PLoS ONE: Identifikation af CD24 som kræft Stem Cell Marker i Human nasopharyngeal Carcinoma

Abstrakt

Kræft stamceller (CSCS) repræsenterer en unik sub-population af tumorceller med evnen til at initiere tumorvækst og opretholde selvfornyelse. Selv CSC biomarkører er blevet beskrevet til forskellige tumorer, har kun få markører blevet identificeret for nasopharyngeal carcinoma (NPC). I denne undersøgelse, viser vi, at CD24

+ celler isoleret fra humane NPC-cellelinjer udtrykker stamceller gener (

Sox2

,

Oct4

,

Nanog

,

Bmi-1

, og

Rex-1

), og viser aktiveringen af ​​Wnt /β-catenin-signalvejen. CD24

+ celler besidder typiske CSC egenskaber, der omfatter forbedret celleproliferation, øget koloni og sfære dannelse, vedligeholdelse af celledifferentiering potentiale i langvarig kultur, og øget modstand mod kemoterapeutiske lægemidler. Især CD24

+ celler producerer tumorer efter inokulering af så få som 500 celler i immundefekte NOD /SCID-mus. CD24

+ -celler yderligere show forøget invasion evne

in vitro

, som korrelerer med forøget ekspression af matrixmetalloproteinase 2 og 9. Sammenfattende vores resultater antyder, at CD24 repræsenterer en hidtil ukendt CSC biomarkør i NPC.

Henvisning: Yang CH, Wang HL, Lin YS, Kumar KPS, Lin HC, Chang CJ, et al. (2014) Identifikation af CD24 som kræft Stem Cell Marker i Human nasofaryngealt karcinom. PLoS ONE 9 (6): e99412. doi: 10,1371 /journal.pone.0099412

Redaktør: Masaharu Seno, Okayama University, Japan

Modtaget: Juli 4, 2013; Accepteret: 14 maj 2014; Udgivet: 23 Jun 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud NSC101-2325-B-182-005 og NSC101-2320-B-030-011 fra National Science Council of Taiwan, og give CMRPD1B0052 fra Chang Gung Memorial Hospital (Linkou, Taiwan). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

NPC incidensrater varierer i hele verden, men er størst i Sydøstasien, især i den kinesiske provins Guangdong samt i Hong Kong og Taiwan [1]. Intermediate NPC forekomst er observeret i lande i Middelhavsområdet sammen med Grønland og Alaska, mens en lav forekomst findes i de fleste vestlige lande [2]. I Taiwan var forekomsten for hunner og hanner i 2007 var 2,93 og 8.41 tilfælde pr 100.000 personer, henholdsvis [3]. NPC viser normalt relativt høj følsomhed over for stråling, og strålebehandling er således fortsat den vigtigste behandling for tidlige fase NPC [4], [5]. Selvom kombinationen af ​​strålebehandling og kemoterapi har forbedret behandlingsresultater for patienter med fremskreden fase NPC, kræft tilbagefald stadig forekommer hyppigt [6].

Identifikation og karakterisering af tumor-initierende celler, også kaldet cancer stamceller (CSCS ), har afsløret cellulære mekanismer, der kan forklare den resistens over for behandling og hvilende adfærd for mange tumorer [7]. Den progenitorcelle hypotese for udvikling af cancer tyder på, at kun en lille subpopulation af celler i en tumor (den CSCS) har stamme-lignende egenskaber og evnen til at initiere nye [8] tumorer. CSCS ikke kun iværksætte primære tumorer, men kan også være ansvarlig for tilbagefald efter behandling, et fænomen, der kan skyldes selvfornyelse kapacitet og iboende kemo- og radio-modstand af disse celler [9]. CSCS er blevet identificeret og isoleret fra forskellige tumorer ved hjælp af specifikke celleoverflademarkører, herunder CD44 for hoved- og halskræft [10], CD133 for prostatakræft [11], CD90 for levertumor [12], CD24 for ovariecancer [13], CD133 for hjernetumor [14], CD44

+ CD24

-. /lav for brystcancer [15], og CD133 for lungekræft [16]

Skønt specifikke biomarkører er blevet anvendt til at isolere CSCS, hver type tumor viser specifikke celleoverflademarkører [17]. For at isolere potentielle subpopulationer af CSCS fra tumorer, hvor der endnu ikke er blevet identificeret CSC biomarkører, har forskere udnyttet evne CSCS at udelukke farvestoffer, Hoechst 33342 eller PKH26 [18] – [20]. Ved hjælp af denne metode, har en sub-population af celler, som viser CSC karakteristika blevet identificeret i NPC [21], [22]. Imidlertid har isolering af NPC CSCS under anvendelse celleoverflade beslutningstagere ikke været muligt hidtil, med undtagelse af CD44, som blev identificeret i en tidligere rapport [23]. I den foreliggende undersøgelse, vi beskriver isolering af en sub-population af CD24

+ -celler fra to NPC cellelinier og viser, at de isolerede celler udtrykker stamcelle genmarkører. Det isolerede CD24

+ celler udviser typiske CSC karakteristika og initiere tumorvækst i ikke-obese diabetiske /svær kombineret immundefekt (NOD /SCID) mus på et lavt celleantal. Højere invasion evne og forøget ekspression af metalloproteinase 2 og 9 (MMP2 og MMP9) blev også observeret. Vores observationer tyder på, at CD24

+ celler repræsenterer en CSC biomarkør i human NPC. Disse fund kan føre til udvikling af nye terapeutiske strategier til at målrette NPC CSCS i humane patienter.

Resultater

Isolering af en sub-population af CD24

+ celler fra NPC cellelinjer

For at karakterisere celler med specifikke celleoverflademarkører, vi analyserede flere NPC cellelinjer ved hjælp af flowcytometri og monoklonale antistoffer, som genkender celleoverflade biomarkører. Vi fastsatte den procentdel af celler, der huser en af ​​12 overflademarkører specifikke for stamceller [24], [25] eller cancerceller [26] (tabel 1). CD24 blev fundet på 12.03% af dyrkede TW02 celler og på 5,45% af TW04 celler, mens det blev fundet på en lavere procentdel af celler for de øvrige NPC testede cellelinjer (tabel 1 og figur 1). Procentdelen af ​​celler, der huser de øvrige 12 markører var meget ujævn, med værdier på mellem 0 og 99,99% (Tabel 1). I overensstemmelse med en tidligere undersøgelse, hvor CD44 blev identificeret som en CSC biomarkør i NPC [23], viste vores resultater, at langt størstedelen af ​​CD24

+ -celler blev også CD44 + (figur 1). Vi fokuserede derfor vores opmærksomhed på CD24

+ celler som potentielle CSC kandidater.

Flowcytometrianalyse af CD24

+ og CD44

+ sub-populationer af TW02 og TW04 celler. 1 × 10

6 cancerceller blev opsamlet og farvet med anti-humant CD24-fluoresceinisothiocyanat (FITC) og /eller anti-humant CD44-phycoerythrin (PE) antistoffer. Isotype-matchet humane antistoffer tjente som kontrol.

Angivelse af stamceller gener og aktivering af Wnt /β-catenin vej hos CD24

+ celler

Til undersøge, om CD24

+ celler har iboende stamceller egenskaber, vi analyserede udtryk for fem embryonale stamcellelinjer gener (

Sox2

[27],

Oct4

[28] – [30] ,

NANOG

[31],

Bmi-1

[32], og

Rex-1

[33]) i TW02 og TW04 cellelinier, der blev brugt som repræsentant NPC-celler. Som angivet i figur 2A, CD24

+ celler konsekvent udtrykte højere niveauer af de fem stamcelle gener end forældre eller CD24

-. Celler

(A) mRNA ekspressionsniveauer af

Sox2

,

Oct4

,

Nanog

,

Bmi-1

og

Rex-1

i forældrenes, CD24

+ og CD24

– celler fra NPC cellelinier, TW02 (venstre) og TW04 (højre), blev evalueret under anvendelse kvantitativ RT-PCR-analyse. Resultaterne vist repræsenterede gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. *:

s

0,05, **:

s

0,01. (B) Western blotting-analyse af fosforyleret-GSK GSK, phosphoryleret-β-catenin, β-catenin og β-actin i helcellelysater, og β-catenin og lamin B1 i nukleare fraktioner af forældrenes, CD24

+ og CD24

– celler isoleret fra TW02 og TW04 cellelinjer. Kvantitativt resultat blev beregnet ved ImageJ software. *:

s

0,05, **:

s

0,01, ***:.

s

0,001

Tidligere rapporter har indikeret, at aktivering af Wnt /β-catenin signalvej er afgørende for opretholdelsen af ​​CSCS i leukæmi [34], brystcancer [35], melanom [36], kolorektal adenom [37], og leverkræft [ ,,,0],38]. Denne cellulære sti regulerer også selvfornyelse, proliferation og differentiering af cancer stamceller-lignende celler i gastrisk kræft [39]. Desuden er det i Wnt-vejen, β-catenin spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​invasion og metastase af talrige tumorer [40]. Vi undersøgte således status for Wnt /β-catenin pathway i den isolerede CD24

+ -celler. Niveauer af phosphoryleret β-catenin blev væsentligt reduceret i cytosolen af ​​CD24

+ celler, sammenlignet med forældre eller CD24

– celler (Figur 2B). Desuden niveauer af phosphoryleret glycogensynthasekinase 3β (p-GSK-3β), der virker som en negativ regulator af β-catenin, var højere i CD24

+ -celler. Samtidig hermed blev forøgede niveauer af β-catenin observeret med nukleare fraktioner af CD24

+ -celler (figur 2B), hvilket antyder, at Wnt /β-catenin-signalvejen er aktiveret i disse celler.

Udvidet proliferation og klon /sfære dannelse i CD24

+ celler

Vi målte spredning på CD24

+ celler dyrket i komplet DMEM. Sammenlignet med forældrenes og CD24

– celler, CD24

+ celler viste forbedret spredning, der begynder på 5

th dag i kultur for TW02 celler og 7

th dag for TW04 celler, med fordobling gange af omkring 42 timer, 42 timer og 30 h for forældrenes TW02, CD24- og CD24 + celler, henholdsvis og 40 h, 40 timer og 28 h for forældrenes TW04, CD24- og CD24 + celler (figur 3A). Klonen dannelse effektivitet (CFE) af CD24

+ -celler blev også bestemt. Efter 10 dages dyrkning, når de fleste kloner var sandsynligvis indeholde over 50 celler, de beregnede CFE værdier af TW02 celler var 15,1%, 80,8% og 12,2% for parental, CD24

+, og CD24

– celler, henholdsvis. For TW04 celler blev CFE værdier på 20,2%, 90,3% og 13,0% opnået for parental, CD24

+, og CD24

– celler, henholdsvis (figur 3B). Dannelsen af ​​sfæroid celleaggregater (eller blot kugler), som indikerer selvfornyelse evne, blev yderligere analyseret ved at dyrke cellerne i ikke-adhærente betingelser bestående af serumfrit DMEM indeholdende kun epitelial vækstfaktor (EGF) og basal fibroblast vækstfaktor (bFGF). Efter 30 dages dyrkning viste CD24

+ celler det højeste antal af kugler, nåede diametre mellem 100 og 200 um, mens forældrenes celler og CD24

– celler dannede signifikant færre kugler, med diametre under 100 um (figur 3C ). Disse resultater indikerer, at CD24

+ celler viser øget proliferation og evne til at danne kloner /sfærer

(A) kurver for celleproliferation af parental, CD24

+ og CD24

-. Celler fra TW02 (til venstre) og TW04 (højre) NPC cellelinjer dyrket i komplet DMEM i 9 dage. De viste resultater repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. *:

s

0,05, **:

s

0,01, ***:

s

0,001. (B) Klon dannelse effektivitet forældrenes, CD24

+, og CD24

– celler, og kvantificeringen analyse. *:

s

0,05. (C) Sphere dannelse evne forældrenes, CD24

+ og CD24

– celler dyrket i DMEM suppleret med 20 ng /ml bFGF og 20 ng /ml EGF i 30 dage. (D) Effekt af den Wnt inhibitor på kugle dannelse af CD24

+ celler i TW02 og TW04 celler. CD24

+ -celler blev behandlet eller ikke med Wnt inhibitoren ICG-001 (10 uM) i syv dage før sfære dannelse analyse. Scale barer:. 100 um

Vi undersøgte også virkningerne af Wnt inhibitor ICG-001 på kuglen dannelse evne CD24

+ celler. Efter behandling med den Wnt-inhibitoren i 7 dage (10 uM) blev sfære størrelse reduceres betydeligt ved et gennemsnit på 20% og 45% i TW02 og TW04 celler, henholdsvis (figur 3D), hvilket antyder, at Wnt-vejen kan bidrage til CSC fænotype af CD24

+ celler.

langsigtet differentiering potentiale CD24

+ celler

En langsigtet kultur CSCS kan øge sin celle masse, men også gennemgår asymmetriske division at generere en lav tumorigen cellepopulation med heterogene fænotyper [9]. Til overvågning af celledifferentiering potentiale CD24

+ -celler, analyserede vi 10 dage gamle kulturer af CD24

+ og CD24

– celler ved flowcytometri. Efter dyrkning TW02 celler i 10 dage, 11,56% af CD24

+ celler forblev CD24

+, mens 0,14% af cellerne, der oprindeligt CD24

– udtrykte CD24 efter dyrkning (figur 4A). Tilsvarende efter kultur af TW04 celler, 5,64% af CD24

+ celler forblev CD24

+, mens 0,03% af cellerne, der var CD24

– oprindeligt var CD24

+ efter dyrkning (figur 4B). Disse resultater antyder, at CD24

+ -celler viser celledifferentiering potentiale efter langvarig dyrkning, selv om differentiering fremgangsmåde, kan være kun delvis under disse betingelser.

(A) Ti dage gamle cellemasser oprindeligt dyrket fra CD24

+ og CD24

– cellekulturer i DMEM-medium blev høstet og farvet med anti-humant CD24-fluoresceinisothiocyanat (FITC) antistof efterfulgt af flowcytometri analyse. De viste procenter repræsenterer celler med CD24

+ overflademarkører fra enten (A) TW02 eller (B) TW04 cellelinjer. Flowcytometrianalyse af TW02 og TW04 celler umiddelbart efter sub-fraktionering (højre paneler).

CD24

+ celler viser øget modstand mod kemoterapeutiske medikamenter

Højere modstand mod kemoterapeutiske stoffer repræsenterer en kritisk egenskab ved CSCS [9]. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at CSCS kan udelukke DNA-bindende farvestof, Hoechst 33342, skyldes forøget ekspression af ABC transportør, ABCG2 [41], [42]. For at bestemme om CD24

+ celler udelukker Hoechst 33342 bedre end forældre- eller CD24

– celler, vi udførte farvestoffet udelukkelse assay efter behandling TW02 celler med ABC transporter-hæmmer, verapamil [43]. Som vist i figur 5A, en større population af Hoechst 33342-negative celler blev observeret for CD24

+ -celler (12,9%) sammenlignet med CD24

– celler (7,99%). Især verapamil behandling vendt udelukkelsen farvestof fænotype observeret i CD24

+ celler, mens denne behandling havde ingen signifikant effekt på CD24

– celler (figur 5A). Lignende resultater blev opnået for TW04 cellelinje (verapamil ingen signifikant effekt i dette tilfælde, da næsten ingen TW04 CD24

– celler blev Hoechst 33342-negativ). Disse observationer tyder på, at CD24

+ celler besidder en forbedret evne til at udelukke farvestof

(A) Sorteret CD24

+ og CD24

-. Celler fra TW02 og TW04 NPC cellelinjer blev behandlet eller ikke med 50 pM verapamil i 30 minutter forud for forarbejdning til Hoechst 33342 farveeksklusion assay som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) Parental, CD24

