PLoS ONE: Cirkulerende Methyleret XAF1 DNA Indikerer dårlig prognose for gastrisk Cancer

Abstrakt

Baggrund

Methyleret DNA i væsker kan være en egnet biomarkør for kræftpatienter.

XAF1

har vist sig at være hyppigt nedreguleret i human gastrisk cancer (GC). Her har vi undersøgt, om

XAF1

methylering i GC kunne være en nyttig biomarkør.

Metoder

Real-time RT-PCR blev anvendt til at påvise

XAF1

mRNA udtryk; immunhistokemi og western blot blev anvendt til at undersøge XAF1 proteinekspression i GC væv (n = 202) og deres tilsvarende para-kræft histologiske normale væv (PCHNTs). Real-time methylering specifik-PCR blev anvendt til at undersøge

XAF1

promotor methylering i samme panel af GC væv, deres PCHNTs og sera.

Resultater

Vi bekræftede hyppige

XAF1

nedregulering i både mRNA og protein niveauer i GC væv sammenlignet med normale kontroller og PCHNTs.

XAF1

hypermethylering blev dokumenteret i 83,2% (168/202) af GC væv og 27,2% (55/202) af PCHNTs, mens ingen methylering blev påvist i de 88 normale kontroller. Den methylering niveau i GC væv var signifikant højere end i PCHNTs (

s

0,05). Den hypermethylering af

XAF1

signifikant korreleret med nedregulering af

XAF1

i GC væv i både mRNA og protein niveauer (

s

0,001 hver). Desuden har vi påvist høj frekvens af

XAF1

methylering (69,8%, 141 ud af 202) i sera DNA’er fra de samme patienter, mens seraene DNA’er fra 88 ikke-tumor kontroller var negative for

XAF1

methylering.

XAF1

methylering i både GC væv og i sera kunne være en god biomarkør til diagnosticering af GC (AUC = 0,85 for væv og AUC = 0,91 for sera) og signifikant korreleret med dårligere prognose (

s

0,001). Hertil kommer, efter-kirurgi negativ-til-positive overgang

XAF1

methylering i sera stærkt forbundet med tumor tilbagefald.

Konklusioner

1) Dysfunktion af

XAF1

er hyppig og reguleres gennem

XAF1

promotor hypermethylering; 2) Påvisning af cirkulerende methyleres

XAF1

DNA i serum kan være en nyttig biomarkør i diagnose, vurdere patientens udfald (prognose og recidiv) for GC patienter

Henvisning:. Ling ZQ, Lv P Lu XX, Yu JL, Han J, Ying LS, et al. (2013) cirkulerende Methyleret

XAF1

DNA Indikerer dårlig prognose for mavekræft. PLoS ONE 8 (6): e67195. doi: 10,1371 /journal.pone.0067195

Redaktør: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: Marts 12, 2013; Accepteret: 16 maj 2013; Udgivet: 27 juni 2013

Copyright: © 2013 Ling et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Science and Technology General Project i Zhejiang-provinsen (nr. 2009C33143), og dels af en bevilling fra Backbone Talent Zhejiang Provincial Medicin og Hygiejne Platform programmer (nr. 2011RCA009). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de mest almindelige cancertyper i Kina, med en høj forekomst og dødelighed, ca. tegner sig for 10% af alle malignanser [1]. Gastrisk tumorigenese er en kompliceret, flertrinsproces, der involverer ændringer af mange gener [2]. Aberrant promotor methylering er en af ​​de vigtigste mekanismer til at lukke munden nogle tumorsuppressorgener og tumor gener og spiller meget vigtige roller i patogenesen og progression i humane cancere [3], [4] – [6], herunder mavecancer [7] , [8]. I mellemtiden, akkumulere data kraftigt antydet, at DNA-methylering kunne være nyttigt og kraftfuld biomarkør i evaluering kræftrisiko [5], [7], tidlig diagnosticering [7], at forudsige patienternes prognose [7], [8], og evaluering af følsomhed over for kemoterapeutiske lægemidler [9]. Vores seneste undersøgelse og andre undersøgelser viste, at påvisning af cirkulerende methyleret DNA i blodet er en potent og praktisk tilgang til kræftpatienter [7], [10], [11].

X-bundet inhibitor af apoptose (

XIAP

) associeret faktor 1 (

XAF1

) er en ny negativ regulator af

XIAP

, der vender XIAP rolle beskyttelse på tumorceller [12] – [14]. Tabet af

XAF1

ekspression vil gøre tumorceller resistens over for apoptose og fremme tumorcelleoverlevelse [14] – [17]. Dysfunktion af

XAF1

er blevet rapporteret i flere humane kræftformer sandsynligvis gennem promotor methylering [15] – [19], hvilket tyder på dens betydning i tumorigenese. I human mavekræft,

XAF1

er blevet rapporteret til at være ofte og markant ned-reguleret, og denne nedregulering af

XAF1

sandsynligvis gennem DNA hypermethylering af specifikke CpG sites [15], [16 ], [18]. Men ingen Rapporten er tilgængelig om

XAF1

methylering i blodet og dets potentialitet som biomarkør. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi

XAF1

promotor-methylering i parrede væv og serumprøver fra et stort panel af patienter med mavekræft, og evalueres cirkulerende methyleres

XAF1

som en potentiel biomarkør for mavekræft .

Materiale og metoder

Etik Statement

De-identificerede humane prøver og sera væv blev opnået fra Zhejiang-provinsen Menneskelig vævsprøve Bank. Brugen af ​​eksemplarer blev godkendt af Institutional Review Board på Zhejiang-provinsen Cancer Hospital. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient i overensstemmelse med kravene i vores institutions bestyrelse etik. 88 ikke-kræft frivillige forudsat skriftligt informeret samtykke. En del af prøverne var fra Zhejiang-provinsen Folkeparti Hospital og de første Folkets Hospital of Chunan County. Den Institutional Review Board om medicinsk etik i Zhejiang-provinsen Folkets Hospital og de første Folkets Hospital of Chunan County godkendt metoden til prøveudtagning, herunder skriftligt informeret samtykke fra alle patienter.

vævsprøve

Forbundne tumor og para-kræft histologiske normale væv (PCHNT) prøver blev indsamlet på tidspunktet for kirurgi fra 202 patienter med primær gastrisk adenocarcinom på Zhejiang-provinsen Cancer Hospital, Zhejiang-provinsen Folkeparti Hospital og de første Folkets Hospital of Chunan County fra januar 2008 og til december 2009. PCHNT blev vurderet mikroskopisk for tilstedeværelsen af ​​normale celler og fravær af dysplastiske celler. Ingen af ​​disse sager havde gennemgået nogen medicinsk behandling før operation. Demografiske, kliniske og histopatologiske parametre for disse sager blev vist i tabel 1. vækstmønster af tumorceller blev bestemt i henhold til Ming klassificering [20]. Alle rekrutterede patienter var blevet fulgt op med jævne mellemrum, indtil forfaldsdatoen. Antral slimhinde biopsi prøver fra 88 ikke-kræft frivillige ved gastroskopi blev tilfældigt indsamlet som kontrol inden for den samme periode, herunder 54 mænd og 34 kvinder, med en gennemsnitsalder på 52,9 år. Blandt disse frivillige, blev 48 patienter diagnosticeret med kronisk ikke-atrofisk gastritis. I mellemtiden blev parrede serumprøver indsamlet før operation eller endoskopi.

Analyse af Helicobacter Pylori (

H. Pylori

) Infektion

Biopsier blev opnået fra alle patienter, der havde endoskopisk undersøgelse.

H

.

pylori

status blev bestemt ved hurtig Urease test og Giemsa farvning metoder [21], [22]. Det blev betragtet som

H

.

pylori

infektion, når begge tests var positive, og prøverne med enkelt positivt blev udelukket til statistisk analyse [22].

Real-time RT-PCR

mRNA-ekspression af

XAF1

blev analyseret ved real-time RT-PCR [23]. Totale RNA’er blev ekstraheret under anvendelse af Trizol (Gibco). I alt 3 ug totale RNA’er blev underkastet revers transkription ved hjælp af M-MLV revers transkriptase (Promega). Glyceraldehyd phosphat dehydrogenase (

GAPDH

) blev valgt som den interne reference. Sekvenserne af

XAF1

primere var som følger: (F) 5′-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 ‘, (R) 5’GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3’.

GAPDH

primersekvenser var som følger: (F) 5′-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 ‘, (R) 5′-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3’. De 2

-ΔΔCt metode blev anvendt til at beregne relative ændringer i genekspression.

immunhistokemisk farvning

Ekspressionen af ​​XAF1 protein blev bestemt ved immunohistokemisk analyse med XAF1 monoklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology ). Immunohistokemisk farvning for XAF1 blev udført ved anvendelse af repræsentative paraffinindlejrede prøver fra de 202 GC patienter. Efter afparaffinering, antigen-genvinding i 0,01 M citratpuffer, og inaktivering af endogen peroxidaseaktivitet i 3% H

2O

2 /methanol, inkuberede vi objektglassene med antistof i XAF1 ved 4 ° C natten over, og immunhistokemisk farvning, efter en standard avidinbiotin-peroxidase-kompleks teknik, blev udført under anvendelse 3,3′-diaminobenzidin (DAB) som kromogen. Kerner blev modfarvet med hematoxylin. Den immunhistokemisk farvning score (ISS) er bestemt af tre uafhængige patologer kombinerer farvning hyppigheden og intensiteten som følger [24], [25]: ingen farvning er scoret som 0, 1~10% af cellerne farvet scoret som en, 11~50% som 2, 51~80% som 3, og 81~100% som 4. farvningsintensitet er vurderet på en skala fra 0 til 3, hvor 0, negativ; 1, svag; 2, moderat; og 3, stærk. Når der er multifokal immunoreaktivitet og der er betydelige forskelle i farvning intensiteter mellem foci blev gennemsnittet af de mindst intense og mest intense farvning registreret. De rå data blev omdannet til ISS ved at multiplicere frekvensen score og farvningsintensitet score. Teoretisk set kunne ISS går fra 0 til 12. En ISS af 9~12 blev anset stærk immunreaktivitet, 5~8 blev anset moderat, 1~4 blev anset svag, og 0 blev scoret som negativ. Sektioner, hvor farvningen ikke kunne godt karakteriseret blev anset tvetydig.

Western blot analyse

Parret tumor og PCHNT eksemplarer af 20 sager blev tilfældigt udvalgt fra 202 mavecancerpatienter til western blot analyse. Totalt protein blev ekstraheret og derefter kvantificeret ved anvendelse af Lowry-metoden [26]. Western blot-analyse blev udført ved anvendelse af anti-XAF1 monoklonale antistoffer (Santa Cruz, CA) i overensstemmelse foregående rapport [6]. β-tubulin blev serveret som en intern kontrol.

DNA Extraction, Bisulfite Ændring og Real-time Methylering Specific-PCR (MSP)

Serial 5 mm sektioner, der indeholdt karcinom og ikke-neoplastiske væv blev monteret på ikke-coatede objektglas og tørret ved 37 ° C natten over. Efter afparaffinering og farvning med hæmatoxylin og eosin (H

XAF1

(UF) 5′-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 ‘, (UR) 5′-CTCCTACCCTTAAAACC CACAAT-3’ [23]. Humant genomisk DNA (NEB) behandles ved SSSI methyltransferase in vitro blev anvendt som en positiv kontrol. En perifert blod DNA fra en rask person blev anvendt som en negativ kontrol. Procentdelen af ​​denatureret DNA i prøverne blev beregnet i henhold til de referencer som tidligere beskrevet [27], [28]. Methyleret DNA-indekset blev scoret efter den procentdel af DNA methylering; 0, 20%; 1, 20% -40%; 2, 40% -60%; 3, 60% -80%; og 4, 80%. Indekset score på 0 betragtes som DNA unmethylation og scores 1-4 blev anset hypermethyleret henholdsvis [7], [27]. De 20% afskåret tærskel for DNA hypermethylering var baseret på kontrol normale prøver og intern kvalitetskontrol opnået i realtid MSP analyse.

Cell Kultur og narkotika behandling

Humane gastriske kræft cellelinjer (AGS og KATO-III) blev dyrket i RPMI1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO

2. Dyrkede celler blev behandlet med 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-CdR) (Sigma-Aldrich) i en endelig koncentration på 1,0 pmol /l. Trichostatin A (TSA) (Sigma-Aldrich) i en endelig koncentration på 20 ng /ml blev administreret efter 5-aza behandling eller alene i 24 timer. Celler blev indsamlet og udsat for DNA, RNA og protein oprensning og efterfølgende analyser.

Statistisk analyse

SPSS 17.0 statistisk software blev vedtaget til dataanalyse. Counting data sammenligninger mellem grupper blev udsat for

χ

2 test og Fishers eksakte test. Overlevelse analyse blev computered ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden og væsentlige niveauer blev vurderet ved hjælp af log-rank test. En univariate analyse med Cox regression model blev anvendt til at bestemme identificerede prognostiske faktorer, og multivariat analyse med Cox regression model blev anvendt til at udforske kombinerede virkninger. For alle statistiske analyser,

s

værdier. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikans

Resultater

Nedregulering af

XAF1

i Primary Gastric Tumorer

for at undersøge

XAF1

genekspression profil, vi undersøgte mRNA udtryk for

XAF1

i 88 ikke-kræft frivillige og 202 primære mavekræft væv og deres tilsvarende PCHNTs. Som vist i figur 1A,

XAF1

udtryk blev signifikant reduceret i gastrisk kræft prøver i forhold til, at der i normale kontroller og PCHNTs (

s

0,001). Men der var ingen signifikant forskel i

XAF1

udtryk i PCHNTs sammenlignet med kontroller ikke-kræft.

A,

XAF1

mRNA udtryk niveau i GC væv, PCHNTs ( para-kræft histologisk normalt væv) og ikke-kræft kontroller blev bestemt ved real-time RT-PCR og blev normaliseret til

GAPDH

. B-F, XAF1 proteinekspression blev nedreguleret i gastrisk cancer væv. B, en repræsentant positiv, høj ekspression af XAF1 protein i en PCHNT væv; C, Fraværende af XAF1 udtryk i et dårligt differentieret GC; oprindelig forstørrelse x 200. D, en oversigt over XAF1 immunhistokemisk farvning resulterer i 202 gastrisk kræft. E, Repræsentant western blot analyse af XAF1 udtryk i mavekræft og tilsvarende PCHNT prøver med forskellige

XAF1

methylering niveauer. PCHNT væv i sag 59 (XAF1 methylering score: 0); GC væv i sag 59 (methylerede

XAF1

score: 4); PCHNT væv i sag 20 (methylerede score: 0); GC væv i sag 20 (methylerede

XAF1

score: 1). Beta-tubulin blev anvendt som intern kontrol. F, Oversigt over de vestlige blotting resultater fra 20 GC’ers og tilsvarende PCHNTs præsenteres som relative bands tæthed normaliseret til beta-tubulin af de samme prøver.

Desuden

XAF1

udtryk var signifikant lavere i fremskredne tumorer (fase III /IV) end at der i fase tumorer tidligt (fase i /II) (

s

0,0001, Figur S1A), og var signifikant lavere i dårligt differentierede tumorer end i godt /moderat differentierede tumorer (

p

0,0001, Figur S1B)

for at kontrollere XAF1 proteinniveauet i gastrisk kræft væv, vi udførte immunhistokemisk analyse i de 202 mavekræft væv og deres tilsvarende PCHNTs.. Nuklear XAF1 udtryk var konstant til stede i den normale gastriske epitel viser høje immunoreaktive scores. Den XAF1 proteinekspression blev påvist i højt niveau i 97,5% (197/202) af PCHNTs (figur 1B). Imidlertid blev høj ekspression af XAF1 protein kun fundet i 16,8% (34/202) af gastrisk cancer væv; flertal af gastrisk cancer væv var fraværende eller ved et lavt niveau af XAF1 protein (figur 1C). De immunhistokemiske resultater opsummeres i tabel 1. Den immunhistokemisk farvning score i mavekræft væv var signifikant lavere end i PCHNTs eller normale kontroller (

s

0,0001, Figur 1D). Tabet af XAF1 protein signifikant korreleret med

H. pylori

infektion, tumorstørrelse, histologisk differentiering, lymfe invasion, venøs invasion, invasiv dybde, lymfeknudemetastase, fjernmetastaser og klinisk fase (tabel 1) (alle

s

0,05)

.

De immunhistokemiske resultater af 20 mavekræft væv blev yderligere bekræftet ved hjælp af western blot analyse. De repræsentative Western blotting resultater i to tilfælde blev vist i figur 1E. Den relative mængde XAF1 proteinekspression blev normaliseret til β-tubulin af de samme prøver. Det gennemsnitlige XAF1 proteinniveau i 20 mavekræft væv var signifikant lavere end i PCHNTs (

s

0,05). (Figur 1F)

Promoter Hypermethylering af

XAF1

i Primary Gastric tumorer

for at undersøge de molekylære mekanismer for

XAF1

tavshed i gastrisk kræft, vi anvendt en real-time MSP-teknologi til at studere status DNA methylering af

XAF1

promotoren. Hyppigheden af ​​

XAF1

hypermethylering i gastrisk kræft væv, svarende PCHNTs og ikke-kræft kontroller var 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) og 5,7% (5/88), hhv. Den hypermethylering hyppigheden af ​​

XAF1

i kræft er betydeligt højere end i PCHNTs og ikke-kræft kontroller (alle

s

0,0001, Figur 2)

data viser. hyppigheden af ​​

XAF1

hypermethylering (DNA methylering niveau ≥20%) i hver gruppe.

af note, methylerede status

XAF1

signifikant korreleret med nogle klinisk-patologiske parametre i mavekræft, såsom lymfeknude metastaser, T-scenen,

H

.

pylori

infektion, osv (alle

s

0,05, tabel 2). Ingen signifikant sammenhæng mellem hypermethylering af

XAF1

og køn, alder ved diagnose, tumor websted og fjernmetastaser blev dokumenteret (alle

s

0,05). (Tabel 2)

XAF1

Promotor Hypermethylering er forbundet med dets Transcriptional Silencing i Gastric Cancer Cells

for at undersøge forholdet mellem

XAF1

methylering og

XAF1

udtryk, vi sammenlignede

XAF1

methylering niveau med

XAF1

mRNA niveau og protein niveauer bestemmes enten ved immunhistokemisk analyse (figur 3A) eller western blotting (figur 3B) af Spearman korrelationsanalyse. Som vist i figur 3A-, XAF1 proteinekspression (bestemt ved immunhistokemisk analyse) i 202 GC væv var nært korreleret med

XAF1

mRNA-niveau [lg (T /N)] (bestemt ved RT-PCR) (

γ

= 0,841,

s

0,0001). Mere vigtigt,

XAF1

methylering niveau var signifikant associeret med

XAF1

mRNA-niveau (

γ

= – 0,846,

s

0,0001) og XAF1 protein niveau (

γ

= -0,969,

s

0,0001). Lignende resultater blev opnået, når der analyseres korrelationen af ​​

XAF1

promotor methylering og XAF1 proteinekspression bestemt ved western blot-analyse (figur 3B). Disse resultater stærkt tiltalt som

XAF1

udtryk reguleres af

XAF1

promotor methylering.

A, Korrelation af

XAF1

methylering med

XAF1

mRNA-niveauet bestemmes ved RT-PCR-analyse og XAF1 proteinekspression bestemt ved immunohistokemisk analyse i 202 mavekræft væv. B, Korrelation af

XAF1

methylering med

XAF1

mRNA-niveau bestemt ved RT-PCR-analyse og XAF1 proteinekspression bestemt ved western blotting-analyse i 20 frosne gastrisk cancer væv. I både A og B,

XAF1

methylering scores omvendt korreleret med

XAF1

genekspression i både mRNA og protein niveauer.

5-Aza-CdR Administration Gendanner udtryk af

XAF1

for yderligere at bekræfte den epigenetiske regulering af

XAF1

udtryk, AGS og KATO-III celler blev behandlet med 5-Aza-CdR og /eller TSA .

XAF1

mRNA ekspression blev reaktiveret i begge gastrisk cancer cellelinjer, ledsaget af demethylering af

XAF1

promotor (figur 4), hvilket indikerer, at

XAF1

er transkriptionelt til tavshed i disse celler ved DNA hypermethylering. Interessant, TSA behandling alene var effektiv til at genskabe

XAF1

udtryk i AGS og KATO-III uden væsentlig ændring af

XAF1

methylering niveau, hvilket antyder, at histon modifikationer kan også være involveret i regulering

XAF1

udtryk. Indgift af TSA følgende 5-Aza-CdR havde en additiv effekt i at genoprette genekspression med et yderligere fald i methylering på

XAF1

. Disse resultater er i overensstemmelse med de seneste undersøgelser, der foreslog, at TSA kan have en demethylering effekt i et gen-specifik måde [5]. Western blot analyse under anvendelse af AGS celler, som en model, bekræftede opreguleringen af ​​XAF1 proteiner efter 5-aza-CdR og 5-aza-CdR /TSA behandlinger (figur 4).

To mavekræft cellelinier (AGS og KATO-III) blev behandlet med 1,0 pmol /L 5-aza-CdR i 72 timer og /eller 100 nM TSA i 24 timer. De methylering niveauer blev bestemt ved real-time MSP. Vi udførte real-time RT-PCR-analyse i triplikat for hvert cDNA prøve og anvendes medianværdier i tre eksperimenter. Den relative

XAF1

mRNA-ekspression normolized til

GAPDH

af de samme prøver ved hjælp af formlen 2

-ΔΔCT. Resultaterne blev multipliceret med 100 for en bedre visualisering. Procentdelen af ​​

XAF1

DNA methylering vises på venstre side; mens den relative mRNA ekspressionen af ​​

er XAF1

vises i højre side. B: Ekspression af XAF1 på proteinniveauet efter 5-aza-CdR og TSA behandlinger. Western blot analyse af AGS-celler efter behandling med DMSO (kontrol), 5-aza-CdR eller 5-aza-CdR /TSA i 72 timer demonstrerer opregulering af XAF1 proteiner i behandlede celler sammenlignet med kontrol (DMSO). Beta-tubulin er vist som en belastning kontrol.

Påvisning af Cirkulerende

XAF1

Methylering

Vi har registreret høj frekvens af

XAF1

methylering i primær gastrisk cancer (83,2%), hvilket antyder, at det kan være en god biomarkør hvis

XAF1

methylering kunne være påviselige i serum. Derfor undersøgte vi

XAF1

methylering i de matchede serum DNA fra 202 GC patienterne.

XAF1

methylering blev påvist i 141 (69,8%) serum DNA fra 202 mavecancerpatienter (figur 5). I modsætning hertil

XAF1

methylering blev ikke påvist i serum DNA fra de 88 kontroller ikke-kræft.

Dernæst bekræftede vi sammenhæng i

XAF1

methylering mellem tumorvæv og tilsvarende serum. I 168 sager, der viste

XAF1

methylering i tumorvæv, 141 vises

XAF1

methylering i deres parrede serum, der giver en sammenhæng i 83,9% mellem dem. Og i 34 gastrisk kræftpatienter de uden

XAF1

methylering i deres mavekræft væv, blev der ikke methylering findes i alle serum DNA (Figur S2).

XAF1

Methylering som biomarkør til diagnosticering af mavekræft

for at vurdere værdien af ​​

XAF1

methylering som biomarkør i at diagnosticere GC, vi plottet receiver opererer karakteristik (ROC) kurver og beregnet areal under kurven (AUC) værdier ved hjælp af DNA-methylering data fra både GC væv og sera. Både ROC-analyser af

XAF1

methylering i væv og sera viste betydelig diskriminerende kapacitet (figur 6); AUC værdi af væv

XAF1

methylering var 0,849 (95% konfidensinterval, 0,806-0,892;

s

0,0001), AUC værdi af serum

AXF1

methylering var 0,909 (95% konfidensinterval, ,875-,942;

s

0,0001).

Receiver opererer analyse karakteristik (ROC) kurve blev anvendt til at vurdere muligheden for

XAF1

methylering i gastrisk cancer væv eller i serum som biomarkør at diagnosticere gastrisk cancer. For

XAF1

methylering i gastrisk kræft væv, et område under ROC-kurven (AUC) er 0,849 (95% konfidensinterval, 0,806-0,892;

P

0,0001). For

XAF1

methylering i serum, AUC er 0,909 (95% konfidensinterval, 0,875-0,942;

P

0,0001).

Desuden ligesom

XAF1

status methylering i mavekræft væv og sera signifikant korreleret med lymfeknude metastaser, T-stadie, klinisk fase, og andre klinisk-patologiske parametre (alle

s

0,05, tabel 2 ).

XAF1

methylering korreleret med Prognose for mavekræft Patienter

Den betydelige korrelation af

XAF1

methylering med mange klinisk-patologiske parametre (tabel 2 ) foreslog, at den kan associere med prognosen for mavecancerpatienter. Indtil datoen for opfølgning grund, 113 af 168 patienter med

XAF1

hypermethylering i mavekræft væv gik hurtig sygdomsprogression eller død. Den Median sygdomsfri overlevelse (DFS) var kun 23,4 måneder. I modsætning hertil de 34 patienter uden

XAF1

hypermethylering i deres mavekræft væv, kun 5 patienter begyndte at se sort, og Median DFS var 39,6 måneder. Kaplan-Meier analyse viste, at patienter med

XAF1

hypermethylering i deres gastric cancer væv udviste en oplagt dårligere overlevelse end at uden

XAF1

hypermethylering (

s

0,0001) (Figur 7A). Tilsvarende Kaplan-Meier analyse viste, at patienter med positiv serum

XAF1

methylering havde væsentligt lavere DFS end i patienter uden serum

XAF1

methylering (

s

0,0001 ) (Figur 7B), hvilket indikerer, at

XAF1

promotor methylering i serum var en ugunstig prædiktor for mavens kræftpatienter.

Kumulativ sygdomsfri overlevelse (Cum DFS) kurver er plottet agains

t XAF1

DNA methylering niveau i gastrisk cancer væv (A) og i sera (B). I både A og B, blev Kaplan-Meier analyse brugt og

P.

0,0001 henholdsvis

Cox regressionsanalyse afslørede, at

XAF1

methylering i sera er en uafhængig faktor på patienternes overlevelse: patienter med

XAF1

methylering havde dårligere prognose (

s

0,0001, Hazard ratio, 5,710; 95% CI, 3.474~9.383). Desuden kunne TNM etaper og alder ved diagnosen betragtes som den indvirkende faktor af prognosen hos gastrisk kræft, når effekten af ​​

XAF1

methylering blev elimineret. Desuden cirkulerende methylerede

XAF1

i blodet havde en større indvirkning på prognosen end i TNM etaper (tabel S1).

Positiv Overgang af Cirkulerende

XAF1

Methylering forudsiger Tumor Gentagelse og dårlig prognose

Blandt de 202 patienter, der blev evalueret for præoperativ cirkulerer

XAF1

methylering, 72 patienter modtaget opfølgende undersøgelser af cirkulerende

XAF1

methylering 2~5 gange med intervaller på 1~6 måneder efter operationen. Blandt 12 tilbagevendende patienter, 10 patienter viste negativ-til-positive overgang i

XAF1

methylering status i deres sera, de to andre viste altid positiv for

XAF1

methylering, tyder på, at overvågningen af ​​

XAF1

methylering i serum kan være en god markør for at forudsige tumor tilbagefald (tabel 3).

diskussion

XAF1 Hotel (

XIAP

associeret faktor 1) er en roman

XIAP

bindende protein, som kunne forstyrre kombination af

XIAP

med caspaser, ophæver beskyttelsen på tumorceller og resultater i tumorceller apoptose [12 ] – [14]. Den anti-apoptose funktion af

XIAP

bestemmes ved forholdet mellem ekspressionsniveauer af

XIAP

mod

XAF1

[15]. Reduceret udtryk eller stilhed

XAF1

er en hyppig begivenhed i humane tumorer [16] – [19]. I den foreliggende undersøgelse, vi først bekræftet, at

XAF1

genekspression var signifikant nedreguleret i både mRNA-niveau og protein niveau i et stort panel af primære mavekræft væv, og nedregulering af

XAF1

udtryk var signifikant associeret med tumor stadier, metastaser og så videre, implicerer tab af

XAF1

funktion i tumor progression. Dette er i overensstemmelse med andre forskningsrapporter [17] – [19]. At udforske de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for

XAF1

stilhed, vi undersøgte

XAF1

promotor methylering i et stort panel mavekræft væv (

n

= 202) og normale kontroller (

n

= 88) ved hjælp af en real-time MSP-teknologi. Vi har registreret en høj frekvens (83,2%) af DNA hypermethylering af

XAF1

i mavekræft væv. DNA hypermethylering af

XAF1

betydelig korreleret med nedregulering af

XAF1

i både mRNA og protein niveauer i gastrisk kræft væv (Figur 3). Desuden 5-Aza-CdR behandling signifikant restaureret

XAF1

til udtryk i

XAF1

tavshed gastrisk cancer cellelinjer (figur 4). Disse data tyder på, at hyppig nedregulering af

XAF1

i gastriske kræftceller reguleres af sin promotor hypermethylering. Interessant, behandling af gastriske kræftceller med TSA, et histondeacetylaseinhibitor også restaureret

XAF1

udtryk, alene eller kombineret med 5-Aza-CdR behandling, hvilket indikerer, at histon modifikation også kan være involveret i

XAF1

regulering

DNA-methylering, kan anvendes som en potentiel tumor biomarkør i forskellige humane cancere [3] – [11], [23]. Tilstedeværelsen af ​​cellefrie DNA cirkulerer i perifert blod er blevet beskrevet hos patienter med maligne processer og aktiv frigivelse af tumor-DNA i kredsløbet er blevet rapporteret [29] – [31].