PLoS ONE: Paclitaxel Modstand og flercellede Sfæroide Formation induceres af kallikrein-Related Peptidase 4 i serøs ovariecancerceller i en Ascites Efterligning mikromiljø

Abstrakt

Høj tumor kallikrein-relaterede-peptidase 4 (KLK4) niveauer er forbundet med en dårlig resultat for kvinder med serøs epitelial ovariecancer (EOC), hvor der peritoneal formidling og kemoresistens er centrale begivenheder. For at bestemme den rolle, KLK4 i disse begivenheder, undersøgte vi KLK4-transficerede SKOV-3 og endogent KLK4 udtrykkende OVCA432 celler i 3-dimensional (3D) suspensionskultur for at efterligne ascites mikromiljø. KLK4-SKOV-3 celler dannede flercellede aggregater (MUB) som set i ascites, som gjorde SKOV-3 celler behandlet med aktiv KLK4. MCA-dannelse blev reduceret ved behandling med en KLK4 blokerende antistof eller den selektive aktive sted KLK4 solsikke trypsininhibitor (SFTI-FCQR). KLK4-MUB dannet større cancercelle foci i mesothelial cellemonolag end dem dannet af vektor og native SKOV-3-celler, hvilket antyder KLK4-MUB er særdeles invasive i det peritoneale mikromiljø. Et højt KLK4 udtrykkes ved ascites EOC celler sammenlignet med matchede primære tumorceller, yderligere støtte sin rolle i ascites mikromiljø. Interessant KLK4 transficerede SKOV-3-celler udtrykte høje niveauer af det KLK4 substrat, urokinase plasminogen aktivator (uPA), især i 3D-suspension, og høje niveauer af både KLK4 og uPA blev observeret i patientens celler taget fra ascites. Vigtigere, KLK4-MUB var paclitaxel modstandsdygtig hvilket blev vendt ved SFTI-FCQR og i mindre grad ved den almene serinproteaseinhibitor, Aprotinin, hvilket antyder, at ud over uPA, skal andre endnu uidentificerede substrater af KLK4 inddrages. Ikke desto mindre tyder disse data, at KLK4 hæmning, sammenholdt med paclitaxel, kan forbedre resultatet for kvinder med serøs epitelial kræft i æggestokkene og høje KLK4 niveauer i deres tumorer

Henvisning:. Dong Y, Stephens C, Walpole C, Swedberg JE, Boyle GM, Parsons PG, et al. (2013) Paclitaxel Modstand og flercellede Sfæroide Formation induceres af kallikrein-Related Peptidase 4 i serøs ovariecancerceller i en Ascites Efterligning mikromiljø. PLoS ONE 8 (2): e57056. doi: 10,1371 /journal.pone.0057056

Redaktør: Georgia Sotiropoulou, University of Patras, Grækenland

Modtaget: August 30, 2012; Accepteret: 16 Januar 2013; Publiceret: 25 feb 2013

Copyright: © 2013 Dong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Projektet er støttet af National Health og Medical Research Council (NHMRC) i Australien giver 242.220, 390.123 og 550.523; Kræftens Råd Queensland og Queensland University of Technology. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

serøs epitelial ovariecancer (EOC) tegner sig for 50% af ovariecancer [1], som er den hyppigste dødsårsag fra gynækologiske maligniteter [2]. Ca. 75% af kvinder med EOC er diagnosticeret, når tumorer har spredt i bughulen [3] og -70% af disse patienter akkumulerer ascites [4]. Adskiller sig fra andre solide tumorer, EOC metastaser opstår som tumorcellerne er udgydt fra det primære site og danne flercellede aggregater MCA’er () i 3-dimensionelle (3D) -suspension ascites mikromiljø, før klæber til peritoneal overflade og oprettelse sekundære tumorer i den underliggende ekstracellulære matrix (ECM) [5].

Overlevelse i ascites mikromiljø er afgørende for EOC-celler til at lykkes i peritoneal formidling. Selvom den underliggende mekanisme ikke er klar, er det kendt, at ascitisk EOC celler er biologisk forskellige fra deres modstykker i de faste matricer af primære og metastatiske steder [6]. F.eks celleadhæsionsproteiner E-cadherin [7] og α5 /av /p1 integriner [8] er højt udtrykt i ascites-afledte ovariecancerceller sammenlignet med dem fra primære eller metastatiske tumor-sites. Af note, serinproteasen, urokinase plasminogen aktivator (uPA) og dens receptor uPAR i EOC celler induceres af ascites [9], og ekspressionen af ​​uPA er forbundet med kemoresistens, progression og dårlig prognose hos kvinder med denne cancer [10], [11]. Disse undersøgelser indikerede, at tumormikromiljøet påvirker tydeligt EOC progression [12], [13], men effekten af ​​suspensionen per se, således efterligne ascites mikromiljø, om overlevelse EOC-celler og kemosensitivitet er ikke klart. Især inddragelsen af ​​andre serinproteaser forbliver stort set ukendt.

