PLoS ONE: Stromal Expression of Heat-Shock Protein 27 er forbundet med Worse Klinisk Outcome i patienter med tarmkræft lungemetastaser

Abstrakt

Baggrund

lungemetastaser er almindelige hos patienter med primær kolorektal cancer (CRC). Heat-shock protein 27 (Hsp27) opreguleres i aktiverede fibroblaster under sårheling og systemisk forhøjet i forskellige sygdomme. Cancerassocierede fibroblaster (CAF) menes også at spille en rolle som prognostiske og prædiktive markører i forskellige maligniteter, herunder CRC. Overraskende har ekspressionen af ​​Hsp27 aldrig blevet vurderet i CAF. Derfor sigte vi at undersøge ekspressionsniveauet af Hsp27 i CAF og dets kliniske betydning hos patienter med CRC lungemetastaser.

Metoder

FFPE vævsprøver fra 51 lungemetastaser (PMS) og 33 parrede primære tumorer blev vurderet for alpha-SMA, CD31, Hsp27 og vimentin ekspression ved immunhistokemi og korreleret med klinisk-patologiske variabler. 25 levermetastaser tjente som kontrolgruppe. Desuden serumprøver (n = 10) før og efter pulmonal metastasectomy blev vurderet til at cirkulere phospho-Hsp27 og Hsp27 samlede ved ELISA.

Resultater

Stromal ekspression af Hsp27 blev observeret i alle PM og viste stærk korrelation med alpha-SMA (

P

0,001) og vimentin (

P

0,001). Stærk stromale Hsp27 var forbundet med højere mikrokar tæthed i primær CRC og PM. Desuden blev høj stromale Hsp27 og αSMA udtryk forbundet med nedsat gentagelse overlevelse efter pulmonal metastasectomy (

P

= 0,018 og

P

= 0,008, henholdsvis) og samlet overlevelse (

P

= 0,031 og

P

= 0,017, henholdsvis). Serum niveauer af fos- og total Hsp27 faldt efter metastasectomy til niveauer kan sammenlignes med raske kontrolpersoner.

Konklusioner

Heri vi beskriver for første gang, at Hsp27 er højt udtrykt i tumor stroma af CRC. Stromale α-SMA og Hsp27 udtryk korrelerer med det kliniske resultat efter pulmonal metastasectomy. Desuden kan serum Hsp27 udgøre en fremtidig markør for metastatisk sygdom i CRC

Henvisning:. Schweiger T, Nikolowsky C, Starlinger P, Traxler D, Zimmermann M, Birner P, et al. (2015) Stromal Ekspression af Heat-Shock Protein 27 er forbundet med Worse Klinisk Outcome i patienter med tyktarmskræft lungemetastaser. PLoS ONE 10 (3): e0120724. doi: 10,1371 /journal.pone.0120724

Academic Redaktør: Gabriele Multhoff, Technische Universitaet Muenchen, TYSKLAND

Modtaget: August 17, 2014 Accepteret: 26 januar 2015; Udgivet: 20 Marts 2015

Copyright: © 2015 Schweiger et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Christian Doppler Laboratorium for Hjerte- og thorax Diagnose og Regeneration og ved det medicinske universitet i Wien. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Denne undersøgelse blev støttet af Christian Doppler Laboratorium for Hjerte- og thorax Diagnose og Regeneration og af Medical University of Vienna. Foreløbige resultater med et begrænset antal patienter er blevet præsenteret på de årlige møder i det østrigske samfund af Hjerte-lunge kirurgi og den østrigske Society of Surgery. HJA erklærer konkurrerende finansielle interesser (patent nummer WO 2010/000820 (serum Hsp27 for KOL diagnose) og WO 2012/080303 (serum Hsp27 for NSCLC diagnose)). Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. De andre forfattere erklærer nogen interessekonflikter.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er, efter lungekræft, den næsthyppigste årsag til kræft dødsfald i Europa [1]. Mere end en femtedel af patienterne med CRC stede med metastaser allerede på tidspunktet for diagnose af den primære cancer og samme andel vil udvikle metastaser i løbet af sygdom [1, 2]. Lungerne er den anden mest almindelige sted for fjernmetastaser, hvilket gør lungemetastaser (PM) en væsentlig bidragyder til høj dødelighed hos CRC.

Udover cancerceller selv, en tumor omfatter stromaceller. Samspillet af stromale og kræftceller menes at være en væsentlig faktor for tumor adfærd og respons på behandling [3, 4]. Cellulære bestanddele i stromaet er fibroblaster, endotelceller immunceller og pericytter [5]. Cancerassocierede fibroblaster (CAF), og især aktiverede fibroblaster, spiller en vigtig rolle i det tumor-stroma netværk, der ligner dermale fibroblaster i sårheling. Dette bidrog til beskrivelsen af ​​tumorer som “sår, der ikke heler” af Dvorak

et al

. i slutningen af ​​80’erne [6]. CAF bidrage til forskellige tumorfremmende egenskaber som ekstra-cellulær matrix omsætning, tumorvækst, angiogenese og metastase [7, 8]. På grund af ekspressionen af ​​α-glatmuskelactin (α-SMA), aktiveres CAF beskrives ofte som myofibroblaster. De har også vist sig at være positive for fibroblast-aktiverede protein-α /seprase, Palladin og vimentin [9-12]. For nylig er der gjort en indsats for at karakterisere “signatur” af disse fibroblaster ved proteom og genekspression profilering [13, 14].

I forbindelse med godartede sygdomme, sårheling og keloiddannelse det er velkendt, at aktiverede fibroblaster udtrykker høje niveauer af varme-shock protein 27 (Hsp27), som er afgørende for fibroblast-adhæsion, sammentrækningsevne og motilitet [15-17]. TGF-beta-induceret p38-MAPK-vejen er nøglen regulator i induktionen af ​​Hsp27 i glatte muskelceller og myofibroblaster [18, 19]. Når syntetiseret, to hovedfunktioner Hsp27 er kritiske i sårheling proces: fremme myofibroblastdifferentiering motilitet og angiogenese. Hsp27 er involveret i stabiliseringen af ​​actinfilamenter og SNEGLEN, en inducer af epitelial-mesenkymale overgang. Begge mekanismer bidrager til induktion af myofibroblastisk fænotype [20, 21]. En anden funktion af Hsp27 udføres på en parakrin måde er at øge angiogenese. Det blev påvist, at ekstracellulær Hsp27 fører til NFKB-aktivering og efterfølgende ekspression af proangiogene faktorer VEGF og interleukin-8 (IL-8) i endotelceller [22]. Sammen med andre, kunne vores gruppe viser, at et overekspression af Hsp27 er stærkt knyttet til flere godartede og ondartede sygdomme i lungen forbundet med fibroblast aktivering, herunder emfysem /kronisk obstruktiv lungesygdom (COPD), idiopatisk lungefibrose og ikke-småcellet cancer [21, 23-26].

i betragtning af at aktiverede fibroblaster spiller en vigtig rolle i progressionen af ​​malign sygdom samt i forskellige ikke-maligne sygdomme i lungen, vi havde til formål at undersøge forekomsten af Hsp27 positive tumor stroma i CRC lungemetastaser og tilsvarende primære tumorer. Desuden søgte vi at beskrive konsekvenserne for det kliniske resultat efter metastasectomy og tilstedeværelsen af ​​cellulære og udskilles Hsp27 hos disse patienter.

Materialer og metoder

studiepopulation

Fra april 2009 til november 2013 alle på hinanden følgende tilfælde af pulmonal metastasectomy fra primær CRC og passende vævsprøver blev inkluderet i denne undersøgelse. Patienterne fik diagnostisk oparbejdning herunder thorax og abdominal computertomografi (CT). Hvis patienter havde gennemgået pulmonal metastasectomy før, blev eksemplar af den første metastasectomy også undersøgt og datoen for den første metastasectomy blev brugt til resultat beregning. Lunge metastase overlevelse (LMFS) blev defineret som tiden mellem diagnose af den primære tumor og diagnose af metastatisk spredning til lungen. R0 resektion blev opnået hos alle patienter. 33 patienter, der kunne opnås enheder af den tilsvarende primære tumor. Opfølgende undersøgelser blev udført i 3 til 6 måneders intervaller. Gentagelse overlevelse (RFS) blev defineret som perioden fra første pulmonal metastasectomy til tegn på tilbagevendende sygdom på ethvert websted verificeret af CT-scanninger. I 10 på hinanden følgende tilfælde, serumprøver opnået før metastasectomy og under follow-up var til rådighed. Opfølgende serumprøver blev indsamlet 3 til 6 måneder efter operationen. Derudover Statusrelæer serumprøver fra alders-, køns- og rygning matchede raske frivillige blev indsamlet. Alle patienter gav deres skriftlige informerede samtykke forud for opsamlingen og deltagelse blod. En undersøgelse kohorte af 25 på hinanden følgende patienter med resektion CRC levermetastaser tjente som ekstra kontrolgruppe. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i det medicinske universitet i Wien (EK 91/2006, EK1194 /2011 og EK1044 /2012) og blev udført i overensstemmelse med erklæringen fra Helsinki. Den aktuelle undersøgelse kohorte er baseret på tidligere offentliggjorte værker af vores gruppe. [27, 28]

Immunhistokemi og immunofluorescens

immunhistokemisk farvning blev udført i overensstemmelse med en standard-protokol. Kort tid, blev formalin-fikseret, paraffinindlejrede vævsprøver skæres i 4-um tykke sektioner og afparaffineres. Heat-medieret antigen-genvinding blev udført. Endogen peroxidaseaktivitet blev standset med 0,3% hydrogenperoxid. Snit blev inkuberet med det egnede primære antistof i 1 time ved stuetemperatur. For immunhistokemi, som sekundært trin blev polymer- baseret ImmPRESS kit (Vector Laboratories, Burlingame, California) anvendt ifølge producentens protokol. 3,3′-diaminobenzidin (DAB) anvendtes som substrat (Vector Laboratories, Burlingame, Californien). Endelig blev snittene modfarvet med hematoxylin. Vimentin-farvning blev udført i et Ventana ES Immunostainer System (Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ, USA). For immunfluorescens blev passende fluorescerende sekundære antistoffer anvendes og cellekerner blev modfarvet med DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Som negative kontroller blev det primære antistof udeladt. Positive kontroller blev vævsprøver med kendt forekomst af det respektive målprotein. En detaljeret liste over antistoffer og fortyndinger er tilvejebragt som supplerende oplysninger (S1 tabel).

Scoring af farvede tumorceller.

Immunhistokemi farvning score (IHC score) blev beregnet som tidligere beskrevet [29] . Procentdelen af ​​positive tumorceller kunne nå værdier mellem 0 og 100%, og blev multipliceret med farvningsintensitet (0 til 3). Således kunne IHC score går fra 0 til 300. To blindede observatører bedømt farvning. I tilfælde af, at de to ratings afveg, blev dias diskuteret og revurderet. Den kontinuerte IHC score blev dikotomiseret ved at anvende medianen score på metastaser eller primære tumorer som afskæringsværdi.

Scoring af farvede stromaceller.

Snittene blev scoret semikvantitativt som tidligere beskrevet [10 ]. Kort fortalt blev objektglassene screenet ved lav forstørrelse og vurderet for deres farvningsintensitet i stromacellerne i tumoren center. Den stromale farvning blev vurderet som grad 0 (negativ, 1% positive stromale celler), klasse 1+ (lave, 1-10% positive stromale celler), klasse 2+ (mellemliggende, 10-50% positive stromale celler ) og grad 3+ (stærke, 50% positive stromale celler) med to blindede observatører. I tilfælde af, at de to ratings afveg, blev dias diskuteret, revurderet og enighed blev nået på alle dias.

Bestemmelse af mikrokardannelse tæthed.

mikrokar densitet (MVD) blev målt ved hjælp af metoden “hotspot”, som offentliggjort andetsteds [30]. Kort fortalt blev objektglassene screenet ved lav forstørrelse til at identificere området med det største antal CD31-positive mikrokar ( “hotspot”). MVD blev bestemt ved at tælle alle mikrokar ved 200x forstørrelse (svarende til 0,95 mm

2). Middelværdier blev beregnet ud fra to uafhængigt optalte densiteter. I tilfælde af stærk inter-observatør uoverensstemmelse blev dias revurderes.

enzymmaerket assay (ELISA)

Serumprøver blev vurderet af kommercielt tilgængelige humane Hsp27, phospho-Hsp27 og Interleukin 8 ELISA kits (alle F median /afskåret 30). Der var ingen sammenhæng mellem tumor og stromale Hsp27 udtryk i pulmonale metastaser (Chi square test;

P

= 0,237). 33 tilsvarende primære tumorer var til rådighed. Den stromale Hsp27 ekspression i primære tumorer 0 (0%), 6 (18%), 15 (46%) og 12 (36%) blev bedømt som 0, 1+, 2+ og 3+ hhv. Bestemmelse af Hsp27 farvning i tumorcellerne i den primære tumorvæv, 14 (42%) af tilfældene blev scoret som Hsp27 positive og 19 (58%) som lav /negativ (IHC score interval 5-100; median /afskåret 70 ).

stromacellers fibroblaster blev yderligere identificeret ved vimentin farvning. (DAB substrat, samme tumor eksemplar pr række, 200x forstørrelse).

Hsp27 er co-udtrykkes med α-SMA og vimentin i stroma af PM’er

Aktiveret tumor stroma har været beskrevet som yderst α-SMA positive i primær og metastatisk CRC [12, 31]. Derfor blev prøverne farvet for α-SMA. Ekspressionen af ​​α-SMA i stroma blev bedømt på samme semikvantitativ måde som Hsp27-farvning. 0 (0%), 13 (25,5%), 24 (51%) og 13 (25,5%) tilfælde scoret som 0, 1+, 2+ og 3+, hhv. Farvningen score fordeling i henhold til de klinisk-patologiske variabler er afbildet i tabel 1. Expression niveauer af α-SMA korrelerede signifikant med Hsp27 udtryk i PM’er (

P

. 0,001, figur 2A). Dette blev også observeret i levermetastaser (S2 Fig). For yderligere at vurdere det stromale co-ekspression af α-SMA og Hsp27, repræsentative lysbilleder af primære og metastatiske tumorer blev co-mærket for α-SMA og Hsp27 ved immunfluorescens. En stærk co-ekspression kunne iagttages især i PM’er (fig. 2D). Tumorstroma med stærk Hsp27 og α-SMA-farvning var også yderst positivt for vimentin (S3 tabel).

CD31-positive mikrokar omgivet af tumor stroma siden af ​​tumorceller (asterisk) (B). MVD blev øget betydeligt i primære tumorer og metastaser med stærke stromale Hsp27 udtryk (C). Immunofluorescens viste en co-ekspression af stromale Hsp27 og α-SMA, især i PM (400x forstørrelse) (D).

MVD øges i vævsprøver med Hsp27-positive tumor stroma

nyligt vist, at Hsp27 medierer angiogenese [22]. Vi har derfor bestemt MVD af CD31 farvning og korreleret den med Hsp27 udtryk (fig. 2B og 2C). I PM, fandt vi en tendens til højere MVD i prøver med høje Hsp27 niveauer. MVD var 33,0 ± 2,9, 40,1 ± 3,8 og 43,0 ± 4,7 for 1+, 2+ og 3+ Hsp27 intensitet (middelværdi ± SD). Men denne tendens ikke nå det signifikansniveau (

P =

0,081). Tilsvarende i primær CRC med høj stroma niveauer af Hsp27, markant flere mikrokar kunne findes (27,7 ± 3,2, 37,2 ± 4,0 og 46,4 ± 5,2 for 1+, 2+ og 3+ Hsp27 intensitet, henholdsvis;

P =

0,031). En detaljeret beskrivelse af MVD stratificeret ved klinisk-patologiske karakteristika gives i S2 tabel.

Stromal Hsp27 er forbundet med dårligt resultat efter pulmonal metastasectomy

Vi vurderede foreningen af ​​relevante klinisk-patologiske variabler med LMFS, RFS og OS efter metastasectomy (tabel 2). Ingen variabel havde væsentlig indvirkning på LMFS. Kvindelige patienter havde en stærk tendens til en kortere tid til PM’er (

P =

0,091). Det stromale ekspression af hverken α-SMA eller Hsp27 var forbundet med en signifikant nedsat LMFS. Men begge histologiske markører haft en betydelig prognostisk indvirkning på RFS efter pulmonal metastasectomy (

P =

0,018 og

P =

0.008 til stromale Hsp27 og α-SMA henholdsvis) (fig. 3 ). Igen viste kvindelige patienter en stærk tendens til, at antallet RFS. Desuden patienter med en anamnese med tidligere levermetastaser havde en nedsat RFS sammenlignet med patienter uden levermetastaser i historien. Men begge variabler, køn og historie tidligere levermetastaser, havde ingen signifikant indflydelse på RFS. Derudover kommer, at omfattende stromale Hsp27 stromale Hsp27 og α-SMA var forbundet med en nedsat samlet overlevelse efter metastasectomy (

P =

0,031 og

P =

0,017 for stromale Hsp27 og α-SMA, henholdsvis). På grund af den høje konkordans, stromale Hsp27 og α-SMA var ingen uafhængige faktorer i resultatet analyse, når du tilføjer begge variabler ind i en multivariat analyse (data ikke vist).

Opløselig Hsp27 er systemisk øget hos patienter før pulmonal metastasectomy

Forhøjede niveauer af opløselig Hsp27 kan påvises systemisk i forskellige maligne og non-maligne sygdomme. I en undergruppe på 10 af vores patienter parrede serumprøver (før og efter metastasectomy) var til rådighed (fig. 4). Vi sammenlignede serumniveau af total Hsp27 og phospho-Hsp27 med matchede raske frivillige (S3 Table). Serum total Hsp27 niveauer var 2276 ± 905, 3245 ± 1684 og 2064 ± 1226 pg /mL (gennemsnit ± SD) for kontrol, før og efter metastasectomy prøver hhv. Total Hsp27 faldt signifikant efter metastasectomy (

P

= 0,016). Serum phospho-Hsp27 niveauer var 84 ± 63, 156 ± 82 og 88 ± 114 pg /mL (gennemsnit ± SD) for kontrol, før og efter metastasectomy prøver hhv. En signifikant forskel blev fundet mellem raske kontroller og pre-metastasectomy prøver (

P

= 0,041). Selvom niveauet faldt efter metastasectomy, forskellen var ikke signifikant. IL-8, en proangiogen cytokin involveret i Hsp27 signalering, blev påvist ved meget lave koncentrationer af 15 ± 8, 45 ± 58 og 9 ± 8 pg /ml (middelværdi ± SD) i serumprøverne. Forskellene af systemiske IL-8 niveauer mellem de tre grupper afveg ikke signifikant fra hinanden. Der fandtes ingen korrelation mellem ekspressionsniveauet af stromale Hsp27, Hsp27 tumor og systemiske niveauer (data ikke vist). Desuden blev ingen signifikant korrelation mellem total eller phospho-Hsp27 og standard inflammatoriske markører (CRP og fibrinogen) fundet (S1B og S1c Fig).

Stromal Hsp27 udtryk i pulmonale metastaser er væsentligt forøget i forhold til leveren metastaser

Vi evalueres yderligere det stromale udtryk for stromale Hsp27 og α-SMA i levermetastaser af 25 patienter. Med hensyn til stromale Hsp27 udtryk 0 (0%), 12 (48,0%), 11 (44,0%) og 2 (8,0%) tilfælde scoret som 0, 1+, 2+ og 3+, hhv. Stromal α-SMA-ekspression blev bedømt som udtryk 0 (0%), 8 (32,0%), 11 (44%) og 6 (24,0%) tilfælde scoret som 0, 1+, 2+ og 3+, hhv. Vi fandt en stærk korrelation mellem stromale Hsp27 og α-SMA (P 0,001). Endvidere blev stromale Hsp27 positivitet signifikant oftere findes i pulmonale metastaser sammenlignet med levermetastaser (P = 0,014), mens denne forskel ikke var signifikant for α-SMA (P = 0,625). Desuden udtryk for Hsp27 i tumorceller (median 120 (interval 0-270)) blev øget betydeligt i levermetastaser forhold til pulmonale metastaser (P = 0,037). Vi analyserede yderligere den samlede overlevelse af patienterne med levermetastaser afhængigt af deres stromale Hsp27, α-SMA og tumor Hsp27 udtryk, men signifikante forskelle blev ikke fundet (S3 Fig).

Diskussion

fjernmetastaser er den vigtigste årsag til kræft-relaterede dødsfald. I dag, tumor mikromiljø og især fibroblaster blevet af stigende interesse, der giver yderligere oplysninger om tumor adfærd og potentielle terapeutiske mål [32]. Myofibroblaster kan findes i mikromiljø forskellige tumorer og omfattende fibroblast-aktivering kan være knyttet til en hurtig sygdomsudvikling i ondartet sygdom [32].

Heri kunne vi demonstrere i en veldefineret undersøgelse kohorte, der vimentin

+ αSMA

+ stromale celler er meget til stede i pulmonale metastaser af primær CRC. Wikberg

et al

. skitseret, at myofibroblaster i tumoren center er en bedre prognosticator for dårlig prognose end fibroblaster ved tumor margen [33]. Vi har derfor begrænset scoring af det formodede fibroblastaktiveringsprotein til den centrale del af tumoren. I forhold til Henry

et al

., Som identificerede myofibroblaster af FAP-farvning i primær tyktarmskræft, fandt vi en lignende fordeling af det stromale scoring (0%, 20%, 38% og 35% for negativ, lav , mellemliggende og stærk farvning, henholdsvis). Derudover har de beskrev sammenslutningen af ​​høje mængder af aktiverede fibroblaster med en nedsat samlet overlevelse hos patienter med coloncancer, især i metastaseret situationen [10]. Dette går i tråd med vores resultater viser en nedsat RFS efter pulmonal metastasectomy.

Interessant, α-SMA positiv fænotype af tumor-associerede stroma blev ledsaget af ekspression af Hsp27. På den ene side har denne lille varme-shock protein er undersøgt i CRC tumorceller selv [34-36]. En øget ekspression af Hsp27 i tumorceller af primær CRC blev beskrevet som negativ prognosticator for overlevelse [37, 38]. På den anden side, blev Hsp27 udtrykkende fibroblaster undersøgt i forbindelse med sårheling og fibrose. Så vidt vi ved, har stromale Hsp27 ikke blevet beskrevet som en potentiel prognostisk markør i CRC. Interessant nok blev stærk stromale Hsp27 udtryk forbundet med høj MVD i de primære tumorer (P = 0,031) og i PM (P = 0,081). På grund af den stærke korrelation af Hsp27 med α-SMA som en etableret markør for fibroblast aktivering blev overekspression af Hsp27 forbundet med markant dårligere kliniske resultat efter pulmonal metastasectomy (median RFS 19, 17 og 8 måneder for 1+, 2+ og 3+, henholdsvis), sammenlignes med den prognostiske virkning af stromal α-SMA-ekspression. Faldet RFS blev også oversat i en markant anderledes OS mellem lav, mellem og høj stromale Hsp27 eller α-SMA henholdsvis (fig. 3). Tilsvarende Tsujino

et al

. beskrevet α-SMA-positive fibroblaster som værende i stand til at forudsige sygdom tilbagefald i en kohorte af patienter med stadium II og III primære CRC [12]. Kahlert

et al

. demonstreret ved mikrodissektion af primære CRC, lunge- og levermetastaser, at et panel af pro-angiogene faktorer udtrykkes differentielt i tumorceller og det stromale rum. Det stromale ekspression af angiopoietin-2 i pulmonale metastaser var en uafhængig prognosticator til ringe overlevelse efter kirurgi i multivariat analyse (

P

= 0,044), selv i en forholdsvis lille undersøgelse kohorte (n = 25) [39]. Disse resultater understøtter resultaterne af vores arbejde, hvor vi kunne beskrive Hsp27 som en yderligere proangiogen, stromale markør med prognostisk betydning efter metastasectomy. Det er også vigtigt at nævne, at Sato

et al

. beskrevet høj stromal ekspression af beskrivelsen faktorer ETS1 som prædiktor for CRC lungemetastaser [40]. Interessant er ETS1 stærkt vekselvirkende med det lille varme-shock protein netværk [41].

Analysen af ​​blodprøver i en undergruppe af patienter viste, at metastaserende CRC er en relevant inducer selv af systemiske Hsp27 udtryk. Niveauet af opløselige total Hsp27 og phospho-Hsp27, en polymeriseret form for Hsp27, faldt betydeligt efter fuldstændig fjernelse af PMS. Desuden sammenlignet med en matchet kontrolgruppe af raske frivillige, blev præ-operative samlede Hsp27 og phospho-Hsp27-niveauer øges og faldt efter operation til sammenlignelige lave niveauer. Svarende til vores resultater, Zhao

et al

. kunne påvise øget serumniveauer af Hsp27 i kræft i æggestokkene med peritoneale metastaser. I samme arbejde blev det også vist, at niveauerne faldt efter kemoterapi [42]. IL-8, som menes at mediere lokalt den proangiogen virkning Hsp27, blev også forhøjet før metastasectomy uden at nå betydning [22]. Nontheless, gjorde de cirkulerende niveauer af Hsp27 ikke korrelerer med stromale eller tumor udtryk. Desuden gik det ikke korrelerer med de systemiske niveauer af CRP eller fibrinogen. Således kan den cirkulerende Hsp27 være påvirket af andre faktorer som sekretion, nedbrydning og udskillelse. Baseret på disse foreløbige resultater, vil yderligere undersøgelser med passende kohorte størrelser være nødvendigt yderligere at afklare mulige prognostiske og prædiktive rolle af cirkulerende Hsp27 niveauer hos patienter med CRC.

Hos patienter med CRC levermetastaser tumor stroma Hsp27

+ vimentin

+ αSMA

+ fibroblaster var mindre tydeligt end i pulmonale metastaser. I modsætning til dette, Hsp27 ekspression i tumorceller var signifikant højere i reseceret levermetastaser sammenlignet med lungemetastaser. Dette går i tråd med den iagttagelse, at p38 MAPK signalering, en afgørende kinase for Hsp27 phosphorylering og aktivering, nedreguleres i CRC pulmonale metastaser i forhold til levermetastaser [43].

Resultaterne af dette arbejde er af translationel relevans på grund af to aspekter: for det første, Hsp27, systemisk, eller begrænset til tumor stroma, kan besidde potentiel prognostisk og prædiktiv værdi. Pulmonal metastasectomy er en bredt tilbudt behandlingsmulighed for patienter med CRC PM. Imidlertid identifikation af patienter, som vil drage fordel af kirurgi alene eller et valgfrit adjuvans kemoterapi er et spørgsmål om aktuel forskning [44]. Biomarkører som Hsp27 kan bidrage til at identificere patienter med høj risiko for tidlig tilbagevenden af ​​sygdom efter operationen. Adjuverende kemoterapi og en stringent opfølgning kan tilbydes disse patienter. Under opfølgningen af ​​patienter med ondartet sygdom, serum markører, f.eks CEA, CA19-9 og beta-HCG, anvendes rutinemæssigt i dag og yderligere markører kunne forstærke nøjagtigheden af ​​disse etablerede markører. En begrænsning af denne undersøgelse er, at CEA og CA19-9 niveauer blev ikke rutinemæssigt bestemt før metastasectomy. Korrelation af disse etablerede tumormarkører med serum Hsp27 vil blive behandlet i en kommende undersøgelse.

For det andet, Hsp27 er et lovende lægemiddel mål. Apatorsen (OGX-427, Oncogenex, Bothell, Washington, USA), et modificeret antisense-oligonucleotid, binder til Hsp27 mRNA-transkript og hæmmer derfor Hsp27-ekspression [45]. Igangværende fase II studier rekrutterer patienter med fremskreden prostata, blære, bugspytkirtel og ikke-småcellet lungecancer [46]. De forhøjede ekspressionsniveauer af Hsp27 i tumorassocieret stroma tilvejebringe et rationale for anvendelse af Hsp27 også hos patienter med primær CRC. I betragtning af, at ikke kun CRC lungemetastaser, men også lever og lymfeknudemetastaser udviser stærk myofibroblastdifferentiering rekruttering, især patienter med metastatisk sygdom kan drage fordel af Hsp27 hæmning.

Som konklusion, vi kunne vise, at Hsp27 er co-udtrykt med αSMA i tumor stroma af CRC lungemetastaser og i øvrigt, at dets overekspression er forbundet med dårligere kliniske resultat efter metastasectomy. Notatet opløselig Hsp27 var også systemisk målbare, hvilket gør serum Hsp27 en potentiel fremtidig serum markør i CRC.

Støtte Information

S1 Table. Antistoffer og fortyndinger anvendes til immunhistokemi og immunofluorescens

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120724.s001

(DOCX)

S2 Table. Beskrivende data om patienten, primær tumor og metastaser egenskaber stratificeret af MVD og vimentin (N = 51)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120724.s002

(DOCX)

S3 Table. Karakteristik af matchede patienter og raske kontrolpersoner

Doi:. 10,1371 /journal.pone.0120724.s003

(DOCX)

S1 Fig. Hsp27-ekspression blev også fundet i tumorceller selv (anti-Hsp27, DAB substrat; 200x forstørrelse) (A)

Korrelation af præoperativ Hsp27 og C-reaktivt protein (CRP) eller fibrinogen (n = 10) (B. og C). Hverken total Hsp27 (B), og heller ikke phospho-Hsp27 (C) korreleret signifikant med CRP eller fibrinogen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120724.s004

(TIF)

S2 Fig. I CRC levermetastaser stromale Hsp27 og α-SMA scoring korreleret signifikant (n = 25) (A)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120724.s005

(TIF)

S3 Fig. Fordelingen af ​​stromale Hsp27 (A) afveg betydeligt i levermetastaser (n = 25) i forhold til lunge metasatses (n = 51).

Denne forskel nåede ikke betydning for stromale α-SMA (B). Hsp27-ekspression i tumorceller var signifikant højere i levermetastaser sammenlignet med lungemetastaser (C). blev ikke observeret nogen signifikante forskelle mellem undergrupper vedrørende samlet overlevelse (D-F)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120724.s006

(TIF)