PLoS ONE: Øget Opløselig CD155 i Serum of Cancer Patients

Abstrakt

Nye beviser tyder på, at dNAM-1 (CD226) spiller en vigtig rolle i anerkendelsen af ​​tumorceller og deres lyse med cytotoksiske T-lymfocytter ( CTL) og NK-celler. Selvom dNAM-1-ligand CD155 ubikvitært udtrykkes i forskellige væv, mange humane tumorer signifikant opregulere ekspressionen af ​​CD155; DNAM-1 på CTL og NK-celler kan være involveret i tumor-immunitet. Men i modsætning til dem i mus, humant væv udtrykker, også opløselige isoformer af CD155 (sCD155), der mangler den transmembrane region. Her viser vi, at sCD155 niveauer signifikant højere i sera fra 262 patienter med lunge-, mave-, bryst- og gynækologiske cancere end i sera fra raske donorer. Derudover sCD155 niveauer signifikant højere hos patienter med tidlig fase (trin 1 og 2) gastric cancer end hos raske donorer, og var signifikant højere hos patienter med fremskredent stadium (trin 3 og 4) sygdom end hos patienter i dem med tidlig stadie sygdom og raske donorer. Desuden blev de sCD155 niveauer faldt betydeligt efter kirurgisk resektion af kræft. Således kan sCD155 niveau i serum være potentielt nyttig som en biomarkør for cancer udviklingen og progressionen

Henvisning:. Iguchi-Manaka A, Okumura G, Kojima H, Cho Y, Hirochika R, Bando H, et al. (2016) Øget Opløselig CD155 i Serum af kræftpatienter. PLoS ONE 11 (4): e0152982. doi: 10,1371 /journal.pone.0152982

Redaktør: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, JAPAN

Modtaget: August 24, 2015; Accepteret: 22 marts 2016; Udgivet: April 6, 2016

Copyright: © 2016 Iguchi-Manaka et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne forskning blev delvist understøttet af tilskud fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (Grant nummer 26.861.038, 24.249.021 og 25114701 til AI-M, AS, og KS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Immun overvågning af tumorer undertrykker kræft udvikling for at beskytte værten. Centrale aktører i cellemedieret immunitet mod tumorer, cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) og NK-celler [1, 2], mediere tumor anerkendelse og aktivering gennem deres antigenreceptorer og en række adhæsion og costimulerende molekyler [2, 3]. Interaktioner af celleoverfladereceptorer med deres ligander udtrykt på tumorceller inducerer cytotoksiske aktivitet af CTL og NK-celler mod tumorer [4].

dNAM-1 (CD226) er et medlem af immunglobulin-superfamilien og udtrykkes på NK celler, T-celler, monocytter, makrofager og blodplader [5, 6]. Dets ligander hos mennesker og mus er poliovirus receptor CD155 og dets familiemedlem CD112 (PPR-2 [PVR-relaterede familie 2], også kaldet nectin-2) [7-9]. Humant CD155 og CD112 er bredt fordelt på epitel- og endotelceller i mange væv [10, 11]; især er de overudtrykt på forskellige tumorer, herunder kolorektal [12, 13], gastrisk [12] og ovariecancer [14]; neuroblastom [15]; myeloide leukæmier [16]; myelomatose [17]; og melanom [18]. Interaktioner mellem CD155 og CD112 på tumorceller og dNAM-1 på NK og T-celler forøge cellemedieret cytotoksicitet og cytokinproduktion [7, 8]; DNAM-1 er sandsynligvis involveret i immunitet mod CD155- og CD112-udtrykkende maligne tumorer. Faktisk i en model for kemisk inducerede tumorer i dNAM-1-deficiente mus, dNAM-1 er vigtig for immunovervågning mod CD155-udtrykkende tumorer [19]. Derfor CD155 på tumorer er afgørende for dNAM-1-medieret tumor immunitet.

Men udover membranbundet CD155 (mCD155, CD155α), humane væv (modsætning til dem i mus) udtrykke opløselige CD155 (sCD155 ) (CD155β og CD155γ) kodes af splejsning isoformer af

CD155

der mangler det transmembrane område [20, 21]. Her har vi undersøgt serumniveauer af sCD155 i 262 patienter med variable kræftformer og vise, at sCD155 kan være nyttig som en biomarkør for kræft udvikling og progression.