kallikrein-relaterede-peptidase (KLK) familie består af 15 serinpeptidaser, der har vist deres potentiale som biomarkører i menneskelige kræftformer [14], [15] , [16]. Disse peptidaser nedbryder ECM-proteiner og aktiverer vækstfaktorer og andre proteaser, såsom uPA /uPAR akse [17], [18], der spiller en rolle i human cancer progression [14], [15], [16]. I kræft i æggestokkene, er KLK4-KLK8, KLK10 og KLK14 opreguleret [14], [15], [19], [20], og vi tidligere rapporterede, at KLK4 og KLK7 var stærkt til udtryk i den mest dødbringende histotype, serøse EOCs [21] , [22]. For nylig viste vi, at høj

KLK7

niveauer er forbundet med dårlig prognose og kemoresistens hos kvinder med serøs EOC og at KLK7 inducerer MCA SKOV-3 celler, sandsynligvis gennem en integrin relaterede mekanisme [23]. I betragtning af, at høje KLK4 niveauer også rapporteres at være forbundet med dårlig prognose [24] og kemoresistens [25], i denne undersøgelse, vi havde til formål at afgøre, om en lignende, måske KLK-specifikke, funktionelle mekanisme foregik. Vi viser her, at, ligesom for KLK7, KLK4-overekspression i SKOV-3-celler fremmer MCA dannelse og paclitaxel resistens i 3D-suspensionskulturer der efterligner ascites mikromiljø, men i modsætning til det, der ses i KLK7-SKOV-3-celler vi fandt ingen association med integrin ekspression. Men KLK4 overekspression SKOV-3 celler viste opreguleret niveauer af uPA, især i 3D-suspension MUB. Vigtigere er det, KLK4 hæmning reduceret MCA komprimering og øget paclitaxel følsomhed i KLK4-MUB. Disse data antyder, at selv om flere KLKs overeksprimeres i EOC og kan tilsvarende forbundet med EOC progression, vil den underliggende virkningsmekanisme være relateret til den specifikke selektive enzym specificiteten af ​​hvert KLK peptidase.

Materialer og metoder

Materialer

Antistoffer anvendes omfatter dem mod V5 epitopmærket ved C-terminalen af ​​KLK4 (Invitrogen, Mount Waverley, VIC, Australien); en KLK4 katalytisk domæner antistof, KLK4 funktionelt blokerende antistof (R monoklonalt anti-uPA B-kæde (American Diagnostica, Stamford, CT, USA); GAPDH og et anti-muse-IgG (Sigma Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australien). Mus og kanin Alexa Fluor 488 sekundære antistoffer, Alexa Fluor 568 phalloidin og CellTracker

492 var fra Invitrogen. Frembringelsen af ​​aktiv rekombinant KLK4 [26], og den selektive aktive site KLK4 solsikke trypsin inhibitor (SFTI-FCQR) [27] er som offentliggjort. Site-directed mutagenese blev anvendt til at generere den katalytiske triade serin til alanin mutant-KLK4S207A (KLK4S /A) plasmid. Alle andre kemikalier var fra Sigma medmindre andet er angivet.

humane cellelinier, og Patient Serøse EOC Biopsier og ovarievæv RNA

SKOV-3 serøs EOC og LP9 peritoneale mesothelial cellelinjer var fra amerikansk Type Culture Collection og Coriell Cell Arkiver hhv. Den OVCA432 cellelinje blev etableret fra ascites opnået fra en EOC patient [28] og er en generøs gave fra Dr. Samuel Mok (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA). Oprindelsen af ​​patientens EOC-celler er beskrevet tidligere [21], [22]. De serøse EOC tissue RNA-prøver blev beskrevet tidligere [23]. Patient kliniske oplysninger blev indhentet fra Royal Brisbane og kvinders Hospital (Supplerende tabel S1). Etisk godkendelse blev opnået fra institutionelle etiske råd (Human Research Etik Udvalg af Queensland University of Technology (# 0800000213) og den kliniske og forskningsudvalget Statewide Services (# 229)); skriftligt samtykke blev opnået fra alle patienter.

RNA Extraction, Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)

Total RNA ekstraktion og syntese af cDNA er beskrevet tidligere [23]. Kvantitativ-RT-PCR blev udført i 40 cyklusser på en ABI7300 termisk cycler (Applied Biosystems, Mulgrave, VIC, Australien) ved hjælp af

KLK4

specifikke primere (K4Ex2qS, 5′-GGCACTGGTCATGGAAAACGA-3 ‘og K4Ex3qAS, 5’ -TCAAGACTGTGCAGGCCCAGCC-3 ‘) og SYBR grøn som pr fabrikantens anvisninger.

KLK4

udtryk blev normaliseret til

18S

(18SFor, 5’GATCCATTGGAGGGCAAGTCT-3 ‘og 18SRev, 5′-CCAAGATCCAACTACGAGCTTTTT-3’) ved hjælp af standardkurven metoden og RT-PCR blev udført som tidligere beskrevet [23].

Generering af stabile cellelinier

Generation og transfektion af plasmidet (pcDNA3.1 /V5-His, C-terminale V5-tag, Invitrogen), der udtrykker den vilde -typen præ-pro-KLK4 blev beskrevet tidligere [29]. Den katalytiske triade serin til alanin mutant-KLK4S207A (KLK4S /A) plasmid blev genereret ved steddirigeret mutagenese. Stabil monoklonalt KLK4-udtrykkende eller vektor kontrol celler blev udvalgt ved hjælp af G418 (Invitrogen), og 3 over-udtrykkende kloner, KLK4-1, KLK4-2 og KLK4-3, blev tilfældigt udvalgt til følgende

in vitro

funktionelle assays.

In vitro funktionelle assays

In vitro assays migration.

2 × 10

5 celler i RPMI-1640 indeholdende 0,1% BSA blev udsået i væv kultur indsætter med 8 um porer (BD Biosciences, Eight Mile Plains, QLD, Australien), og fik lov til at migrere til 10% FCS som kemoattraktanten i det nedre kammer i 24 timer (h). Antallet af migrerede celler blev kvantificeret ved hjælp af krystalviolet farvning læst ved 595 nm.

flercellede aggregat (MCA) /klumpformet dannelse og hæmning.

hængende slip-metoden [30] blev brugt til MCA dannelsen af ​​alle transficerede og medfødte celler med 5 x 10

3 celler /brønd i nærvær af 10% FCS RPMI-1640 (100 pi) oven på agarose-coatede plader (60 pi 0,5% agarose /serum- frie medier, vægt /volumen) og inkuberet ved 37 ° C. Når rekombinant aktiv KLK4 (rKLK4) enzym og katalytisk inaktivt mutant KLK4S /A (50 ng /ml) blev anvendt til at inducere MCA dannelsen af ​​SKOV-3-celler, var dette udført under serumfri betingelser. Serumfrit RPMI-1640 blev anvendt til MCA inhibering med KLK4 blokerende antistof ved en koncentration (10 ug /ml) til at fange alle aktivt enzym med en muse-IgG (10 pg /ml) kontrol. KLK4 aktive sted solsikke trypsininhibitor (SFTI-FCQR, 1 pM) [27] eller PBS-kontroller blev tilsat i 10% FCS RPMI-1640. Billeder blev taget med et Nikon-Eclipse TE2000-U digitalkamera (4 × mål) og V ++ software. Kompakte MUB blev defineret som dem med ≥30 um diameter. For at kvantificere procentdelen af ​​celler, der dannede kompakt MUB (≥30 um), alle synlige sfæroider ( 30 um, ≥30 um) blev talt ved alle tidspunkter og blev divideret med antallet på 4 timer, det tidspunkt valgt at lade cellerne afregne i brønden. Forskellen overordnede sfæroide numre og dem med 30 um diametre på dag 1, 4 og 7 fra 4 timer blev beregnet og blev betragtet som den procentdel af kompakte MUB dannet. Denne tilgang er baseret på en tidligere rapport fra Iwanicki et al [31].

In vitro mesothelial clearance assay.

LP9 mesotelceller (5000) blev udsået i 96-brønds plader og dyrket til -80% konfluens. MUB blev vasket i PBS, inkuberet i CellTracker

492 (4 uM), tilsat oven på mesothelial monolag (~4-6 sfæroider /brønd /200 pi) og dyrket ved 37 ° C. Ved 4 timer, 1, 2, 3 og 7 dage fra den indledende sfæroid udpladning blev billeder taget med et 10 x objektiv. For at kvantificere MCA clearance, diameteren af ​​de fluorescerende områder af MUB mærket med CellTracker

492 blev målt ved anvendelse InDesign software (Adobe, Adobe Systems Pty Ltd, Sydney, NSW, Australien). Målinger blev udført på 10 tilfældigt udvalgte MUB fra 3 separate forsøg for den gennemsnitlige diameter på dag 3 i sammenligning med den for det oprindelige område af klumpformet (4 h).

Celleoverlevelse efter cisplatin /paclitaxel behandling.

24 timer efter podning i ikke-overtrukne plader med 96 brønde (Nunc) som 2D-monolag, blev celler behandlet med cisplatin (0, 1, 5, 10, 50 uM) eller paclitaxel (0, 0,01, 0,1, 1 , 10 nM). I 3D-suspensionskulturer blev sfæroider dannet som ovenfor i 4 dage og derefter cisplatin eller paclitaxel blev tilsat. For KLK4 inhibering i 3D-suspension blev KLK4-1 eller OVCA432 celler resuspenderet i SFTI-FCQR (1 uM) indeholdende medier og podet og på dag 4 paclitaxel (0, 0,1, 1, 10, 50, 100 nM) var tilsat. WST-1 assays blev udført 96 timer efter behandling. Celleoverlevelse blev beregnet som procentdelen af ​​absorbansen af ​​ikke-behandlede celler.

Knockdown af KLK4 Expression

Knockdown af KLK4 ekspression blev udført som tidligere [26] beskrevne. Kort fortalt den mammale siRNA ekspressionsvektoren pSilencer 3.1-H1 puro (Ambion, Austin, TX, USA) blev anvendt til at reducere ekspression af KLK4. Kandidat KLK4 siRNA målsekvenser blev designet med Ambion siRNA-programmet og derefter justeret mod menneskelige genom database ved brug af BLAST algoritme til at fjerne dem med betydelig homologi til andre gener. To udvalgte sekvenser var 5′-GATCCATCCCTGGGGCTGGTTCCTTTCAAGAGAAGGAACCAGCCCCAGGGATTTTTTTGGAAA-3 ‘(psilK4Ex1) og 5′-GATCCAACGAATTGTTCTGCTCGGTTCAAGAGACCGAGC- AGAACAATTCGTTTTTTTTGGAAA-3’ (psilK4Ex2). Oligoerne blev syntetiseret (Sigma) og indsat i pSilencer 3.1-H1 puro vektor (Ambion) ifølge producentens instruktioner. SKOV-3 stabilt udtrykker KLK4 (KLK4-1 klon) -celler blev transficeret med KLK4 pSilencer 3.1-H1-konstruktioner eller den medfølgende pSilencer 3.1-H1 negativ kontrol under anvendelse af lipofectamin (Invitrogen). Efter 48 timer blev helcellelysat indsamlet fra transficerede celler og ekspression af KLK4 og uPA blev undersøgt ved Western blot-analyse.

Western Blotting

Helcellelysater fra celler dyrket som monolag i 3 dage blev opsamlet i en buffer indeholdende Complete protease inhibitor cocktail (1 ×, Roche Applied Sciences, Castle Hill, NSW, Australien), 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), NaCI (150 mM) og CHAPS (1%). Celler dyrket i 3D-kollagen I, 3D-Matrigel ™ (BD Biosciences) og 3D-suspension i 7 dage blev opsamlet i iskold PBS efterfulgt af den ovennævnte fremgangsmåde. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved microbicinchoninic syre assay (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, VIC, Australia). Cellelysater (20 ug) eller konditionerede medier (CM, 4 ug protein) blev separeret ved SDS-PAGE under reducerende betingelser, overført til nitrocellulosemembraner, og blokeret i Odyssey blokerende buffer (LI-COR® Biosciences, Lincoln, NE, USA) . Membraner blev inkuberet med primære antistoffer fortyndet i blokeringsbuffer natten over ved 4 ° C, vasket med Tris-bufret saltvand indeholdende 0,05% Tween-20 og derefter inkuberet med sekundære IRDye 680 eller 800 konjugeret mus eller kanin IgG (LI-COR® Biosciences) som passende. Billeder blev genereret og densitometri analyse blev udført ved hjælp af Odyssey og software (LI-COR® Biosciences).

konfokalmikroskopi

Celler dyrkes på sterile cover-sedler indtil 80% sammenflydende eller MUB indsamlet i eppendorfrør efter 7 dages dyrkning blev fikseret (4% vægt /volumen paraformaldehyd /PFA i PBS), permeabiliseret (0,5% v /v Triton X-100 i PBS) og blokeret (5% vægt /volumen okseserumalbumin /BSA i PBS). Inkubation med primære antistoffer mod KLK4 og E-cadherin (1/200 v /v i 1% BSA i PBS) blev ved 4 ° C natten over. Alexa Fluor 568 phalloidin og 4′-6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, Sigma) blev påført med sekundær Alexa Fluor 488 IgG som passende. For at opnå billeder af MCA clearance blev monolag mesoteliale LP9 celler podet i en 8-kammer slide (In vitro Technologies, Noble Park North, VIC, Australien), CellTracker

492 blev anvendt til KLK4-1 sphæroider før såning og 24 timer senere blev cellerne fikseret som ovenfor efterfulgt af farvning af Alexa Fluor 568 phalloidin og DAPI; MUB af vektor-1, SKOV-3 og OVCA432 blev farvet med E-cadherin som ovenfor. Billederne blev taget med et Leica-TCS SP5 konfokalmikroskop (63 × og 20 × immersionsolie objektiv til monolag celler og MUB henholdsvis) og tilhørende software. Z sektion stabling billeder blev genereret ved hjælp af den maksimale projektion software med skærmformat 2.

Statistisk analyse

t-test blev anvendt til funktionel analyse med

P

≤0.05 betragtes at være betydelig. For overlevelse analyse blev patienterne inddeles i to grupper med enten lav (n = 25) eller høj (n = 13)

KLK4

niveauer ved hjælp en median afskæring på

KLK4

kopital, efter normalisering til

18S,

af 0,0007 (interval 0,0000147 til ,0258). To forskellige endpoints, kræft tilbagefald og patient død blev anvendt til at beregne post-kirurgi progressionsfri overlevelse (PFS) og samlet overlevelse tid hhv. Kaplan-Meier-analyse blev anvendt til bestemmelse associering af

KLK4

niveau med PFS og samlet overlevelse gang af en log rank model. Analyserne blev udført ved hjælp af SPSS 18,0 til Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Resultater

KLK4 udtrykker SKOV-3 Celler er mindre migrerende men er kemoterapi som 2D monolag

Vi ønskede at bestemme virkningsmekanismen ligger til grund for dårlig prognose [24] og kemoresistens [25] tidligere er rapporteret til at være forbundet med høj

KLK4

niveauer i kræft i æggestokkene generelt. Således genererede vi begge stabile og forbigående transfektanter i SKOV-3 celler, der udtrykker lidt endogene KLK4 til funktionel analyse (Supplerende fig. S1A). Western blot-analyse bekræftede, at V5-tagged overudtrykkes KLK4 (33 kDa), et ekstracellulært serinprotease, udskilles i det konditionerede medier (CM) af både stabile og forbigående KLK4 transfektanter, men ikke vektor-only, mock-transficerede eller nativ SKOV-3-celler (fig. 1A, øverste panel). Interessant nok blev en 88 kDa proteinbånd ses i CM fra to af de høje KLK4-udtrykkende kloner (KLK4-1 og KLK4-2) og transient transfektion, men ikke den CM af en serin til alanin aktive site mutant-KLK4S207A ( KLK4S /A) konstruktion (fig. 1A, øverste panel), eller den helcellelysat (WCL) fra vildtype KLK4 eller mutante KLK4S /A-transfektanter (fig. 1A, nederst panel). Disse data indikerer, at både vildtype KLK4 og mutant KLK4S /A udskilles, men kun vildtype KLK4 er til stede som et aktivt enzym som vist ved 88 kDa store bånd som sandsynligvis KLK4 covalent bundet med en uidentificeret serpin. For at understøtte denne observation, at KLK4 aktiveres og danner komplekser med serum bæres proteiner eller inhibitorer, blev aktiv KLK4 (100 eller 500 nM) inkuberet med dyrkningsmedium (RPMI-1640), med eller uden 1% og 5% FCS i 2 og 18 h hhv. Western blot-analyse viser, at 88 kDa er kun til stede, når aktiv KLK4 blev inkuberet i RPMI-1640-medier med FCS men ikke når FCS var til stede (Supplerende fig. S1B). Niveauet af KLK4 ekspression i KLK4-3 klonen er sammenlignelig med den for endogent KLK4 udtrykkende OVCA432 celler mens KLK4-1 klon viser mere intense KLK4 proteinbånd (fig. 1B). Immunfluorescerende (IF) mikroskopi hjælp antistoffer mod V5-mærkede C-terminalen og N-terminale peptid af KLK4 [29] yderligere bekræftet protein over-ekspression i hver af KLK4 kloner, men ubetydelig udtryk i vektor kontrol, indfødte SKOV-3 celler eller KLK4-1 IgG kontrol (fig. 1C, supplerende fig. S1c).

A. Western blotting med anti-V5-antistof viser KLK4 ekspression i de konditionerede medier (CM) og helcellelysat (WCL) fra stabile KLK4 transfektanter (KLK4-1, KLK4-2 og KLK-3; bane 1-3), vektor (Vec -1, Vec-2 og Vec-3; bane 4-6) og nativ SKOV-3 (bane 7) celler, og forbigående udtrykt vildtype KLK4, mutant-KLK4S207A (KLK4S /A), vektor- og mock transfektanter (bane 8- 11); GAPDH blev anvendt som en loading kontrol for WCL. B. Western blotting med anti-KLK4 antistof viser relative niveauer af KLK4 protein i WCL af KLK4-1, KLK4-3 kloner og OVCA432, og 10 ng af rekombinant (r) KLK4 protein. C. IF mikroskopi med anti-V5 /KLK4-N-terminale antistoffer (grøn) og phalloidin (rød) i KLK4-1, Vec-1-kloner, nativt SKOV-3 eller negativ kontrol (IgG). Scale bar, 20 pm. D. Transwell migration assays med KLK4-1, KLK4-2, KLK4-3, Vec-1, Vec-2 og indfødte Skov-3 celler; n = 3, gennemsnit ± SEM, * P. 0,05

Forrige

in vitro

undersøgelser har vist, at KLK serinproteaser kløve collagener I og IV, fibronektin, vitronectin og laminin [ ,,,0],32], [33], som er komponenter af den peritoneale membran [34], og vi rapporterede, at KLK7 overekspression forøget adhæsion til fibronectin og vitronectin [23]. I denne undersøgelse, men vi kunne ikke se nogen forskel mellem de KLK4-transficerede og kontrol celler tilslutning til disse ECM komponenter eller spredning (data ikke vist). På den anden side viste KLK4 udtrykkende kloner mindre transwell migration i forhold til vektor /native kontrolceller (* P 0,05 eller ** P. 0,01, figur 1D). I 2D-monolagskulturer, hjælp koncentrationer (cisplatin 0-50 uM, paclitaxel 0-100 uM) inden for det område, der anvendes til patientbehandling (cisplatin 3-50 uM, paclitaxel 3-20 uM) [35], KLK4-transficeret Skov- 3 celler var mere resistente over for cisplatin end vektor /native kontrol celler (* P. 0,05, supplerende fig S2, venstre panel), selv om kun en tendens til paclitaxel modstand blev set for KLK4-transfekterede celler (Supplerende fig S2, højre panel. ). Disse data tyder på, at eventuelle ændringer induceret af KLK4 overekspression var relativt subtile og at cisplatin snarere end paclitaxel modstand, som set med KLK7 transficerede SKOV-3-celler, ville være mere klinisk relevant fænotype.

KLK4-udtrykkende SKOV-3 celler danner Kompakte MUB, der Spred på mesothelial cellemonolag

på grund af rollen som homotypiske celleadhæsion for EOC celle overlevelse i 3D-suspension mikromiljø ascites [36] og vores tidligere fund, at KLK7 kunne fremkalde sfæroid dannelse [23] sammenlignede vi evnen hos KLK4 transficerede celler og kontrolceller til dannelse MCA’er /sfæroider. Med 1, 4 og 7 dage efter podning, to af tre KLK4 kloner genereret store kompakte MUB med flere celler, mens de nedre KLK4-udtrykkende KLK4-3 celler dannet lidt mindre kompakt MUB, med vektor knapper og native SKOV-3-celler danner små og spredte sfæroider i 10% FCS indeholdende medier (fig. 2A). Til støtte for denne konklusion, den endogene KLK4 udtrykker OVCA432 celler dannet mere kompakte MUB end SKOV-3 celler, der havde lidt KLK4. Kvantitativ analyse viste, at KLK4-udtrykkende celler dannede mere kompakte MUB end vektor kontrolceller på dag 1, 4 (** P 0,01) og 7 (*** P. 0,001, figur 2B), som gjorde det endogene KLK4 udtrykkende OVCA432 celler sammenlignet med SKOV-3-celler (* P 0,05, figur 2B.). Som vi har vist, at nogle aktive KLK4 er bundet til ukendte bindende proteiner eller serpiner i serum indeholdende medier (Supplerende fig. S1B) tyder KLK4 enzymatisk aktivitet kunne inhiberes i nærværelse af serum, vi brugte serumfri betingelser for at teste tilsætning af aktive KLK4. Under disse betingelser, de KLK4-1 celler dannede mindre kompakt MUB (fig. 2C) end dem, der ses i 10% FCS (fig. 2A). Tilsætning af rekombinant aktiv KLK4 (rKLK4, 50 ng /ml) inducerede indfødte SKOV-3 celler til at danne MUB mere ligner den, der er observeret for den KLK4-1 klon mens mutant KLK4S /A (katalytisk inaktiv, 50 ng /ml) behandlet SKOV -3-celler havde et lignende udseende til den for SKOV-3-celler behandlet med PBS som en kontrol (P. 0,05, figur 2C), hvilket bekræfter involveringen af ​​KLK4 aktivitet i SKOV-3 celleaggregering. Kvantitativ analyse viste, at aktiv rKLK4 behandlet Skov-3 celler dannede kompakte sfæroider med samme hastighed til KLK4-1 celler, og begge var større end dem behandlet med ikke-aktiv mutant KLK4S /A (* P 0,01), som var lidt større, at der ses for SKOV-3 kontrol på dag 4 og 7, (** P 0,01, figur 2D.). Disse data bekræftede rolle KLK4 peptidase i MCA-dannelse, men også foreslået en mulig ikke-katalytisk virkning af KLK4 i denne proces.

A. MCA /sfæroid dannelse udført i 10% FCS indeholdende medier ved 4 timer, dag 1, 4 og 7, med repræsentative billeder af KLK4-1, KLK4-2, KLK4-3, Vec-1, Vec-2-kloner, native Skov- 3 og endogen KLK4 udtrykkende OVCA432 celler. B. Kvantitativ analyse af procentdelen af ​​4 h (0 tidspunkt), der dannede kompakt MUB (≥30 um) efter 1, 4 og 7d fra de 3 KLK4 kloner tilsammen, 2 vektor-kloner kombineret, indfødte SKOV-3 og OVCA432 celler. C. MCA formation under serumfri betingelser ved at KLK4-1 klon og indfødte SKOV-3 celler behandlet med 50 ng /ml aktiv rekombinant (r) KLK4or mutant-KLK4S207A (KLK4S /A) og PBS-kontrol på dag 1, 4 og 7. D. Kvantitativ analyse af kompakt MCA dannelsen af ​​KLK4-1, SKOV-3 behandlet med rKLK4, KLK4S /a og PBS som kontrol over 1, 4 og 7d. Til paneler A og C, målestokke 200 um; for B og D, blev eksperimentet gentaget 3 gange med tre eksemplarer; middel ± SEM; * P 0,05; ** P 0,01; og *** P. 0,001

Vi derefter undersøgte invasiv af KLK4-MUB når tilføjet på peritoneale mesothelial cellemonolag. Bright-feltet og fluorescerende (CellTracker

492) billeder viser, at den kompakte KLK4-1 MCA levet op til den levende LP9 mesothelial monolag og efterhånden dannede en omfattende foran sprede kræftceller over 3 dage (fig. 3A, øverste venstre panel) og op til 7 dage (data ikke vist) bekræfter deres levedygtighed og vækst på den mesothelial monolag. De MUB dannet af vektor-1 kontrolceller også spredt over mesothelial cellemonolaget om end i mindre grad (fig. 3A, øverst til højre panel). Størrelsen af ​​foci genereres af endogent KLK4 udtrykkende OVCA432 MUB var de samme som for den transficerede KLK4-1 MUB (fig. 3A, nederste panel). Kvantitativ analyse viste, at diameteren af ​​de områder af fluorescerende KLK4 MCA clearance ( 6 gange) var større end den for Vector-1 klon (3,5 gange) på dag 3 i forhold til deres klonale kontrol ved 4 h (** P 0,01, fig. 3B). Tilsvarende diameter KLK4 endogent udtrykkende OVCA432 MCA clearance på dag 3 (7 gange sammenlignet med 4 timer), sammenlignelig med den for KLK4-1 SKOV-3-klonen, mens det native SKOV-3 MCA clearance (3,2 gange sammenlignet med 4 h) var sammenlignelig med Vector transficerede SKOV-3-celler (fig. 3B). Konfokal billeder viser, at CellTracker

492 farves KLK4-1, og endogent KLK4 udtrykker OVCA432 MUB farvet med E-cadherin voksede til mesothelial monolag (fig. 3C, top og midterste paneler) med flere Z stabling billeder bekræfter clearance af mesothelial monolag af de MUB til bunden af ​​brønden (fig. 3C, toppaneler). Vektor-1 og SKOV-3 MUB kan også invadere ind mesothelial monolag men dannede mindre invaderende foci følge af færre celleantal (fig. 3C, bundpaneler). Disse data tyder på, at overlevelse mekanisme cellulær aggregering induceres ved KLK4 i 3D-suspension ascites efterligner mikromiljø, og at disse KLK4 udtrykker sphæroider vil have en øget sprede kapacitet til mesothelial lag af bughinden.

A. Bright-field og fluorescens (CellTracker

492) billeder viser KLK4-1, Vector-1, SKOV-3 og OVCA432 MCA (4 timer og dag 3) clearance af mesothelial monolag. Diskontinuerte linjer angiver omkredsen af ​​spredningen MUB. B. Kvantitativ analyse viser den gennemsnitlige diameter af 10 MUB fra 3 separate forsøg til ovennævnte cellelinier ved 4 timer og dag 3 henholdsvis; middelværdi ± SE, n = 3, ** P 0,01. C. IF mikroskopi billeder viser mesothelial monolag clearance af MUB dannet af KLK4-1 mærket med CellTracker

492, Vector-1, OVCA432 og Skov-3 celler farvet med en E-cadherin antistof (grøn); både MUB og mesothelial LP9 celler blev farvet med Phalloidin for F-actin (Alexa Mel 568, rød) og DAPI for kerner (blå) henholdsvis; diskontinuerlige linier viser positionerne af flere Z-profiler, der er vist som højre og bundpaneler. For panel A og C, skala barer, 50 um.

KLK4 Hæmning Øget Paclitaxel Følsomhed

Selvom KLK4-transficeret SKOV-3 celler var mere resistente over for cisplatin end vektor /native kontrol celler (Supplerende fig. S2, venstre panel), blev der ikke forskel i cisplatin lydhørhed set mellem KLK4 og vektor /native kontrol celler i 3D suspension (data ikke vist). I modsætning hertil, selv om kun en tendens til paclitaxel modstand blev set for KLK4-transficerede celler i 2D-monolag (Supplerende fig. S2, højre panel), KLK4-MUB i 3D-suspension var klart mere resistente over for paclitaxel end vektor /native celler ( ** P 0,01, figur 4A).. Især komprimering af KLK4-1 MUB blev reduceret ved tilsætning af en KLK4 blokerende antistof ved en koncentration (10 ug /ml) at indfange alle aktive enzym eller den selektive aktive sted KLK4 solsikke trypsininhibitor (SFTI-FCQR), i forhold til deres passende kontroller (fig. 4B, venstre og midterste paneler). Tilsvarende komprimering af endogent udtrykkende OVCA432 MUB blev reduceret ved tilsætning SFTI-FCQR (fig. 4B, højre panel). Desuden, selvom 1 uM SFTI-FCQR alene ikke reducerede proliferation (data ikke vist), det reducerede signifikant KLK4-1 og OVCA432 MCA overlevelse på kombineret behandling med paclitaxel (** P 0,01, figur 4C.). Interessant nok generelle serinproteaseinhibitor, aprotinin, delvist reduceret komprimering af MUB dannet af KLK4-1 og OVCA432 celler (Fig 4B, nedre panel.) Og øget deres følsomhed over for paclitaxel (* P. 0,05, figur 4C), omend i mindre grad end SFTI-FCQR. Disse data understregede, at KLK4-MUB er resistente over for paclitaxel og reduceret MCA komprimering af KLK4 blokade øget følsomhed over for dette stof.

WST-1-analysen viser celle overlevelse KLK4-1, KLK4-2, KLK4-3, Vec-1, Vec-2-kloner og indfødte SKOV-3 MUB efter paclitaxel (A) behandling i 3D-suspension. B. Venstre panel, repræsentative billeder af KLK4-1 MUB på dag 4 med mus IgG og et funktionelt KLK4 blokerende antistof, PBS som kontrol og KLK4 selektiv inhibitor SFTI-FCQR (SFTI) som angivet. Right panel, repræsentative billeder af OVCA432 MUB på dag 4 med PBS som en kontrol og KLK4 selektiv inhibitor SFTI-FCQR (SFTI) eller aprotinin som angivet. Scale barer, 200 um. C. Cell overlevelse bestemmes af WST-1 assay efter behandling med paclitaxel (Pac) på 3D-suspension dyrket KLK4-1 klon og OVCA432 celler +/- 1 pM SFTI eller 5 pM aprotinin (Aprot). Forsøg i panel A og C blev gentaget 3 gange i tre eksemplarer, søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM.