse af p53 distribution i HeLa-celler ved immunofluorescens. Overpanel: HeLa-celler transficeredes med Tpr, Nup153 og mock siRNA’er som angivet til venstre; lavere panel: HeLa-celler transficeredes med Nup133 og mock siRNA’er. Cellerne blev fikseret på dag 2 efter -transfection og mærket med et anti-Tpr-antistof (øverste venstre paneler) eller anti-Nup133 (nederste venstre panel) og et anti-p53 (højre øverste og nederste paneler). 2B. HeLa-helcelle proteinlysater blev separeret ved SDS-PAGE og immunblottet med antistoffer specifikke for Tpr, p53, p21, p16 og tubulin som angivet i figuren. 2C. Helcelle proteinlysater af U2OS celler behandlet med Tpr, Tpr + p53 eller kontrol (mock) siRNA’er blev separeret ved SDS-PAGE og immunblottet med antistoffer specifikke for Tpr, p53, p21 og tubulin som angivet i figuren. 2D. Co-depletion af p53 og Tpr omvendt ældning induktion. Celler blev transficeret med mock, Tpr, p53 eller Tpr og p53 i kombinationer som angivet. Den endelige siRNA koncentration var 100 nM i hvert tilfælde og blev kompenseret med mock siRNA’er. Celler blev mærket i SA-β-galactosidase ved 6 dage efter transfektion og resultatet er givet som procentdelen af ​​SA-β-galactosidase-positive celler i hver af de tre uafhængige forsøg.

Cyclin -afhængige kinase inhibitor (CDK) p21 er forhøjet i mange stressende forhold og er transkriptionelt reguleret af p53. Vi undersøgte derfor konsekvenserne af Tpr udtynding på niveauet af p53 og p21. Niveauer af p53 og p21 var begge opreguleret i Tpr-depleterede Hela-celler (fig. 2B) og U2OS celler (fig. 2C). Hertil kommer, når evalueret i celleekstrakter hvor både Tpr og p53 blev udtømte, blev p21 ophobning ses at være lavere end med Tpr siRNA’er alene (fig. 2C). Denne observation indikerer, at en del af p21 akkumulering bemærket skyldes aktivering af p53. Niveauer af CDK-inhibitorer p16

INKA (Fig. 2B) og cyclinD1 blev ligeledes forhøjet i Tpr-udtømte HeLa-celler (data ikke vist).

Endelig, for formelt demonstrere rolle spilles af p53 i formidling induktion af degeneration i Tpr-udtømte celler, vi co-udtømte både Tpr og p53. Knocking ned både Tpr og p53 medført en væsentlig reversion af ældning fænotype som vurderet ved procentdelen af ​​SA-β-galactosidase-positive celler (fig. 2D).

Tpr udtømning forstyrrer NES-afhængige nuklear eksport

det er blevet foreslået, at de lave steady-state niveauer af p53 i normale celler, dvs. i fravær af cellulære stress, skyldes kontinuerlig Crm1-afhængige nuklear eksport [34] og efterfølgende cytosolisk nedbrydning af p53. Også, Tpr blev for nylig fundet at interagere med Crm1 i en trimere eksport kompleks [11]. Vi kan derfor hypotesen, at Tpr fører til p53 nukleare ophobning og stabilisering ved at blokere dens nukleare eksport.

For at teste denne hypotese vi først brugt konstruktionen pSTAT1-NES-GFP, som koder resterne 367-427 af menneskelig STAT1 som giver NES aktivitet [35], for at forhindre yderligere regulatoriske begivenheder forstyrrer hæmning af Crm1-afhængig nuklear eksport. Denne konstruktion blev co-transficeret med Tpr, Crm1 og kontrol siRNA’er at probe for NES-afhængige eksport. Som vist i fig. 3A, fordelingen af ​​GFP signal i levende celler 48 timer efter transfektion viste, at Crm1- og Tpr-depletion førte til væsentlig nuklear retention af NES-GFP konstruere henviser GFP forblev primært cytosoliske i mock-behandlede celler. Cellerne blev derefter permeabiliseret og mærket med Crm1 og TPR antistoffer til kontrol udtømning effektivitet (Fig. 3B).

3A-3B. Fordeling af GFP i celler cotransficeret med STAT1-NES-GFP og Tpr, Crm1 eller kontrol (mock) siRNAs. 3A: GFP fordeling blev analyseret i levende celler. Kerner blev mærket med Hoechst 33342. Målestok: 10 pm. 3b: Celler blev derefter permeabiliseret og mærket med antistoffer specifikke for Tpr og Crm1 og DAPI for DNA. Topplade: Tpr udtømning og kontrol; lavere panel: Crm1 udtynding og kontrol. Målestokken: 10 um. 3C-3D: Tpr udtømning forsinker nukleare eksport af NFKB. HeLa-celler blev transficeret med Tpr eller mock siRNA’er 2 dage før NFKB-induktion. Transficerede celler og kontrolceller blev derefter inkuberet med TNF 100 IU /ml i 40 min. TNF blev derefter fjernet fra mediet og cellerne blev enten fast eller opbevares i en anden 1h30 i frisk medium før fiksering. 3C: Kvantificering af NFKB signal: Alle billeder blev erhvervet på samme forstørrelse og eksponering og NFKB-signalet blev kvantificeret ved hjælp af samme areal i kerner og cytoplasma af celler under de forskellige eksperimentelle betingelser ved hjælp OpenLab3.1.2. Den cytosoliske signal blev plottet mod den nukleare signal og standardafvigelsen blev beregnet ved brug af Microsoft Excel. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen. Bemærk, at det cytosoliske til signalforhold nukleare er meget ens i kontrolceller før TNF behandling og 1h30 efter TNF fjernelse. Dette var som forventet og skyldes NFKB fuldt vender tilbage til cytoplasmaet på dette tidspunkt. 1h30 efter TNF fjernelse af cytosoliske til signal-forhold nukleare var omkring 25% lavere i TPR-udtømte celler end i kontrolgruppen celler. 3D: Immunfluorescerende mærkning af NFKB og Tpr 1h30 efter TNF fjernelse i Tpr-forarmet og kontrol celler. Faste celler blev mærket med en kanin-anti-NFicB antistof og anti-Tpr mAb 203-37.

En funktionel Crm1-afhængige NES er også nødvendig for IkappaBepsilon-medieret nuklear eksport, der styrer nucleo-cytoplasmatisk distribution og efterfølgende induktion nukleare clearance af NFKB /Rel proteiner [36]. For bedre at vurdere virkningen af ​​Tpr udtømning på NES-nukleare eksport af en endogen protein blev HeLa-celler først transficeret med Tpr eller mock siRNA’er to dage før NFKB induktion af TNF. Som vist i fig. 3C-3D, Tpr udtømning forsinket clearance af NFKB fra kernen i forhold til mock behandlede celler. Det er værd at bemærke, at NFKB ophobning i kernen efter TNF behandling ikke var anderledes i mock- og Tpr-siRNAs behandlede celler (fig. 3C).

Vi derefter forsøgt at afgøre, om Tpr udtynding påvirker Crm1 niveauer og fordeling eller omvendt. For at gøre dette, vi transficerede HeLa-celler med siRNA’er rettet mod Tpr og Crm1 eller mock-transficerede HeLa-celler, og 48 timer senere vi behandlet cellerne med Tpr- og Crm1-specifikke antistoffer. Immunfluorescerende analyse for Crm1 udtryk i kontrol og Crm1 knock-down celler viste reduceret niveauer i nukleoplasma og nuklear kappe af Crm1 siRNA-transficerede celler. Også Tpr ekspression blev væsentligt reduceret i Tpr siRNA’er-behandlede celler. Derimod havde Crm1 udtryk ikke ud til at blive påvirket af Tpr udtømning og Tpr blev ikke påvirket i Crm1 knock-down celler (Fig. S2A-B).

TPR nedbrydningen indvirkninger på udtryk og distribution af Nup153 og SENP2 på det nukleare kurv

for bedre at vurdere, hvilken rolle Tpr i nukleare pore organisation og funktion, vi undersøgte mere omhyggeligt forholdet mellem Tpr og Nup153 ved at måle deres niveauer i alt ekstrakter af celler transficeret med Tpr eller Nup153 siRNAs . Som vist ved Western blot-analyse af totale celleekstrakter (fig. 4A), celle behandling med Nup153 siRNAs førte til næsten fuldstændig forsvinden af ​​Nup153 og et markant fald i Tpr. Dette fald i TPR niveauerne var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser, at Tpr er mislocalized til den nukleare interiør i Nup153 knockdown celler [8]. Ligeledes behandling med Tpr siRNAs førte til et markant fald i Tpr og et stærkt reduceret Nup153 signal (fig. 4A). Dernæst bekræftede denne observation ved immunofluorescensanalyse i HeLa-celler behandlet med Tpr siRNAs og mærket med antistoffer rettet mod forskellige komponenter i kernemembranen. Mærkning med en anti-emerin antistoffet og Mab414 antistof, der genkender alle FG-repeat-holdige nucleoporins herunder Nup153 var ikke groft ændret (fig. 4B-4C). Derimod fandt vi, at mærkning med et specifikt anti-Nup153 antistof blev reduceret (fig. 4B-4C). Vi konkluderede fra disse observationer, at Tpr udtømning specifikt påvirker niveauet af Nup153 protein på NE.

4A. HeLa-celler transficeredes med mock, Tpr eller Nup153 siRNAs som angivet på toppen. Hele cellelysater blev analyseret 2 dage efter transfektion ved immunoblotting under anvendelse af antistoffer rettet mod Tpr, anti-FG gentagelse nucleoporin Mab414 at mærke Nup153 og Nup62 og anti-tubulin som ladningskontrol. 4B-4C. Nup153 ekspression er specifikt sænkes i Tpr-udtømte celler. HeLa-celler blev behandlet med TPR2 eller mock siRNA’er i 2 dage. 4C. Celler blev fikseret og mærket med et anti-Tpr-antistof og anti-emerin, anti-Mab414 eller anti-Nup153 antistoffer. Målestok: 15 um. 4D. Detaljer fra Mab414 og Nup153 mærkning. Målestok: 5 um. 4D. Analyse af SENP2 udtryk i nukleare ekstrakter af 293 celler behandlet med Tpr, SENP2 og mock siRNA’er ved western blot analyse. TRFII anvendes som lastning kontrol.

Da Tpr udtømning ændret Nup153 fordeling på det nukleare pore og at Nup153 bindsler SENP2 til NPC, vi hypotese, at Tpr kan påvirke SENP2 protein niveauer og funktion. For at teste denne hypotese, vi evaluerede effekten af ​​Tpr udtynding på SENP2. For det første, eftersom intet antistof er til rådighed til at observere endogene SENP2 i faste celler, vi analyserede SENP2 niveauer i nukleare ekstrakter af celler forarmet i Tpr, Nup153 eller SENP2 og i mock udtømte celler. Tpr udtømning i HeLa og 293 celler blev ledsaget af en reduktion i SENP2 til niveauer meget ligner dem observeret i SENP2-udtømte ekstrakter. Så at sammenligne de forskellige protein niveauer, vi overvåges Nup133 og TRF2 som en belastning kontrolsystem for nukleare ekstrakter (Fig. 4D og S3A). Udtømning af Nup153 tilsvarende inducerede en reduktion i SENP2 (data ikke vist).

Tpr udtømning påvirker SUMOylation

Konstateringen af, at Tpr udtømning påvirker SENP2 fik os til at behandle spørgsmålet om, hvorvidt Tpr udtømning kan forstyrre med SUMOylation for andre proteiner. For at undersøge ændringer i den overordnede SUMOylation af proteiner, blev HeLa-celler behandlet med Tpr, SENP2 og kontrol siRNA’er og nukleare og cytoplasmiske ekstrakter blev analyseret og sammenlignet ved western blotting under anvendelse af et anti-SUMO-1-antistof. Blots af kerneekstrakter viste, at SENP2 repression forårsagede en ophobning af højmolekylær SUMO-1 som blev forventet for et fald i SUMO-proteaseaktivitet. Ingen sådan akkumulering sås i mock-transficerede celler. Omvendt kunne Tpr-depleterede celler lavere samlet SUMOylation end sammenlignet siRNAs transfekterede celler (fig. 5A). Lignende resultater blev opnået i U2OS og 293-celler (Fig. S3B og data ikke vist). Derfor blev gratis SUMO-1 ses at ophobe sig i Tpr-udtømte celler (Fig. S3C).

5A-5B. Analyse af det samlede niveau for SUMOylation i celler transficeret med Tpr, Nup153, SENP2 og mock siRNA’er. 5A. Nukleare ekstrakter af siRNAs behandlede celler blev fremstillet og analyseret ved western blotting ved anvendelse af antistofferne som beskrevet på venstre side af figuren. RPB1 blev anvendt som indlæsning kontrol. 5B. Analyse af RanGAP1 SUMOylation. Cytoplasmatiske ekstrakter af Tpr, Nup153, SENP2 og mock siRNA’er-behandlede celler blev fremstillet og analyseret ved western blotting hjælp af en anti-RanGAP1 antistof, der genkender både SUMOylated og ikke-SUMOylated former af RanGAP1 og med tubulin som lastning kontrol. 5C: SUMO-1 siRNA behandling tilsidesætter Tpr depletion-induceret senescens i HeLa-celler. HeLa-celler blev transficeret med Tpr, SUMO-1, Tpr og SUMO-1 og mock siRNA’er. Efter 6 dage blev cellerne fikseret og farvet for SA-β-gal-aktivitet ved pH 6,0. Et repræsentativt billede af hver betingelse præsenteres. Målestok:. 15 pm

RanGAP1 (Ran-GTPase aktiverende enzym 1) er en overflod SUMOylated protein og de fleste anti-RanGAP1 antistoffer detekterer SUMO-1-modificeret form, og SUMO-fri RanGAP1, migrere omkring 80 kDa og 70 kDa. Vi undersøgte derfor effekten af ​​Tpr udtømning om fordelingen og størrelsen af ​​udtryk og SUMOylation af RanGAP1. Fraktionen af ​​SUMO-fri RanGAP1 detekteres af dette antistof blev forøget i cytosoliske ekstrakter af Tpr- og SENP2-siRNAs behandlede sammenlignet med mock behandlet HeLa-celler (fig. 5B) og i U2OS helcelleekstrakter (fig. S3B). I den fraktion kerneekstrakt, kun SUMO-1-RanGAP1 blev påvist og viste sig at blive forøget i Tpr- og SENP2-siRNA’er behandlede celler sammenlignet med spotte behandlede celler, når påvist med anti-SUMO-1 og anti-RanGAP1 antistoffer, med stigningen bliver mere udtalt i Tpr-behandlede celler end i SENP2-behandlede celler (fig. 5A).

Indtil videre rolle protein SUMOylation i ældning induktion er kun blevet undersøgt i normale fibroblaster. Vi har kontrolleret, at udtømning af SENP2 kunne fremkalde ældning i U2OS celler i vores eksperimentelle indstilling (fig. S3D). For bedre at vurdere bidraget af SUMO-1 modifikation vej til Tpr-induceret ældning fænotype i kræftceller, vi udføres parallelt RNAi knockdown af Tpr, SUMO-1 og kombineret SUMO-1 og Tpr. Efter 6 dage blev cellerne fikseret og analyseret for SA-β-galactosidase-farvning. Det totale celletal var dramatisk anderledes mellem alene Tpr tilstand og de to andre betingelser. Fyrre eller 50 felter blev talt for hver betingelse: antallet af felter indeholdende blå celler og procentdelen af ​​plads, der optages af udvidede blå celler blev evalueret (tabel 1). Faktisk for SUMO-1 udtømte celler, blev de fleste områder fyldt med celler ved mætning tæthed således, at celleproliferation ikke blev stoppet. Meget få blå celler blev observeret: 3 (i et felt) til omkring 20 blå celler eller så kunne opregnes i 7 områder kun, resten er negativ. I sidste ende resultaterne var så forskellige, at det var umuligt at inkludere dem i tabel 1. Som en kendsgerning der var mindre SA-β-galactosidase positive celler i SUMO-1 udtømte celler end i mock kontrol. De er beskrevet i tabel 1 viser resultater, at befolkningen som helhed blev ramt af Tpr udtømning mens celler med en aldrende-lignende fænotype blev langt mere spredt i Tpr plus SUMO-1 betingelse. Hertil kommer, med få undtagelser, de fleste blå celler ikke udviser en fuld senescent fænotype, da de ikke var fladtrykt, og SA-β-galactosidase farvning var svag (fig. 5C).

Diskussion

Vi har vist i denne undersøgelse, at depletterende Tpr er tilstrækkelig til at inducere en aldrende-lignende fænotype i tumorcellelinier. Den senescens fænotype kan forklares ved akkumuleringen af ​​flere vækstfremmende suppressive proteiner virker på mitogene signaltransduktion og cellecyklusregulering. To vigtige signalveje, p16INK4a-pRb og p14ARF-p53, er ansvarlige for udførelsen af ​​proliferativ anholdelse, der kendetegner ældning [37], [38]. Rb-p16 pathway er defekt i både HeLa og U2OS cellelinjer men p53 i U2OS og HeLa-celler og p16 i HeLa-celler er steget efter Tpr knockdown. P53 akkumuleres i kernen, og det gør p21 /CIP1, en nedstrøms effektor der er involveret i flere former for G1 checkpoint kontrol. Endvidere del af p21 /Cip1protein opregulering er afhængig af tilstedeværelsen af ​​p53

I normale celler, p53 er et mål af ubiquitinproteasomvejen:. De lave niveauer af p53 resultat fra kontinuerlig Mdm2- medieret nuklear eksport af p53 for cytosolisk nedbrydning. I HeLa-celler, nuklear eksport er også nødvendigt for nedbrydning af p53 medieret af det humane papillomavirus (HPV) 18 E6 protein [39]. Vi viser her, at Tpr udtynding fører til nuklear fastholdelse af et GFP reporter huser NES sekvens af STAT1 og forsinker post-induktion nukleare clearance af NFKB efter TNF fjernelse i HeLa-celler [36], to begivenheder afhængig af den Crm1 eksport faktor. Tpr blev for nylig fundet at interagere med Crm1 i nærvær af en NES peptid eller en NES-peptid plus RanGTP ligesom i en trimer eksport kompleks [11]. Selvom de molekylære detaljer i denne interaktion ikke er yderligere karakteriseret, fraværet af Tpr kan forvanske funktion Crm1 i nukleare eksport. Vi fandt, at Tpr knock-down svagt påvirker Crm1 niveauer i western blot eksperimenter, men ikke åbenbart påvirke Crm1 niveauer målt ved hjælp af specifikke antistoffer på faste celler. Det har imidlertid tidligere blevet rapporteret, at selv mindre nedregulering af Crm1 resulterer i prominente defekter i nuklear eksport [40]. Crm1 inhibering også reduceret celleproliferation og induceret dybe celle ændringer og apoptose (data ikke vist), som tidligere rapporteret [41]. Vi går derfor den hypotese, at en vigtigste konsekvens af Tpr udtynding er den nukleare ophobning og aktivering af p53 ved hæmning af dets nukleare eksport.

Til støtte for dette, leptomycin B (LMB), en Crm1 inhibitor, har været vist sig at reducere E6 evne til at nedbryde p53 i cervikale carcinomceller [39], [42] og årsag: (i) bibeholdelse af STAT1-NES konstruktion i kernen [34], [35], (ii) nuklear ophobning og aktivering af Tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. Tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol.