PLoS ONE: Flere-integrationer af HPV 16 genom og Ændret Transskription af Viral onkogener og cellulære gener er forbundet med udvikling af livmoderhalskræft Cancer

Abstrakt

konstitutiv ekspression af den høje risiko HPV E6 og E7 virale onkogener er den vigtigste årsag til livmoderhalskræft. For omfattende udforske sammensætningen af ​​HPV16 tidlige udskrifter og deres genomiske anmærkning, cervikale planocellulære epitel væv fra 40 HPV16-inficerede patienter blev indsamlet til analyse af papillomavirus onkogen udskrifter (APOT). Vi observerede forskellige transskription mønstre af HPV16 onkogener i progression af cervikale læsioner til livmoderhalskræft og identificeret en roman udskrift. Multiple-integration begivenheder i væv af livmoderhalskræft (CxCa) er betydeligt oftere end lav kvalitet planocellulære intraepithelial læsioner (LSIL) og high-grade planocellulære intraepithelial læsioner (HSIL). Desuden fleste cellulære gener i eller i nærheden af ​​disse integrationssteder er cancerassocierede gener. Tilsammen denne undersøgelse tyder på, at de multiple-integrationer af HPV-genomet under vedvarende virusinfektion, som derved ændrer ekspressionsmønstre for virale onkogener og integrationsrelaterede cellulære gener, spiller en afgørende rolle i udviklingen af ​​cervikale læsioner til cervical cancer.

Henvisning: Lu X, Lin Q, Lin M, Duan P, Ye L, Chen J, et al. (2014) Flere-integrationer af HPV 16 genom og Ændret Transskription af Viral onkogener og cellulære gener er forbundet med udvikling af livmoderhalskræft. PLoS ONE 9 (7): e97588. doi: 10,1371 /journal.pone.0097588

Redaktør: Xuefeng Liu, Georgetown University, USA

Modtaget 2 oktober, 2013; Accepteret: April 21, 2014; Udgivet 3. juli, 2014

Copyright: © 2014 Lu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81001343, 81172463), Department of Education of Zhejiang-provinsen (Y200907403) og Wenzhou Videnskab og Teknologi Bureau (Y20090103, Y20100175 og H20100063). Disse sponsorer forudsat finansieringen af ​​forsøgene og indsamling af prøver. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald hos kvinder over hele verden. Den vedvarende infektion med human papillomavirus højrisiko (HR-HPV), såsom genotype 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, og 59 er afgørende for udviklingen af ​​cervikale læsioner [1], er og over 50% tilfælde forårsaget af HPV 16 [2]. Virale oncoproteiner, E6 og E7, af HR-HPV’er bidrager til cervikal carcinogenese ved inaktivering to store cellulære tumorsuppressorproteiner, p53 og pRb, henholdsvis [3] – [6]. Disse virale oncoproteiner i inficerede celler kan også resultere i for mutationsbegivenheder kromosom ustabilitet og akkumulering [7].

En viral tidlige promotor løj opstrøms for E6 ORF, såsom P97 i HPV16 [8], [9] , P99 i HPV31 [10], [11] og P105 i HPV18 [12], [13], er ansvarlig for næsten alle tidlig genekspression, herunder E6 og E7. Upstream cis-elementer i LCR interagere med cellulære transkriptionsfaktorer og den virale transaktivator /repressor E2 og regulere transkriptionen af ​​HPV E6- og E7-generne [8], [14]. Endvidere DNA-methylering [15], alternativ RNA-splejsning [9], [16], [17] og tidlig poly (A) -site polyadenyleringssignal [18], [19] også deltage i reguleringen af ​​E6 og E7-genekspression [19].

til dato har en fuld transskription kort over onkogen HPV 16 og HPV18 i HPV-inficerede celler og tømmerflåde væv blevet bygget [19], [20].

Det er velkendt at integrationen af ​​HPV-genomerne er en central begivenhed i cervical carcinogenese [21], [22]. Udover virale genom integration i aktivering cellulære onkogener eller inaktivere cellulær tumor undertrykkende gener [23] – [25], HPV-genomet integration i værtsgenomet kan ændre transskription mønstre af både virale og værtsgener [26]. Det er blevet rapporteret, at integrationen af ​​HPV-genomer kan forstyrre det virale E2-genet i celler og frigiver dets inhibering på den virale tidlige promotor, der styrer ekspression af E6 og E7 [27]. Desuden kan E6 og E7 transskripter cotranscribed med cellulære sekvenser være mere stabil, og således øge deres ekspressionsniveau [28] – [30].

Transskription mønstre af HPV16 i væv af livmoderhalskræft er blevet rapporteret [ ,,,0],26], [31]. Der var en episomal HPV tidlig gen udskrift (E7-E1

∧E4) og flere integrerede HPV udskrifter (såsom E7-E1

∧cellular RNA, E7-E1

∧E4-cellulære RNA, etc. ) i HPV16-inficerede væv. Imidlertid transkriptionel udvælgelse som reaktion på miljømæssige ændringer er en dynamisk proces at opnå optimal genekspression for celleoverlevelse og carcinogenese [32]. I denne undersøgelse, vi anvendte en modificeret teknik forstærkning af papillomavirus onkogen udskrifter (APOT) [26] for omfattende udforske strukturen og sekvenser af HPV 16 E7 relaterede udskrifter og deres genomiske anmærkning i 8 LSIL (lav kvalitet planocellulære intraepithelial læsioner), 24 HSIL (high-grade planocellulære intraepithelial læsioner), og 8 CxCa HPV16-positive cervikale biopsiprøver.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

Vævsprøver af primær uterin livmoderhalskræft læsioner indeholder dysplastiske epitel /tumorceller blev indsamlet fra Anden Tilknyttede Hospital i Wenzhou Medical University (Zhejiang-provinsen, Kina) fra december 2010 april 2012. tilstedeværelsen af ​​HR-HPV blev opdaget af HCII test, og screening af HPV16 i HR -HPV-positive prøver blev udført af HPV genotyper afsløring kit (KaiPu, Guangzhou, Kina) [33]. Alle af dem har ikke modtaget strålebehandling eller kemoterapi før operation og hver patient gennemgik en colposcopically rettet biopsi. De indsamlede biopsi prøver blev halveret. En portion blev underkastet standard histopatologisk diagnose, mens den anden portion blev opbevaret i RNAlater (Ambion, Austin, Texas, USA) ved -80 ° C til efterfølgende analyse. På grundlag af det histopatologiske diagnose blev prøverne opdelt i LSIL (CIN I, n = 8), HSIL (CIN II, n = 22; CIN III, n = 16) og cervix carcinoma (CxCa, n = 17). Yderligere 8 cervikale væv med normal cytologi og HPV-DNA negativitet som kontroller blev indhentet fra de patienter, som gennemgik hysterektomi på grund af benigne gynækologiske sygdomme. Undersøgelsen er godkendt af Medical Ethics Committee of Second Affiliated Hospital i Wenzhou Medical University. Alle kvinder blev informeret og gav deres skriftlige samtykke til at deltage i undersøgelsen.

RNA og DNA Isolering fra kliniske prøver

Total RNA fra biopsiprøver beskrevet ovenfor blev isoleret ved hjælp TRIzol reagens (Invitrogen, Calif ., USA) ifølge producentens anvisninger. For at fjerne tilbageværende DNA-kontaminering blev RNA-præparat behandlet med RNase-fri DNase I (Takara, Dalian, Kina) ifølge fabrikantens protokol. Oprenset total RNA blev opløst i Rnase-frit vand og opbevaret ved -80 ° C. Koncentrationen og renheden af ​​total RNA blev kvantificeret ved den ultraviolette spektrofotometer ved 260 nm og 280 nm og 1% agarosegelelektroforese. Kun RNA-prøver med et A260 /A280-forhold på 1,8-2,0 og høj integritet blev anvendt til yderligere forsøg.

Reverse Transcription and PCR-amplifikation af transkripter

APOT assay rapporteret tidligere var baseret på nested PCR-reaktioner [26], som kun kunne forstærke de rigelige udskrifter og ignorere de udskrifter med lavere niveauer i prøver. Så modificeret APOT assay blev anvendt til at amplificere HPV onkogene transkripter. Primerne til disse reaktioner blev designet i henhold til Klaes R, et al [26]. Totalt RNA (1 ug) blev omvendt transskriberet under anvendelse af en oligo (dT)

17-primer koblet til en linkersekvens

RT

[34] i henhold til fabrikantens protokol af revers transkriptase Kit (TOYOBO, Japan) . For at verificere første streng cDNA kvalitet, blev PCR under anvendelse glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) -specifikke primere udført som tidligere beskrevet [35]. Første streng cDNA omfatter virale onkogen sekvenser blev efterfølgende opformeret ved PCR ved hjælp af

p1

-HPV16E7 specifik primer (5′-CGGACAGAGCCCATTACAAT-3 ‘) og linker

p0

(5′-GACTCGAGTCGACATCG-3 ‘) som den reverse primer; og PCR-amplifikation blev udført i et reaktionsvolumen på 50 pi. Forskellig fra tidligere rapporter, blev PCR-cykler steget til 35, og alle prøver kun udført én-round PCR-reaktion. For at verificere specificiteten af ​​denne procedure, blev “minus-RT” kontrol, hvor revers transkriptase udeladt fra reaktionerne blev også udført parallelt.

Sekvensanalyse af Afskrifter

APOT amplifikationsprodukterne var visualiseret med 2,5% agarosegelelektroforese. PCR-produkter af interesse blev udskåret fra gelen og ekstraheret under anvendelse af DNA agarosegel recovery kit (TianGen, Beijing, Kina). De tilsvarende amplimeres blev klonet i kloningsvektoren (transgen, Beijing, Kina) og DNA-sekvensanalyse blev udført ved anvendelse af en ABI 3730 XL Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA) i overensstemmelse med standard protokoller. Sekventeringsresultaterne blev analyseret ved anvendelse af BLASTN program tilvejebragt af National Center for Biotechnology Information, USA. Derudover blev de kromosomale integration sites konstateres efter National Center for Biotechnology Information (BLAST) og Europæiske Molekylærbiologiske Laboratorium (EBI). Desuden blev de skrøbelige steder og gener af integration sites defineret ved hjælp af NCBI skrøbelige site map viewer og den UCSC Blat værktøj.

Resultater

Specificitet af APOT assay for HPV16 onkogen udskrifter

princippet for APOT assayet er en 3’hurtig amplifikation af cDNA ender (RACE) PCR-assay, der opnår amplifikation og kloning af regionen mellem en enkelt kort sekvens i et cDNA-molekyle og dets ukendt 3′- ende [34]. Generelt de integrerede transkripter afledt af E6 og E7 oncogener omfatte virale sekvenser ved deres 5′- ender og værtsgenomet sekvenser ved deres 3′-ender [26]. Den forventede størrelse af produkter fremstillet af et episom-afledte udskrift er 1050 bp [26] Amplimerer der vises en størrelse forskellig fra 1050 bp kan derfor være afledt af en integreret HPV genom. At vidne specificiteten af ​​den modificerede APOT analysen, cDNA fra HPV16-positive Caski celle indeholder de integrerede HPV 16 genom og HPV-negative normale cervikale væv, såvel som de “minus-RT” kontroller, hvor reverse transkriptase blev udeladt fra reaktionerne var anvendes. De forstærkede produkter fra cDNA’erne fra HPV16-positive Caski celle svarede til den foregående rapport [26], mens der ikke RT produkt blev opnået fra de normale cervikale væv uden HPV-DNA og “minus-RT” kontrol (figur 1). Disse data viste det modificerede APOT assayet specifikt kan detektere transkripter afledt af det integrerede HPV-genomet.

Amplificerede produkter fra CaSki-celler (A), HPV16-positive CxCa (B), HPV negative normale cervikale væv (C) og “minus-RT” kontrol af RNA isoleret fra HPV 16-positive prøver (D) af APOT assayet blev separeret på 2,5% agarosegeler. A:

Lane 1-3

var tre forskellige subkultur CaSki celler (som en positive kontroller); B:

Lane 1-3

var tre forskellige CxCa prøver; C:

Lane 1-3

var tre forskellige normale cervikale væv (som negative kontroller); D:

Lane 1-3

var tilsvarende med prøver i B, henholdsvis; M:. 250-bp DNA stiger

Karakteristik af HPV16 onkogen udskrifter i væv af cervikal intraepitelial neoplasi og livmoderhalsen karcinom

For at analysere HPV16 onkogen udskrifter, 40 HPV16-positive livmoderhalskræft enheder (LSIL, n = 8; HSIL, n = 24; CxCa, n = 8) med god kvalitet RNA blev udvalgt blandt 63 indsamlede prøver i denne undersøgelse. Total 133 transkripter indeholdende virale fragmenter blev fundet. Blandt disse transkripter, 64 fragmenter havde HPV16 E7-E1 * sekvenserne ved deres 5′- ender og er direkte forbundet med poly A ved deres 3′- ender (figur S1). Endvidere var der fire forskellige afbrydelser af E1-regionen ved nt 880, 949, 1054 og 1234 (figur S2). De udskrifter indeholder en E1-splejsningsdonor signal ved nt 880 [36] kunne tilhøre potentiel episomale mønster, mens den afskrift, som afkortet på nt949 kunne være et resultat af intern priming ved oligo dT [37]. Andre udskrifter, der afkortede ved nt 1054 og 1234 hverken indeholdt poly A-sekvenser, eller nogen polyadenyleringssted tilhører viral eller vært, så disse udskrifter blev betragtet som potentielle integrerede mønstre. Desuden har vi også fundet en anden transkript, som har E7 ORF splejset ved nt 880 til E4-splejsningsacceptorsted ved nt 3358 og derefter splejset fra E4-splejsningsdonor signal ved nt 3632 til L1-splejsningsacceptorsted på 5639, og også afsluttes på poly A (figur S1). I dette transkript, er E4-ORF ikke forstyrres. Mangel på en splejsningsdonor signal ved nt 5815 i dette transkript indikerer, at HPV16-genomet forstyrret ved nt 5815 også kan tage del i virusgenomet integration.

Desuden var der 64 virale transkripter direkte forbundet til værtsgenomet sekvenser og de var alle begyndte med begyndelsen af ​​den fremadrettede primer (p1) ved nt 729. Disse HPV16 onkogen integreret transkripter kunne opdeles tre forskellige typer (figur 2). Blandt disse udskrifter, Type A har HPV 16 E7-E1

* sekvenser ved deres 5′- ender og direkte forbundet til vært genom-sekvenser. Men der var to forskellige integrationssteder af E1-regionen (ved nt880 og nt1107) i denne type (figur S3). Webstedet ved nt880 indeholdt en E1-splejsningsdonor signal, mens webstedet afkortet på nt1107 kan være mere tilbøjelige til at linearisere det virale cirkulære genom for integration i værtsgenomet. Udskrift type B har en E2 ORF forstyrret på nt2870 og type B sekvens komponerer af HPV 16 E7-E1

∧E2

* ved sine 5′- ender og værtsgenomet sekvens på sine 3’ender. I transkript typen C, E1

∧E4 stopkodon afbrudt for virus integration og en hel E1

∧E4 ORF uden stop codon er fusioneret i ramme til vært sekvens. Blandt disse tre mønstre, havde transkripter af type A og C blevet rapporteret af Wentzensen N, et al. [31]. Men udskrift af type B var ikke tidligere blevet rapporteret i forstadier til kræft og livmoderhalskræft

Type A viser E1-sekvenser splejset direkte til cellulær flankerende sekvens.; Type B viser E1 splejset til E2, med E2 fusioneres med en cellulær sekvens; Type C viser E1 splejset til E4, med E4 løbe ind i en cellulær sekvens.

▴, er der to integrationssteder i E1 (data vist i fig S3). Boksene inden skråstreger repræsenterer seks nukleotider mellem E7 og E1gene.

Desuden HPV16 onkogener viste signifikant forskellige transskription mønstre i væv af LSIL, HSIL og CxCa (figur 3, 4 og tabel 1). Blandt disse 3 transskription mønstre detekteret i vores patienter, type A og type B var højere forekomst end type C, der blev observeret i næsten alle patologiske typer, mens type C blev opdaget kun i prøver af CxCa, med en afsløring frekvens på 75% (tabel 1 og figur 4). Alle patientprøver vises Type A, men alle CxCa prøver havde type B og type C (figur 4). I overensstemmelse med formodningen om potentielle integration af det virale genom i de senere faser af udvikling af kræft [38], [39], forekomsten af ​​fusion afskrifter var højere i HSIL og CxCa end LSIL.

HPV16-positive kliniske prøver med LSIL, HSIL og CxCa blev underkastet APOT assayet og separeret på 2,5% agarosegeler,

Lane 1-5

betyde fem forskellige prøver i hver patologiske type. M:. 250-bp DNA Stiger Vejviser

Integration sites og karakterisering af den cellulære flankerende sekvens

For at identificere de enkelte kromosomale steder, alle 64 fusion-udskrifter indeholdende virale og cellulære sekvenser blev yderligere analyseret ved BLASTN sammenligninger til hele genomet databasen. Vores data viser, at alle kromosomer, med undtagelse af Chr21 og X, blev integreret med HPV 16 genom, hvilket bekræfter de tidligere rapporter, ikke favoriseres HPV integration site blev set i udvælgelsen af ​​den menneskelige kromosom [40]. Nogle loci, såsom 1p36.22, 1p36, 2p24, 2q33, 5q31.1, 5q31, 6p24, 8p23, 10q22.1, 13q22.1, 19q13 og 19p13.3, blev rapporteret tidligere [31], [41] – [45] (tabel 2). Blandt disse integration arrangementer, fjorten af ​​40 prøver udstillet flere integration sites (tabel 2). Selv om de lokale DNA omlejringer kunne ske hyppigt og hurtigt efter integrationen [43], fandt vi, at cellulære flankerende sekvenser i 11 væv blev kortlagt til forskellige kromosomer, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​flere uafhængige integrationer i disse prøver. Endvidere fandt vi, at multipel-integration begivenheder var signifikant højere i CxCa væv (75%) end i den cervikale væv af LSIL (50%) og HSIL (53,8%). Screening af alle integration loci indikerer, at 35 af 63 kortlagte integrationssteder var placeret i eller tæt på en skrøbelig site med en afstand på 26 bp til 5 MBP (tabel 2). Blandt de 22 kortlagte skrøbelige steder blev FRA13A findes i 4 uafhængige prøver. Tyve-to udskrifter var ikke associeret med nogen skrøbelige websted.

De cellulære flankerende sekvenser af viral-cellulære fusion udskrifter blev yderligere undersøgt for kendte gener. De fleste af disse kondenserede transkripter havde en cellulær sekvens fra den kodende orientering af kendte gener og tredive transkripter havde den cellulære sekvens fra en intron region, og 8 transkripter blev fusioneret med en følelse exon sekvens af de forudsagte gener (tabel 2). Blandt disse forudsagte gener,

AMICA1

,

DAPK1

,

EBAG9

,

PIBF1

blev ramt to gange,

MRPS31

fire gange, og

PRDX5

endda seks gange af den virale integration. Samtidig blev de nærmeste værtsgener til hver integration site i transkriptionsretningen også analyseret (tabel 2). Blandt disse forudsagte gener integreret eller lukket for integrationen site, vi identificeret flere tumor-associerede gener, herunder

PRDX5

,

CD28

,

ROCK2

,

RHOH

,

TIMP3

og

DAPK1

mv Som vist i tabel 1, udskrifter skrive D og E blev kun fundet i CxCa og de fleste af deres integration loci var placeret i eller tæt på skrøbelige steder i FRA13C, FRA22B, FRA2I og FRA13A. Generne er forbundet med de udskrifter skrive D og E var onkogener (

CD28

EBAG9

), tumorsuppressorgener (

TIMP3

), eller tumor-relaterede gener (

PIBF1

og

MRPS31

).

diskussion

Integration af HPV genomet i værten kromosomer repræsenterer en tidlig klonal begivenhed til at give en ekstra selektiv fordel for udvidelsen af neoplasmen. Virale udskrifter er blevet opdaget af APOT analysen [26], [31], [42] – [45]. Selvom APOT analysen har nogle fordele i afsløring udskrifter fra hvert kromosom integration site, er der flere begrænsninger. For det første er det vanskeligt at amplificere meget lange integrations–afledte transkripter, som vil undervurdere antallet af tumorer med integreret HPV-DNA [45]. For det andet, APOT er en type af nested PCR, som kan have tendens til at forstærke transkripterne med højere niveauer og ignorere dem med lavere niveauer. For det tredje er det blevet rapporteret, at den interne poly En priming kunne erstatte oligo (dT) primer inden for visse grænser, og generere et sæt forankret oligo (dT) primere til cDNA syntese. Disse sekvenser forårsaget af intern priming afbrudt den frembringende af fuld-længde cDNA og forvirret analyse af alternativ splejsning [37]. Med vores modificeret APOT assay til påvisning af transskription mønster af de cervikale væv, vi finde mange virale udskrifter forbundet med poly A eller vært genom-sekvenser i HPV16-inficerede cervikale planocellulære epitel væv. Vi bemærkede, at der var en masse af virale udskrifter direkte endte med poly A ved deres 3’ender. Bortset fra den rapporterede E1-splice donor signal websted (nt 880), trunkering steder på nt1054, 1234 og 5815 hverken indeholdt interne poly A-sekvenser eller nogen polyadenyleringssignaler bør være potentielle nye integrerede sites og behov for yderligere analyse. Den virale-cellulære fusion udskrift af type A og C er blevet rapporteret tidligere [26], [31], [41]. I type C transskript, ville integrationen afbrydelse af E4 termineringskodonen resulterer i E4 at bruge en masse termineringskodon. I denne undersøgelse, vi har også bemærket, at nogle livmoderhalskræft prøver indeholdt alle tre typer af udskrifter var viral-cellulære fusion udskrifter.

HPV16 transskription mønstre i LSIL, HSIL, og CxCa var signifikant forskellige. Vi fandt, at Type C transkriptet kun blev påvist i prøverne med CxCa og flere tilfældige integration sites eksisterede i vores vævsprøver. Svarende til tidligere rapporter [31], [38] – [42], [46], [47], vores undersøgelse viser, at HPV-integration har nogen privilegeret sted i det humane genom. Undtagen for kromosom 21, og X, andre kromosomer er alle modtagelige for HPV16 integration. Ca. 55% integrationer er placeret i eller tæt på en skrøbelig site. Forskellig fra tidligere rapporter [42], [45], bemærkede vi, at integration begivenheder ofte opstår flere gange betydeligt mere i livmoderhalskræft end i LSIL og HSIL. Disse data giver ikke blot biologisk støtte til den epidemiologiske observation, at vedvarende infektion af specifikke typer af HR-HPV er den vigtigste årsag til cervical carcinoma [1], men viser også, at den efterfølgende selektion for og akkumulering af mutationer i endnu-til-mel- identificerede centrale cellulære regulatoriske gener fremmer yderligere progression til cervikal cancer.

integrationen ikke kun ændrer transskriptionen mønster relevante for dysreguleret ekspression af de virale onkogener, men påvirker også ekspressionen af ​​værtsgenet med virusgenom integration. Integrationen ændrer ekspressionen af ​​værtsgener i integrationssteder, selv om dette sker inden for de intronsekvenser [43], [45]. I vores undersøgelse identificerede vi et bredt spektrum af cancerassocierede gener i integrationen sites og flankerende områder sekvens. De fleste gener i integrationsindsatsen steder var forbundet med tumor udvikling, og nitten gener var stærkt relateret til livmoderhalskræft. Nogle af dem fungerer som tumorsuppressorer (såsom

miR-34a

,

MSH2

,

WWOX

TIMP3

,

et al

) eller onkogener (såsom,

ROCK2

,

CD28

,

EBAG9

og

ANGPT1

,

et al

). Interessant, de fleste af dem blev ikke rapporteret i tidligere dokumenter [31], [45].

MIR-34a

, en vigtig tumor suppressor, nedreguleres i livmoderhalskræft [48], [49]. Det er blevet rapporteret, at onkoprotein E6 af HPV16 og HPV18 kan inhibere ekspressionen af ​​tumor-undertrykkende

MIR-34a

efter destabilisering af p53 og resulterede i celleproliferation [50]. Forstyrrelsen af ​​

miR-34a

gen måske yderligere fortolke fænomenet reduceret ekspression af

miR-34a

i livmoderhalskræft.

MSH2

er en DNA mismatch repair protein, og er forbundet med DNA-reparationsvej [51], [52]. Nedsat udtryk for MSH2 kan være en risikofaktor i den tidlige fase livmoderhalskræft [53].

ROCK2

, et vigtigt signalmolekyle, kan fremme livmoderhalskræft metastase ved opregulering og aktivering af ekspression og funktion af moesin protein gennem RhoA /ROCK2 pathway [54]. Udover de cancerassocierede gener, kan generne i integrationssteder og flankerende sekvens regioner også være gavnligt for virale genom integration.

FANCM

som er en DNA-translocase og stærkt relateret til DNA-replikation regulerer checkpoint signalering og replikation gaffel progression [55], [56]. Andre gener, såsom

COX6B1

er relateret til celle apoptose [57] og

ESRRA

også blevet rapporteret i forbindelse med livmoderhalskræft [58]. Hertil kommer, blandt 45 integration arrangementer, 13 begivenheder førte til antisense transskription af de kodende sekvenser, såsom

PRDX5

,

EBAG9

CD28 osv

. Disse integrationer blev generelt anset uden interesse. Imidlertid blev deres følelse sekvenser forbundet med DNA restaurering eller tumor udvikling og kan påvirke både vært og viral genekspression under udviklingen af ​​livmoderhalskræft. Den mest integration i antisense-orientering var genet kodende peroxiredoxin 5 (

PRDX5

), en beskyttende emzyme mod oxidativ stress [59], [60]. Dens ændret ekspression skyldes HPV16 integration kan have betydelige virologisk konsekvens, sammen med integration i DNA reparation gener, såsom FANCM og MSH2. Opregulering af

EBAG9

udtryk er blevet observeret i flere maligne tumorer [61]. Den synergistiske stimulation faktor

CD28

som opretholder immun homøostase spiller en rolle for at øge modtageligheden for livmoderhalskræft [47].

Som konklusion, ændringer af transskription mønstre af HPV 16 tidlige gener gå sammen med progression fra cervikal intraepithelial neoplasi at livmoderhalscarcinom og virusgenom integration i værtskromosomet. Ændringen eller valg af transskription mønstre og integrationen på ekspressionen af ​​værten gener i integration sites og flankerende cellulære sekvens regioner kan alle tage del i onkogenese af HPV16-induceret kræft.

Støtte oplysninger

figur S1 .

De typer af virale sekvenser forbundet med poly A ved deres 3’ender. Den type klasse I viser E1-sekvenser direkte endte med poly A; typen af ​​klasse II viser E1 splejset til E4 og derefter til L1 og også endte med poly A-sekvenser.

▴, er der flere trunkering steder i E1 (data vist i figur S2)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0097588.s001

(TIF)

Figur S2.

Forskellige trunkering steder i E1-området i den type klasse I. Der er fire afstumpede steder i E1, 880, 949, 1054 og 1234, henholdsvis

doi:. 10,1371 /journal.pone.0097588.s002

(TIF)

Figur S3.

Flere splejset donor steder i E1. I Type A er der to integration steder i E1, 880 og 1107, henholdsvis. De solide kasser betyder cellulære sekvenser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0097588.s003

(TIF)

Tak

Vi takker Zhi-Ming Zheng af NIH og Kong -Nan Zhao for nyttige kommentarer og revisioner.