Materialer og Metoder

Cellelinjer

Vi brugte følgende humane cellelinjer opnået fra ATCC: HeLa (cervikal karcinom), HOS (osteosarkom), RD (rhabdomyosarcoma), U87MG (gliom), Jurkat (T-celle leukæmi), og Colo 205 (kolorektal karcinom) . Metha (methylcholanthren-induceret sarkom fra BALB /c mus) blev tilvejebragt af Dr. Eiichi Nakayama (Okayama University).

Prøver

Vævsprøver blev opnået fra primære cancer patienter, som gennemgik kirurgisk resektion på University of Tsukuba Hospital, Japan. Serumprøver blev opnået fra patienter primære cancer ved University of Tsukuba Hospital og Ibaraki Prefectural Central Hospital, Japan, og fra raske frivillige. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter og raske forsøgspersoner. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité ved University of Tsukuba og Ibaraki Prefectural Central Hospital (godkendelsesnummer 531-5 og 307). Sygdom etape blev klassificeret ifølge The Union for International Cancer Control (UICC) TNM klassifikation af maligne tumorer.

Mus

BALB /c mus blev købt fra Charles River (Yokohama, Japan). Alle mus blev opstaldet og opdrættet under specifikke patogenfrie forhold på Animal Resource Center ved University of Tsukuba. Eksperimentelle mus blev anvendt ved 7-10 ugers alderen. Alle forsøg med mus blev godkendt af dyreforsøg udvalg af University of Tsukuba (Godkendelse nummer 09-390 og 10-237) og udføres i henhold til retningslinjerne fra dyreforsøg udvalg fra University of Tsukuba.

PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra cellelinier og væv med Isogen reagens (Nippon Gene). For RT-PCR, vi brugte High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems). PCR-analyse af

CD155

splejsningsvarianter blev udført som tidligere beskrevet [21].

Kvantitativ realtids-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra væv ved hjælp af Isogen reagens ( Nippon Gene). QRT-PCR-analyse af

CD155

splejsning varianter blev udført med TaqMan genekspression Analyser (Applied Biosystems) og Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System. Vi brugte følgende TaqMan Gene Expression Analyser: Hs1050633_m1 (

CD155α

), Hs1050636_m1 (

CD155γ

), og Hs99999903_m1 (

ACTB

). For

CD155β

, vi brugte brugerdefinerede TaqMan Gene Expression Analyser med følgende primere og reporter: fremad primer 5′-AAAGAGGGACCTCCCAGTGA-3 ‘, revers primer 5′-GAATAGGAGACATGCCCATTAGCT-3′, og reporter 5’-CACTCAGGTACAGAGCATG- 3 ‘. Ved at bruge en Agilent 2100 Bioanalyzer analyserede vi kvaliteten af ​​total RNA for QRT-PCR for en RNA integritet nummer 7. Alle værdier blev bestemt tre gange.

ELISA for humant opløseligt CD155

sCD155 niveauer i sera blev målt ved sandwich-ELISA under anvendelse af muse-anti-humant CD155 mAb (TX24) og kanin-anti-humant CD155 polyklonalt Ab (pAb) som indfangning og påvisning Abs henholdsvis efterfulgt af HRP-bundet anti-kanin IgG (GE Healthcare) og QuantaBlu fluorogene peroxidasesubstrat (Pierce Biotechnology). Sort 96-brønds plader (Greiner Bio-One) blev coatet med muse-anti-humant CD155 mAb (TX24, 2 ug /ml blokeringsbuffer, 100 pl /brønd) i indfangning natten over ved 4 ° C, blokeret med blokerende buffer (10% FBS, 200 pl /brønd) i 1 time ved stuetemperatur og vaskes tre gange med vaskebuffer (0,05% Tween 20). Human CD155-Fc-fusionsprotein (som standarder) og serumprøver blev udpladet ved 100 pl /brønd, inkuberet i 1 time ved stuetemperatur og vasket med vaskebuffer. Efter inkubering under de samme betingelser med 100 pi kanin-anti-humant CD155 pAb (5 ug /ml i blokeringsbuffer), vaskedes pladerne inkuberet under de samme betingelser med 100 pi anti-kanin IgG-HRP (1: 2000 i vask puffer), vasket og omsat med 100 pi QuantaBlu arbejdsopløsning (Pierce Biotechnology) i 30 minutter ved stuetemperatur. Vi stoppede reaktionerne med 100 pi QuantaBlu Stop Solution (Pierce Biotechnology) og målte den relative fluorescens enhed (RFU) af hver brønd ved bølgelængder på 320 nm for excitation og 420 nm for emission ved anvendelse af en Spectra Max M2e reader (Molecular Devices). Alle værdier blev bestemt tre gange. Den muse-anti-humant CD155 mAb (TX24) og human CD155-Fc-fusionsprotein blev dannet i vores laboratorium som beskrevet tidligere [8]. Kanin-anti-humant CD155 pAb blev genereret i vores laboratorium ved standardmetoder.

Etablering af Metha transfektant udtrykkende muse sCD155 Salg

cDNA kodende ekstracellulære region af muse CD155 blev subklonet ind i p3 × FLAG -CMV-13 ekspressionsvektor (Sigma-Aldrich) og transduceres ind Metha celler til at generere transfektant stabilt udtrykker FLAG-mærket sCD155 vha DMRIE-C-transfektionsreagens (Invitrogen). Den transfektant blev udvalgt af G418 (Sigma-Aldrich) og passeret i bughulen af ​​mus.

ELISA for mus CD155-3 × FLAG fusionsprotein

FLAG-mærket sCD155 i muse-ascites og serum blev målt ved sandwich-ELISA under anvendelse af et rotte-anti-muse-CD155 mAb (TX56) og muse anti-FLAG BioM2 mAb (Sigma-Aldrich) som opsamling og påvisning mAb’er henholdsvis efterfulgt af streptavidin-HRP-konjugat (GE Healthcare) og QuantaBlu fluorogent peroxidasesubstrat (PIERCE). Sort 96-brønds plader (Greiner Bio-One) blev coatet med rotte-anti-muse CD155 mAb (TX56, 2 ug /ml i blokeringsbuffer (10% FBS i PBS), 100 pl /brønd) natten over ved 4 ° C, behandlet med blokerende buffer (200 pi /brønd) i 1 time ved stuetemperatur og vaskes tre gange med en vaskepuffer (0,05% Tween 20). Prøver blev udpladet med 100 uL /​​brønd, inkuberet i 1 time ved stuetemperatur og vasket med vaskepufferen. Efter inkubering under de samme betingelser med 100 pi anti-FLAG BioM2 (Sigma-Aldrich, 1 ug /ml blokeringsbuffer) blev plader inkuberet under de samme betingelser med 100 pi streptavidin-HRP (GE Healthcare, 1: 2000 vaskepuffer ), vasket og omsat med 100 pi QuantaBlu arbejdsopløsning (Pierce Biotechnology) i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter standsning reaktionerne med 100 pi QuantaBlu Stop Solution (Pierce Biotechnology), målte vi relative fluorescensenheder af hver brønd ved bølgelængder på 320 nm for excitation og 420 nm for emission ved anvendelse af en Spectra Max M2e (Molecular Devices). Alle værdier blev bestemt tre gange. Rotte-anti-muse CD155 mAb (TX56) blev dannet i vores laboratorium som beskrevet tidligere [8].

tumorvækstassay

Mus blev inokuleret subkutant i ryggen med 8 × 10

4 sCD155-Metha celler. Mus blev overvåget for tumorstørrelse (den lange (L) og korte (S) dimensioner) ved anvendelse calipre gang om ugen, og tumorvolumener blev beregnet med ligningen: volumen = (L × S

2) /2, som tidligere beskrevet [22]. Mus blev aflivet ved CO2 eller anæstesi efter afslutningen af ​​forsøget.

Statistik Salg

Statistiske analyser blev udført ved anvendelse af den tosidede Wilcoxon Rank Sum og den tosidede Student t-test .

Resultater

Angivelse af CD155α og CD155β i tumorvæv var højere end i ikke-tumorvæv

Selvom sCD155 er stærkt udtrykt i tarmkræft [12], dens ekspressionsprofil i andre cancere er uklar. Ved RT-PCR, vi analyserede udtryk for

CD155

mRNA i flere tumorcellelinier og primær livmoderhalskræft, æggestokkene og livmoderkræft; alle cellelinjer og kræft udtrykkes både membranbundne (

CD155α

) og opløselig (

CD155β

og

CD155γ

)

CD155

mRNA (Fig 1). Derefter, ved kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR), sammenlignede vi ekspressionen af ​​

CD155

isoformer blandt tyktarm, mave og brystcancere og deres tilgrænsende ikke-tumorvæv; udtrykkene for

CD155α

og

CD155β

, men ikke

CD155γ

, var signifikant højere i kræftformer end i de ikke-tumorvæv (P 0,05) (Fig 2).

PCR blev udført under anvendelse af primersæt placeret på hver side af de forskellige splejsningssteder. Tre bands af forudsagte størrelser (α: 273 bp, Ø: 138 bp, y: 114 bp) er observeret i PCR-produkter. mRNA for membranbundne (α) og opløselig

CD155

(β,

γ

) blev udtrykt af forskellige menneskelige kræftceller (A) og livmoderhalskræft, æggestokkene og endometriecancer væv (B ).

tumor og tilstødende ikke-tumorvæv blev taget fra kirurgisk resektion enheder af colorektal (adenocarcinom, n = 9), gastrisk (adenocarcinom, n = 4), og bryst (invasivt duktalt carcinom, n = 3) cancere. QRT-PCR af

CD155

RNA splejsningsvarianter blev udført, og folden ændring af relativ ekspression af tumorvævet versus den tilstødende ikke-tumorvæv blev beregnet. Ekspressionen af ​​membranbundet (α) og opløselig (β)

CD155

RNA i tumorvæv var betydeligt højere end for de ikke-tumorvæv (P 0,05).

sCD155 var højere i sera af kræftpatienter end i de raske donorer

Fordi udtryk for

sCD155

i kræft væv blev opreguleret etablerede vi en sandwich-ELISA til måling sCD155 (S1 fig) og kvantificeret sCD155 i sera fra 262 patienter med forskellige cancerformer, herunder lunge, esophageal, gastrisk, colorektal, galde-kanal, pancreascancer, brystcancer, ovariecancer, endometrial, og livmoderhalskræft (tabel 1). Sammenlignet med raske donorer (n = 60), sera fra cancerpatienter havde signifikant højere sCD155 niveauer (middelværdi = 15,6 ng /ml og 28,3 ng /ml henholdsvis P 0,0001) (tabel 1, fig 3A), der var ikke påvirket af patientens alder eller køn (data ikke vist). Modtageren opererer kurve illustrerer magt sCD155 niveauet til at skelne mellem kræftpatienter og raske donorer; den værdi for området under kurven var 0,718 (Fig 3B).

(A) Opløselig CD155 niveauer i sera fra raske donorer (n = 60) og cancerpatienter (n = 262) blev analyseret ved sandwich-ELISA . Sammenlignet med raske donorer, sera fra cancerpatienter havde signifikant højere sCD155 niveauer (P 0,0001). Rød bar: gennemsnit, sort bjælke: SD. (B) Modtager opererer karakteristik-kurve, der illustrerer styrken i opløselig CD155-niveau til at skelne mellem raske donorer og kræftpatienter.

I forhold til hos raske kontrolprøver, de sCD155 niveauer i sera fra patienter med hver type kræft undtagen livmoderhalskræft var signifikant højere (lunge: P 0,05, esophageal: P 0,001, gastrisk: P 0,0001, kolorektal: P 0,001, galde-kanal: P 0,0001, pancreas: P 0,0001, bryst: P 0,05, ovarie: P 0,01, endometrial: P 0,01) (tabel 1, fig 4A). Især sammenlignet med raske donorer, patienter med tidlig fase (trin 1 og 2) mavekræft havde signifikant højere sCD155 niveauer (P 0,01). Endvidere sCD155 niveauer signifikant højere hos patienter med fremskredent stadium (trin 3 og 4) gastric cancer end hos patienter i tidlige stadier (P 0,05) og raske kontroller (P 0,001) (Fig 4B). Selvom sCD155 niveauer ikke blev ændret eller endog steget i visse patienter efter kirurgisk resektion af kræft og dette kan være afhængig af hver patient med forskellige cancer, statistisk analyse for den samlede befolkning viste, at sCD155 niveauet var signifikant reduceret (P 0,05) (Fig 4C )

(A) Opløselig CD155 niveauer i sera efter de forskellige kræfttyper (lunge:. n = 52, esophageal: n = 8, gastrisk: n = 49, kolorektal: n = 12, galde-kanal : n = 25, pancreas: n = 18, bryst: n = 32, ovarie: n = 23, endometrial: n = 16, cervikal: n = 15) analyseres ved sandwich-ELISA. Rød bar: gennemsnit, sort bjælke: SD. (B) Opløseligt CD155 niveauer i sera fra mavecancerpatienter stratificeret efter sygdom fase. Stages 1 2: n = 24, iscenesætter 3 4: n = 25. (C) Opløselig CD155 niveauer i sera af kræftpatienter, der blev opereret (n = 73) blev analyseret for kræft, før og efter. Opløselig CD155 niveau faldt betydeligt efter drift. Rød plot: gennemsnit, præoperativ middelværdi: 26,529 ng /mL, postoperativ middelværdi: 22,390 ng /mL, P 0,05. Postoperative dage: 69,30 ± 61.95

sCD155 niveauer i sera var afhængige af tumorbelastning i en musemodel

Baseret på de ovenfor beskrevne resultater, vi den hypotese, at sCD155 niveauer i sera. af cancer patienter forbinder med tumorbyrde. For at løse denne hypotese, transficerede vi Metha fibrosarkom cellelinie, som udtrykte kun endogen mCD155, med en retrovirusvektor indeholdende enten cDNA, der koder den ekstracellulære del af muse CD155 eller med en mock kontrolvektor. Vi inokuleret transfektanterne (sCD155-Metha eller Mock-Metha) i bughulen hos mus og 10 dage senere, opsamlet ascites. For at kvantificere sCD155 niveau, vi etableret et ELISA-system. Selv sCD155 næppe blev påvist i ascites fra mus, som var blevet inokuleret med Mock-Metha ved ELISA, vi har registreret en betydelig mængde sCD155 i ascites fra mus, som var blevet inokuleret med sCD155-Metha (Fig 5A). Disse resultater viste, at sCD155-Metha producerede sCD155

in vivo

. Vi derefter subkutant inokuleret mus med sCD155-Metha og målt både serum sCD155 niveauer og tumorstørrelse. Vi observerede, sCD155 niveauer i sera korreleret med sCD155-Metha tumorstørrelse (Fig 5B). Disse resultater antyder, at serum sCD155 niveauer forbinder med tumorbelastning.

(A) Metha transfektant secernerende sCD155 (sCD155-Metha) eller kontrolprotein (Mock-Metha) blev inokuleret i bughulen og derefter ascites blev opsamlet. sCD155 niveauer i ascites hos mus, der var blevet inokuleret med disse transfectantss blev målt ved ELISA. (B) BALB /c-mus blev inokuleret subkutant med sCD155-Metha transfektant. Tumorstørrelse og sCD155 niveauer i serum blev målt og korrelationskoefficienten blev beregnet.

Diskussion

Selvom sCD155 blev identificeret 25 år siden [20], lidt om sit udtryk og fungere. Her viste vi, at ekspressionen af ​​sCD155 (

CD155β

) samt mCD155 (CD155

en

) mRNA i tumorvæv var betydeligt højere end i ikke-tumorvæv. Desuden patienter med forskellige typer af kræft viste signifikant højere niveauer af serum sCD155, sammenlignet med raske kontrolprøver. Desuden blev sCD155 niveauer i sera korreleret med sygdommens progression i mavecancerpatienter og tumorstørrelsen i mus. Vores resultater antyder, at sCD155 niveauer i sera fra cancerpatienter er muligvis afhængig af tumorbyrde. Foregående rapport viste, at opregulering af muse CD155 medieres af Raf-MEK-ERK-AP-1-signalering pathway [23], hvilket antyder, at ekspression af både mCD155 og sCD155 opreguleres gennem denne vej også i human, selv om yderligere undersøgelser er at bestemme, hvordan sCD155 er opreguleret i kræft. Ikke desto mindre tyder vore resultater, at serum sCD155 niveau er potentielt nyttig som en biomarkør for cancer progression.

Selvom mCD155 udtrykt på tumorer er blevet anset for at være involveret i dNAM-1-medieret tumor immunitet, modstridende resultater er blevet rapporteret . For eksempel blev overekspression af mCD155, som bestemt ved hjælp af immunhistokemisk undersøgelse ved anvendelse af anti-CD155-antistof, i lunge adenocarcinom og melanom korreleret med dårlig prognose [24, 25]. Men disse undersøgelser ikke diskriminere mellem mCD155 og sCD155. I denne undersøgelse viste vi, at ekspressionen af ​​både mCD155 (

CD155α

) og sCD155 (

CD155β

) blev opreguleret i kræft, herunder kolorektal, mave- og brystkræft, sammenlignet med ikke-kræft væv. Selv på grund af begrænset antal af hver type kræft, kunne vi ikke vurdere sammenhængen mellem ekspressionsniveauer af sCD155 (

CD155β

) mRNA i cancer væv eller serum CD155 niveauer og sygdomsprogression og prognose, højere niveauer af sCD155 i sera var forbundet med fremskredent stadium af mavekræft og tumorstørrelsen i mus.

Tidligere rapporter demonstrerede rolle opløselige form af membranreceptorer i tumor unddragelse. Membranbundne molekyler såsom NKG2D ligander MHC klasse I-relateret molekyle (MIC) og UL16-bindende proteiner (ULBPs) og Fas, der er involveret i NK-celler og CTL-medieret cytotoksicitet mod tumorer, har vist sig at blive frigivet som opløseligt former i sera fra forskellige cancerpatienter [26-30]. I modsætning CD155, er opløselige MIC og ULBPs genereret fra tumorer ved proteolytisk kaste [26, 31, 32]. Tumorer kan unddrage sig fra NKG2D-medieret immun overvågning af flere mekanismer; en af ​​dem er, at opløseligt MIC nedregulerer NKG2D ekspression [31, 33]. Foregående rapport viste, at høje niveauer af opløselig ULBP2 i sera blev forbundet med dårlig sygdom prognose i melanom patienter [27], hvilket tyder på, at opløselig ULBP2 er involveret i tumor immune skatteunddragelse.

I modsætning til NKG2D ligander, den funktionelle betydning af sCD155 i tumor immunitet er forblevet uklar. Nylige undersøgelser viste, at dNAM-1 aksjer liganden CD155 med T-celle immunoreceptor med Ig og ITIM domæner (TIGIT) eller CD96 [34, 35]. Cross-linking CD96 med plade-bundet CD155-Fc-fusionsprotein hæmmede produktionen af ​​IFN

γ

af NK-celler [36]. Endvidere CD96-defekte mus viste nedsat eksperimentelle tumormetastaser [36], hvilket antyder, at CD96 og dNAM-1 vender mod hinanden i tumor immunitet. Tilsvarende TIGIT har en modsat effekt dNAM-1 på tumor immunitet [37, 38]. At klarlægge den funktionelle betydning af sCD155 i tumor immunitet, er yderligere undersøgelser nødvendige hvordan samspillet af sCD155 med sin aktiverende (dNAM-1) og inhibitoriske (CD96 og TIGIT) receptorer og deres signalering via disse aktiverende og inhibitoriske receptorer reguleres.

Støtte Information

S1 fig. Etablering af sandwich-ELISA til sCD155. Hotel (A) Standard kurve for human CD155-Fc-fusionsprotein. (B) I en 12-brønds plade, 1 × 10

6 HeLa blev dyrket pr 1 ml medium; dyrkningssupernatanter blev opsamlet efter 24 og 48 timer for opløseligt CD155 protein afsløring

doi:. 10,1371 /journal.pone.0152982.s001

(EPS)

Tak

Vi takker Tochihara S og Nomura Y for sekretariatsbistand.