PLoS ONE: A Novel Fuldautomatisk Molekylær Diagnostisk System (AMDS) for tyktarms- og endetarmskræft Mutation Detection

Abstrakt

Baggrund

KRAS, BRAF

PIK3CA

mutationer ofte observeres i kolorektal cancer (CRC). Især

KRAS

mutationer er stærke prædiktorer for kliniske resultater af EGFR-målrettede behandlinger såsom cetuximab og panitumumab ved metastatisk kolorektal cancer (mCRC). For mutationsanalyse, de nuværende metoder er tidskrævende, og ikke let tilgængelige for alle onkologer og patologer. Vi har udviklet en ny, enkel, følsom og fuldt automatiseret molekylær diagnostisk system (AMDS) til point of care testing (POCT). Her rapporterer vi resultaterne af en sammenligning undersøgelse mellem AMDS og direkte sekventering (DS) i afsløring af

KRAS, BRAF

PI3KCA

somatiske mutationer.

Metode /Principal finde

DNA blev ekstraheret fra et udsnit af enten frosne (n = 89) eller formalinfikseret og paraffinindlejret (FFPE) CRC væv (n = 70), og derefter anvendes til mutationsanalyse af AMDS og DS . Alle mutationer (n = 41 blandt frosset og 27 blandt FFPE prøver) detekteres af DS var også med succes (100%) detekteres af AMD. Imidlertid blev 8 frosne og 6 FFPE prøver påvist som vildtype i DS analysen vist som mutanter i AMDS analysen. Ved kloning-sekventering assays blev disse uharmoniske prøver bekræftet som sande mutanter. En prøve havde samtidige “hot spot” mutationer af

KRAS

PIK3CA

, og kloning assay comfirmed at E542K og E545K var ikke på samme allel. Genotypning takster for DS var 100,0% (89/89) og 74,3% (52/70) i ​​frosne og FFPE prøver, henholdsvis for første forsøg; mens den for AMDS var 100,0% for begge prøvesæt. For automatiseret DNA-ekstraktion og mutation afsløring af AMDS, frosne væv (n = 41) blev med held opdaget alle mutationer inden for 70 minutter.

Konklusioner /Betydning

AMDS har overlegen følsomhed og nøjagtighed over DS, og er meget lettere at udføre end konventionelle arbejdskrævende manuelle mutationsanalyse. AMDS har et stort potentiale for POCT udstyr til mutation analyse

Henvisning:. Kitano S, Myers J, Nakamura J, Yamane A, Yamashita M, Nakayama M, et al. (2013) A Novel Fuldautomatisk Molekylær Diagnostisk System (AMDS) for tyktarms- og endetarmskræft Mutation Detection. PLoS ONE 8 (5): e62989. doi: 10,1371 /journal.pone.0062989

Redaktør: Anthony WI. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 8. januar 2013; Accepteret: 27 marts 2013; Udgivet: 9. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Kitano et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret af forfatternes selskab (Toppan PRINTING CO., LTD.). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Denne forskning blev finansieret af forfatternes selskab (Toppan PRINTING CO., LTD. ). Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Den menneskelige

KRAS

onkogen er muteret i over 30% af CRC, og mere end 3.000 punktmutationer er blevet rapporteret til dato [1]. opdages De hyppigste ændringer i codon 12 (~82% af alle rapporterede

KRAS

mutationer) og i codon 13 (~17%), der begge er i exon 2 i

KRAS

gen [2] og synes at spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​CRC [3].

BRAF

koder for en serin /thereonine kinase, der aktiverer RAS-MAPK-vejen, og dets mutation er blevet fundet i 4-15% af CRC.

PIK3CA

koder den katalytiske subunit p110 alpha af PI3K [4], og muteret PIK3CA stimulerer AKT-vejen og fremmer cellevækst i forskellige kræftformer, herunder CRC [5].

PIK3CA

mutationer er blevet beskrevet i 10% -30% af CRC [6], og er forbundet med

KRAS

mutation. Der har været en rapport, at tilstedeværelsen af ​​mutationer i

PIK3CA

,

KRAS

, eller

BRAF

i CRC viste dårligere patient resultat [7], og blandt patienter, der gennemgår en helbredende resektion af CRC,

PIK3CA

mutation er forbundet med kortere cancer-specifik overlevelse [8]. Men den negative virkning af

PIK3CA

mutation kan være potentielt begrænset til patienter med

KRAS

vildtype-tumorer [8].

Cetuximab og panitumumab er effektive epidermal vækstfaktor (EGFR) målrettede midler til metastatisk kolorektal cancer (mCRC), men patienter, hvis tumorer har

KRAS

mutationer undtagen G13D [9] er generelt menes at ikke drage fordel af disse midler [10], [11]. Desuden mutationer i

BRAF

PIK3CA

er også rapporteret at påvirke effekten af ​​EGFR-målrettede midler [12], [13]. I betragtning af den vigtige værdi af disse mutationer i forudsigelse af klinisk resultat i FRK patienter, ville en hurtig, pålidelig og følsom teknik samtidig detektering dem være afgørende for informeret farmakoterapi. Hidtil selv om der er udviklet mange teknologier, er de begrænset af den komplicerede procedure, høje omkostninger, lille produktion eller andre problemer. For eksempel er direkte Sanger-sekventering (DS) aktuelt stadig betragtes som en guld standard for at detektere disse mutationer. Imidlertid DS metode kræver flere trin,, mangler en evne til automatiseret analyse. Det har også en lang turn-around-tid og er generelt relativt dyrt i forhold til andre metoder. Andre nyudviklede metoder, herunder PCR-relaterede teknologier [14] – [17], sekventering platforme [18], [19] og andre metoder såsom HRM (High Resolution Melting analyse) [20] analyse er mere følsomme og praktisk end DS men de er også tids- og arbejdskrævende [21], og ikke let tilgængelige for de fleste klinikere, hvilket ofte kræver, at tumoren prøven sendes til et referencelaboratorium, hvilket potentielt kan medføre behandling forsinkelser.

Vi har udviklet et fuldautomatisk genetisk analysator AMDS som omfatter fremgangsmåder til DNA-ekstraktion /oprensning, DNA amplifikation (PCR), mutation påvisning ved Invader® kemi [22], [23], og genotype fortolkning. AMDS kan kalde en mutation status automatisk i 70 minutter efter tilsætning af en prøve (

fx.,

Ekstraheret genomisk DNA eller vævsprøven homogenat) til patronen. Her rapporterer vi en forundersøgelse af AMDS til detektering somatiske

KRAS

,

BRAF

PI3KCA

mutationer i CRC væv ved sammenligning med DS i en dobbelt-blind måde. Vi først evalueret følsomheden af ​​amdS ved anvendelse af en titrering assay med kunstigt konstruerede plasmid-DNA. En klinisk undersøgelse præstation blev derefter udført for yderligere at vurdere nøjagtigheden, specificitet og følsomhed af systemet i forhold til DS. Desuden blev kloning-sekventering analyse gennemført for at validere den uharmonisk mutationsstatus mellem AMDS og DS. Alsidigheden af ​​systemet i detektion af mutationer fra væv med forskellige fikseringsmidler (frisk frosset og FFPE) blev også evalueret. Desuden testede vi evnen af ​​systemet i en fuldautomatisk tilstand: fra DNA-ekstraktion til mutation afsløring, ved hjælp af en minimal mængde ( 1 mg) af frosne CRC væv

Materialer og metoder

.

Plasmid DNA

de målrettede mutationer var 7 ikke-synonyme punktmutationer (G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V og G13D) i exon 2 i

KRAS

gen, en synonym punkt mutation (V600E) i exon 15 i

BRAF

gen og 5 ikke-synonyme punktmutationer i exon 9 spiralformet domæne (E542K, E545K, E545G) og exon 20 kinase domæne (H1047L, H1047R) i

PIK3CA

gen, alle almindelige mutationer i menneskets CRC. Disse mutanter og vildtype-typer blev PCR-amplificeret og klonet i plasmidet pCR®2.1 (Invitrogen, CA, USA), og de syntetiserede mutant og vildtype-skabeloner blev verificeret ved sekventering. Længden af ​​alle plasmid-DNA, herunder 300 bp målsekvensen var 4,2 kb. De syntetiserede plasmid-DNA’er blev suspenderet i TE-buffer og opbevaret ved -20 ° C før brug.

CRC Specimen Afsnit

CRC væv af frosne specimen sektioner (n = 89) og FFPE specimen sektioner ( n = 70), der anvendes i denne undersøgelse var fra human Tissue Resource center ved University of Chicago. Alle prøver blev diagnosticeret som colon eller rektal cancer ved hematoxylin og eosin pletten. Alle væv var primært CRC væv kirurgisk fjernet forud for andre kliniske behandlinger. Væv blev skåret til en omtrentlig størrelse på 1,0 cm

2 × 10 um ved mikrotom. De snittede afsnit prøver anvendt til denne undersøgelse blev ikke udført ved manuel mikrodissektion (MMD). blev anmodet Ingen yderligere oplysninger, herunder demografiske og kliniske data for disse prøver. Undersøgelsen er blevet gennemgået og godkendt af Institutional Review Board fra University of Chicago.

AMDS

AMDS er et fuldautomatisk genetisk analytisk system baseret på en DNA-chip, som har 23 reaktionsbrønde indeholdende reagenser til PCR og Invader® assays (figur 1A og 1B). Når en bruger tilføjer en prøve (fuldblod, oprenset DNA eller vævshomogenat) til DNA oprensning patron og begynder vedlagte software, AMDS udfører DNA-ekstraktion, overfører DNA til chippen, udfører PCR og Invader® assay læser resultaterne og viser dømme resultat i omkring 70 minutter. Assay strøm af mutationspåvisning er vist i figur 1C. I trin 1 er DNA ekstraheres og oprenses ved DNA oprensning patronen; i trin 2, er det oprensede DNA væskeprøven overført til DNA-Chip; i trin 3 er InvaderPlus® (PCR og Invader® reaktionen kontinuerligt i det samme rør) gennemførte; i det sidste trin, AMDS rapporterer en genotype resultat af prøven. InvaderPlus® blev udført under følgende betingelser: denaturering i 2 minutter ved 93 ° C, efterfulgt af 30 eller 35 cyklusser af 31 sekunder ved 93 ° C og 16 sekunder ved 66 ° C, og Taq polymerase deaktivering i 2 minutter ved 97 ° C efterfulgt af 10 minutters signaldetektering ved 61 ° C. Fluorescenssignal af FAM (Fluorescens aminohexyl) blev overvåget i kanal F1 ved 520 nm med excitation af 490 nm, og fluorescens-signal af RED (Redmond rød) blev overvåget i kanal F2 ved 595 nm med excitation på 580 nm.

(A), (B) AMDS systemet (DNA-chip, DNA oprensning patron og udtænke) (C) Assay strøm af AMDS. (D) Princippet om Invader® kemi (E) genotype algoritme AMDS. EP: Endepunkt tid, JP: At dømme punkt tid, FNT: Fluorescence styrke Negativ tærskel, F (EP): Fluorescens styrke ved EP, F (JP): Fluorescens styrke ved JP, SR: Signal ratio, RPT: Positiv tærskel forholdet .

DNA-chip og DNA Purification Cartridge

Alle DNA-chips og DNA rensning patroner blev fremstillet i et rent rum på niveau med ISO klasse 8. Nødvendige reagenser blanding (1,99 pi ) for en DNA-chip indeholdende 0,1 pi 1 M MOPS-buffer (pH 7,7) (DOJINDO Laboratories, Kumamoto, Japan), 0,05 pi 10 mM hver deoxyribonukleosid-triphosphat (Roche, CA, USA), 0,96 pi 1 M trehalose (Hayashibara , Okayama, Japan) vandig opløsning, 0,60 pi 20 × oligo mix, 0,22 pi 5,0 U /pl Hawk Taq polymerase (Roche, CA, USA), 0,04 pi 15.000 U /pl Cleavase (Hologic, WI, USA) var dispenseres og tørres i brønde i en DNA-chip. 20 × oligo-blanding blev fremstillet med 0,06 pi 100 uM fremadrettet primer, 0,06 pi 100 uM revers primer, 0,06 pi 50 pM af FAM-FRET (Fluorescensresonansenergioverførsel) kassette (Hologic, WI, USA), 0,06 pi 50 uM RED-FRET kassette (Hologic, WI, USA), 0,06 pi DW (Destilleret vand: Lonza, Basel-Stadt, Schweiz), og et sæt af 0,06 pi 10 pM invaderende oligonucleotid plus 0,06 pi 100 pM allel probe for både vildtype og mutant type. Oligonukleotidsekvenser anvendt i denne undersøgelse er vist i tabel S1.

Nukleinsyre blev oprenset under anvendelse af en DNA-oprensning patron indeholdende et glasfilter. DNA er adsorberet til silica i nærvær af et chaotropt salt [24], [25]. Efter rensningsprocessen, 270 pi DNA-prøve indeholdende MgC

2 (6,25 mM) og NaCl (15 mM) blev injiceret i DNA-chip.

Princippet om InvaderPlus® assay for Mutation Detection

InvaderPlus® er Invader® kemi-baserede (figur 1D) mutation påvisningsassay, hvori PCR og Invader reaktionen udføres konsekutivt i enkelt rør. Efter PCR-amplifikation trin DNA-polymerase varmeinaktiveret, og Invader® reaktionen detekterer mutation i PCR-produktet. Invaderende oligo nucleotid og allel probe binder til PCR-produktet danner invasiv spaltningsstruktur (1). Hvis sekvensen af ​​allel-proben er fuldt matchet med PCR-produktet, Cleavase® skærer sonden forårsager frigivelsen af ​​armen. Den frigivne arm binder til den komplementære sekvens af FRET kassetten. Endelig Cleavase® skærer et FRET kassette, og adskiller fluorescens farvestof modificeret nukleotid (F) fra den resterende FRET kassette, som indeholder quencher (Q) ved 3′-enden. Disse reaktioner cykluser, og forårsage signal forstærkning. Tværtimod når sekvensen af ​​proben har en base mismatch med PCR produktet ved dets 5′-ende, hvor de invaderende oligo nucleotid og allel probe har én base overlappende struktur, kan Cleavase® ikke skære allel probe. Som følge heraf tager den deraf reaktionen ikke finde sted, og FRET kassetten er intakt (2). To FRET kassetter skelnes ved anvendelse af forskellige fluorescerende farvestoffer.

Algoritme genotypning

Princippet og rutediagram af genotypebestemmelse ved AMDS er vist i figur 1E. Når Invader® analysen er færdig, den genotype software sammenligner fluorescerende signal styrke ved EP (slutpunkt tid) beskrevet som F (EP), og FNT (fluorescerende styrke negativ tærskel). Hvis F (EP) er mindre end FNT prøven betragtes som negativ (

e, g

, Prøve D) for mutationen. Hvis F (EP), ikke er mindre end FNT, så dens signal forholdet (SR), der er angivet ved den følgende ligning, beregnes.

SR repræsenterer en reaktion effektivitet Invader® assay. Hvis SR af en prøve er større end RPT (Ratio Positiv Threshold), er prøven betragtes som positivt for den specifikke mutation (

f.eks

. Prøve A og B), men hvis ikke, er prøven betragtes som negativ (

f.eks

prøve C). Hver RPT for alle mutationer detekteret i denne kliniske undersøgelse blev defineret med 5% mutant 95% vildtype blanding plasmid-DNA (Tabel S2.).

Direkte Sequencing (DS)

For DS blev følgende primere anvendt til at amplificere

KRAS

gen: 5′-GAATGGTCCTGCACCAGTAA-3 ‘(F: Forward primer), 5′-GTGTGACATGTTCTAATATA GTCA-3’ (R: Reverse primer),

BRAF

gen: 5′-TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG-3 ‘(F), 5’AGCATCTCAGGGCCAAAAAT-3’ (R) og

PIK3CA

gen: 5′-ATGATGCTTGGCTCTGG AAT-3 ‘(F), 5 ‘-GGTCTTTGCCTGCTGAGAGT-3’ (R). Længden af ​​hvert PCR-produkt var

KRAS

: 214 bp,

BRAF

: 228 bp,

PIK3CA

ex9: 269 bp og

PIK3CA

ex20: 273 bp. PCR-produkter blev cyklus-sekventeret ved anvendelse af Big farvestof terminator v1.1 /3.0 cyklus-sekventeringskit (Life technologies, CA, USA) ifølge producentens instruktioner. Sequence reaktioner blev derefter udsat for elektroforese på en Applied Biosystems 3730 × l DNA Analyzer (Life technologies, CA, USA).

Titrering Study hjælp plasmid-DNA og Genomisk DNA

For at vurdere afsløring mutationen følsomhed AMDS blev en titrering undersøgelse af plasmid-DNA udført. Titrering prøver (mængden af ​​plasmid-DNA: 1 fg /brønd, 10 fg /brønd og 100 fg /brønd) blev fremstillet som vist i figur 2A. Prøveblandingerne indeholdt 30 pi plasmid-DNA, 12 pi 500 mM NaCl, 18 pi 100 mM MgCl

2, og 240 pi D.W. Hvert plasmid-DNA-prøve indeholder 100 ng /brønd af laksetestikel enkeltstrenget DNA (Sigma-Aldrich, MO, USA). Desuden blev bidraget fra baggrunden signal kontrolleres med Novagen® human kvindelig genomisk DNA (EMD biosiences, CA, USA) (1 ng /brønd, 10 ng /brønd og 100 ng /brønd).

(A ) Plasmid-DNA titrering undersøgelse. Plasmid DNA blev konstrueret for alt 13 forskellige mutanter og 6 vildtype (

KRAS

: 1,

BRAF

: 1,

PIK3CA

: 2). (B) Klinisk ydeevne undersøgelse. 70 FFPE skiver væv og 89 Frosne skiver væv blev testet. Genomisk DNA blev ekstraheret fra FFPE skiver væv ved Epicentre® QuickExtract ™. Genomisk DNA blev oprenset fra frosne skiver væv ved QIAamp® DNA Micro kit. Også, som er omgivet af punkterede linjer, var ca. 1 mg af frosset skiver væv homogeniseres og anvendes til fuldautomatisk mutationsanalyse. (C) Titrering undersøgelse af

KRAS

G13D mutation afsløring af DS. Elektroferogrammerne blev udtaget til forskellige mutant-vildtype blanding af plasmid-DNA (10 fg /reaktion). (D) Titrering undersøgelse for

KRAS

G13D mutation afsløring af AMDS. Grafen viser de fusionerede InvaderPlus® reaktion data (n = 3) for forskellige mutant-vilde blanding for

KRAS

G13D påvisning af AMDS (◊; mt 100%, ○; mt 50%, △; mt 25% , Υ; mt 5%, *; mt 1%, +; 0,5% og ×; mt 0%). Mængden af ​​plasmid-DNA var 10 fg /brønd. (E) elektroferogram af forward og revers analyse af samme prøve (ID = 56.754). (F) InvaderPlus® reaktion af en prøve (ID = 56.754) ved AMDS.

Klinisk ydeevne Study

Det eksperimentelle design til den kliniske ydeevne studie af AMDS er vist i figur 2B . Genomisk DNA fra frosne specimen sektioner (n = 89) blev ekstraheret og oprenset ved QIAmp® DNA Micro (Qiagen, CA, USA), og justeret til 10 ng /pl. Prøven fyldes på DNA-chip indeholdt 30 pi 10 ng /pl genomisk DNA, 12 pi 500 mM NaCl og 18 pi 100 mM MgCl

2, og 240 pi D.W. Genomisk DNA fra FFPE sektioner (n = 70) blev ekstraheret ved hjælp af QuickExtract ™ FFPE DNA Extraction Kit [Epicentre® (en Illumina® selskab), WI, USA] i henhold til producentens anvisninger, og forberedt som en x 50 fortynding prøve. Loading prøve for DNA-chip indeholdt 30 pi udvundet DNA (× 50 fortynding), 12 ul 500 mM NaCl, 18 pi 100 mM MgCl

2, 240 pi DW

Kloning analyse

Kloning analyse blev udført for prøver (n = 14), som havde disharmonisk mutationsstatus mellem AMDS og DS. Indsæt længder af PCR-produkter var 214 bp (

KRAS

), 228 bp (

BRAF

), 269 bp (

PIK3CA

ex9) og 273 bp (

PIK3CA

ex20). Primersekvenserne er vist i tabel S3. PCR-produkter blev fremstillet ved anvendelse af GoTaq® DNA-polymerase og PrimeSTAR® GXL-DNA-polymerase. PCR-produkter blev spaltet med restriktionsenzym, og fragmenterne blev indsat til pUC118 /Hincll og pMD19 /EcoRV. Indsatte kloner blev genkendt af blå-hvid-screening. Plasmid DNA blev forstærket af ILLUSTRERET TempliPhi DNA Amplification Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, England). DS blev udført af Applied Biosystems 3730 × l DNA Analyzer.

Fuldautomatisk somatiske mutationer Detection af AMDS

Ca. 1 mg af frosne eksemplar sektioner (n = 41) blev homogeniseret i 20 sekunder ved glas homogenisator og 200 pi DW blev tilsat. Homogenatet blev overført til DNA oprensning patron af AMDS, og fuldautomatisk mutation afsløring proces til

KRAS

PIK3CA

mutationer blev gennemført. De frosne prøver, som nærede

BRAF

V600E mutation blev ikke inkluderet i denne undersøgelse på grund af den begrænsede mængde DNA.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev gennemført for statistisk styrke og κ koefficient test [26], der blev brugt til at sammenligne forekomsten og graden af ​​konkordans i påvisning af

KRAS

,

BRAF

PIK3CA

mellem DS og AMDS.

Resultater

Sammenligning Mutation Detection følsomhed mellem aMDS og DS i plasmid-DNA Titrering Study

for at vurdere følsomheden af ​​aMDS, vi brugte serielt fortyndede plasmid DNA, der indeholder forskellige nøgletal af mutant og vildtype af

KRAS

,

BRAF

og

PIK3CA

gener. Når prøven indeholdt mindre end 25% af mutant DNA, mutationen højdepunkt i DS elektroferogram var ikke i stand til at adskilles fra baggrunden (Figur 2C). I modsætning hertil AMDS klart opdaget

KRAS

G13D mutationer ved et 5% niveau (maksimum 0,5%) som vist figur 2D.

Sammenligning følsomhed Mutation Detection mellem AMDS og DS i kliniske ydeevne Study

mutationen detektionsegenskaber blev sammenlignet mellem AMDS og DS med to sæt prøver; friske frosne væv (n = 89) og FFPE prøver (n = 70) fra patienter (n = 153) med CRC. Parrede frosne og FFPE prøver var tilgængelige for seks patienter, og resten af ​​prøverne var fra uafhængige patienter. Sammenligningen blev udført i en dobbelt-blindet måde. Som vist i tabel 1-3, alle

KRAS

,

BRAF

PI3KCA

mutationer detekteres af DS i enten frosne (samlet antal mutation, n = 41, 46,0 %) eller FFPE (n = 27, 38,5%) prøver blev også med held (100%) påvist ved AMDS. Der var ingen prøver, der blev bestemt som mutanter i DS, mens detekteres som vildtype i AMDS. I de detekterede som vild-typer efter DS prøver imidlertid AMDS kunne detektere yderligere mutanter i den frosne (n = 8, 9,0%) og FFPE (n = 6, 8,6%) prøver. Som vist i tabel 4, mutationer i både

KRAS

PIK3CA

blev detekteret ved AMDS i 6 patienter (6/153, 3,9%). Især blandt disse sameksisterende mutationer, alle

PI3KCA

mutationer var specifikt E545K, mens

KRAS

mutationer varieret. |

Resultater DS og AMDS for et uharmonisk eksempel er vist i figur 2E og 2F. Denne prøve blev plausibelt bestemt som en mutant i henhold til DS kun med fremad primer analyse. Grundet dårlig sekventering signal i revers primer analyse blev denne prøve anses som en vildtype. I modsætning hertil AMDS havde en klar mutation signal. Alle andre uoverensstemmende resultater (8 i frosne væv, 6 i FFPE væv) havde meget lignende mønstre (data ikke vist).

Validering af uharmoniske data ved Kloning og sekventering

Alle prøver, der havde disharmonisk mutationsstatus mellem AMDS og DS blev valideret ved kloning analyse (figur 3A, B). Nøjagtigheden af ​​kloningen blev også evalueret med fejlprocent (ER) defineret som hyppigheden af ​​basen ændringer i det indsatte område blandt de plukkede kolonier som følgende ligning; ER = antallet af ændringer /[(længde insert) × (antal vellykkede klon sekvens)] x 100. De analyserede klonede regioner ikke har et hot spot for andre end målrettede punkter mutation. Derfor basen ændringer fra konsensussekvens blev betragtet som misreadings af DNA-polymerase. ER af PrimeSTAR® GXL (0,03-0,06%), der har 3 ‘→ 5’ exo-nukleaseaktivitet, var betydeligt lavere end den for GoTaq® (0,16-0,29%). Hyppigheden af ​​alle mutationer af interesse (figur 3A, B) var meget højere end ER (

s

= 1.04 × 10

-6), hvilket indikerer, at mutationer i disse prøver var sande mutationer, og uoverensstemmelse mellem de to metoder blev tilskrevet den lavere følsomhed af DS. I denne undersøgelse, prøve størrelse var god nok, da høj grad af magt i

KRAS

,

BRAF

PIK3CA

mutation detektion (

P

= 0,96, 0,97 og 0,94 henholdsvis) ved AMDS (tabel 1-3). K koefficient test af

KRAS

,

BRAF

PIK3CA

(κ = 0,91, 0,67 og 0,70 henholdsvis) mutationer angivet lav grad af sammenfald mellem AMDS og DS.

(A) Kloning analyseresultat af frosne væv. (B) Kloning analyseresultat af FFPE væv .; PCR blev udført for frosset ID = 56756, ID = 63.440 og FFPE ID = 41.947, ID = 7053306 prøver med PrimeSTAR® GXL DNA-polymerase. Andre prøver blev udført PCR med GoTaq® DNA-polymerase. Potentiel mutationsfrekvens i en prøve = (antal mutant sekvens) /(antal vellykket sekvens). Hvis frekvensen var højere end ER, blev prøven betragtet som mutation positiv. Bemærk: Det blev ikke bekræftet, om mutation på en prøve kunne kvantificeres ved kloning analyse. (C) Venn-diagram af

KRAS

,

BRAF

og

PIK3CA

mutationer. I denne graf er disse frekvenser af mutation ikke beregnet for prøver, men for patienter. 6 prøver blev taget fra samme væv og forberedt til både frosne og FFPE skive. Den AMDS analyser for disse 6 prøver viste samme resultater for både Frosne og FFPE skive.

Figur 3C opsummerer hyppigheden af ​​mutationer hos alle patienter (n = 153) baseret på AMDS detektion. Mutation satser

KRAS

,

BRAF

PIK3CA

var 28,7% (44/153), 2,5% (4/153) og 10,1% (16/153) , henholdsvis. Hyppigheden af ​​sameksisterende mutationer i

KRAS

eller

PIK3CA

var 3,9% (6/153).

AMDS og DS blev sammenlignet for deres robusthed i mutation afsløring fra DNA-prøver fremstillet ved hjælp af forskellige metoder. Qiagen kommercielle DNA oprensningskit (QIAmp® DNA Micro kit) blev anvendt med frosne væv, og en anden kommerciel DNA-ekstraktion kit (Quick Extract ™) blev anvendt med FFPE væv. Genotypning takster for DS var 100,0% (89/89) og 74,3% (52/70) i ​​frosne og FFPE prøver, henholdsvis for første forsøg; mens den for AMDS var 100,0% for begge prøvesæt. Figur 4A viser et tilfælde af G13D mutationsdetektion, hvor prøven blev taget fra den samme patient og behandles i både frosset og FFPE skiver. Mens den frosne prøve har en klar elektroferogram viste FFPE prøve støjende signaler. Atten prøver blev testet igen for DS, og 10 af disse lykkedes. Imidlertid 8 prøver var ikke i stand til at blive analyseret i både fremad og bagud efter flere forsøg. Ud af disse 8 prøver, kunne 7 prøver ikke analyseres for

BRAF

mutationer, og en prøve kunne ikke analyseres for både

KRAS

og

PIK3CA

mutationer. I modsætning hertil AMDS perfekt kaldes disse prøver som vildtype for

KRAS

,

BRAF

og

PIK3CA

gener.

CRC væv blev forberedt til både frosne og FFPE format. Disse prøver blev analyseret ved både DS og AMDS. DS undladt at kalde genotypen af ​​FFPE væv grundet støjende electrophenogram. Den samme prøve blev re-sekventeret og kaldte som

KRAS

vildtype. (B) AMD analyseresultater med forskellig totale mængde plasmid-DNA. Udfyldte symboler (•; 100 fg /brønd, ▪; 10 fg /brønd, ▴; 1fg /brønd) angiver signal af prøver indeholdende 5% mutant, og tomme symboler (○; 100 fg /brønd, □; 10 fg /brønd, △; 1 fg /brønd) indikerer g plasmid-DNA groft indeholde 210 kopier. (C) AMD analyseresultater med forskellige mængder af vildtype-genomisk DNA. (○; 100 ng /brønd, □, 10 ng /brønd, △; 1 ng /brønd).

robusthed mutation opdagelse for en bred vifte af prøvernes koncentrationer blev også testet for AMDS. Figur 4B viser resultatet af plasmid-DNA’et eksperimentet. 5% af mutant-DNA-signal havde klar adskillelse fra baggrunde for intervallet 1 fg /brønd til 100 fg /brønd af totalt plasmid-DNA, hvilket svarer til 10 kopier til 1000 kopier af mål-mutant DNA pr reaktion. Kopitallet af 1 fg /brønd plasmid-DNA (210 eksemplarer) svarer til 0,63 ng /brønd af genomisk DNA. Mængden af ​​genomisk DNA (ekstraheret frosset væv) anvendes i den kliniske ydeevne undersøgelsen var 10 ng /brønd, og som falder i området fra ovennævnte eksperiment. Men for at kontrollere signalniveauet baggrund, blev udført yderligere eksperimenter med adskillige mængder humant genomisk DNA. Figur 4C viser, at baggrundssignaler er stabile og næsten identisk med plasmid-DNA’et eksperimentet (figur 4B) for området fra 1 ng til 100 ng per brønd.

forundersøgelse af en fuldt automatiseret

KRAS

,

BRAF

PIK3CA

Mutation Detection af AMDS

i dette eksperiment, rå udvinding af frosne vævsprøver (n = 41) blev udført ved manuel knusning , og den rå homogenat blev derefter anvendt som en prøve til fuldautomatisk mutationsanalyse af AMDS.

resultaterne af den fuldautomatiske mutationsanalyse var helt overensstemmende med de tidligere kliniske udførelsesstudier (tabel 5). Desuden AMDS kunne påvise alle mutanter (3/41), som DS ikke kunne detektere. Således kunne AMDS opdage alle

KRAS

(14/41, 34,1%) og

PIK3CA

(8/41, 19,5%) mutationer selv fra disse homogenatet prøver (~ 1 mg væv).

diskussion

Denne undersøgelse evaluerede AMDS i to serier (Frosne og FFPE) af primære CRC væv i alt 159 prøver. Vore data antydede AMDS har større følsomhed og alsidighed end DS. Den overlegne evne vores system kan tilskrives den høje følsomhed ( 0,5%) og troskab af Invader® kemi, der indeholder signal forstærkning kapacitet [22], [23]. Dette er af særlig betydning for mutationsdetektering når mutant niveau er meget lav. De i fig 4B og 4C resultater tyder AMDS kan opretholde en 5% mutationsdetektion følsomhed med en meget bred vifte (100 holder) af koncentrationen prøven. Desuden Kotoura

et al

. tidligere rapporteret, at PCR effektivitet DS og real-time PCR assay på FFPE-DNA-prøver er påført DNA-fragmentering [27]. Som vist i figur 3 og figur 4A, blev resultaterne af mutationsanalyse via AMDS støttes af klonings- resultater, og amdS viste en signifikant overlegenhed til DS i dens følsomhed over den brede vifte af DNA mængde og variation af fiksering tilstand.

Derudover aMDS systemet lykkedes en fuldt automatiseret påvisning af

KRAS

,

BRAF

PIK3CA

mutationer med homogeniserede frosne CRC prøver, hvilket er fordelagtigt for at analysere værdifulde prøver, såsom biopsi væv. Proceduren Mutationen påvisning af AMDS er meget enkel og kræver ikke eksperimentel teknik og erfaring.

Et af de vigtigste ting er, at i kloning analyse, vi observeret, at almindeligt anvendte kommercielle Taq DNA-polymerase har en Not- så lavt eR, mens PrimeSTAR® GXL-DNA-polymerase med en 3 ‘→ 5’ exo-nukleaseaktivitet (korrekturlæsning) har mindre eR. Derfor, når ultra høj følsomhed er påkrævet for et assay, såsom mutation påvisning af cellefri DNA i blodprøver (serum eller plasma), bør der anvendes high fidelity DNA polymerase.

Som resultat af evalueringen for den kliniske CRC væv (n = 159) ved hjælp AMDS, mutation mønstre detekteret i vores prøver er meget i overensstemmelse med, hvad der tidligere har rapporteret [28] – [30]. Vi observerede meget interessant sameksistens af multiple mutationer blandt de tre gener. For eksempel, 6 ud af 153 prøver (3,9%) havde dobbelt (en for triple) mutationer, støtte hypotesen om synergistisk tumorigenese mellem

KRAS

PIK3CA

[29], [31] . Desuden var der to prøver, som besad begge

KRAS

G13D og

PIK3CA

(E545K og /eller E542K) mutationer.