+, og CD24

– celler fra de TW02 eller TW04 cellelinier blev behandlet med forskellige koncentrationer af cisplatin og docetaxel i 24 timer, og cellelevedygtighed blev bestemt ved anvendelse af MTT-assayet. CD24

+ celler viste højere levedygtighed end forældrenes og CD24

– celler efter behandling med enten cisplatin eller docetaxel. Resultaterne vist repræsenterede gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. *:

s

0,05, **:

s

0,01, ***:

s

0,001. IC

50 værdier af cisplatin eller docetaxel behandling mod forældrenes, CD24

+, og CD24

-. Celler blev vist for (C) TW02 og (D) TW04 cellelinjer

for at undersøge, om CD24

+ celler viser højere modstandsdygtighed over for kemoterapeutiske lægemidler, behandlede vi cellerne med enten cisplatin eller docetaxel, og vurderet cellelevedygtighed under anvendelse af MTT-assayet. Cisplatin og docetaxel producerede højere cytotoksiske virkninger mod forældrenes eller CD24

– celler sammenlignet med CD24

+ celler (figur 5B,

s

0,01). På TW02 cellelinie, den halvmaksimal inhiberende koncentration (IC

50) af cisplatin mod parental, CD24

+, og CD24

– celler var 1,84, 3,32, og 1,66 ug /ml, mens IC

50 værdier af docetaxel mod parental, CD24

+, og CD24

– celler var 4.23, 7,45, og 3,53 ug /ml (figur 5C). For TW04 cellelinie, cisplatin producerede IC

50 værdier på 0,70, 2,45 og 0,46 mg /ml mod forældrenes, CD24

+, og CD24

– celler, henholdsvis mens IC

50 af docetaxel var 1,50, 3,93, og 1,41 pg /ml mod forældrenes, CD24

+, og CD24

-. celler, henholdsvis (figur 5D)

Vi har også observeret, at protein niveauer i ABC transporter ABCG2 var 1,42 og 2,12 gange højere i CD24

+ celler end i forældrenes og CD24

– celler, (figur 6A). Tilsvarende i TW04 celler, protein niveauer af ABCG2 i CD24

+ celler var 1,85 og 3,56 gange højere end i forældrenes og CD24

– celler, (figur 6A). I overensstemmelse med disse resultater, at mRNA-ekspression på

ABCG2

var højere i CD24

+ celler end i parentale eller CD24

– celler (figur 6B). Disse resultater indikerer, at CD24

+ celler viser øget kemoresistens, og at denne fænotype kan tilskrives i det mindste delvis at øge ekspression af ABCG2 transporteren. Salg

(A) Cellulær ABCG2 proteinniveauer i parental, CD24

+, og CD24

– TW02 og TW04 celler blev bestemt ved Western blot analyse. Kvantitativt resultat blev beregnet ved ImageJ software. *:

s

0,05, **:

s

0,01. (B) mRNA ekspression niveau af ABCG2 i parental, CD24

+, og CD24

– TW02 og TW04 celler blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR. De viste resultater repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. *:

s

0,05, **:.

s

0,01

Et lille antal CD24

+ celler er tilstrækkelig til at producere tumorer i NOD /SCID-mus

Vi testede tumorigent potentiale af CD24

+ celler efter injektion i aksillær fossa af immundefekte NOD /SCID-mus. Tolv uger efter injektion blev detekteret tumorer i mus inokuleret med enten 500 eller 1.000 CD24

+ -celler, men ikke hos mus behandlet med 100 CD24

+ -celler (figur 7A). I modsætning hertil blev der ikke påvist tumorer hos mus podet med ≤1,000 celler i forældre- eller CD24

– gruppe (figur 7A og 7B). Ligeledes blev der ikke påvist tumorer i mus, der modtog PBS som en negativ kontrol (figur 7A). Yderligere histologisk analyse af vævssnit farvet med hematoxylin og eosin (H 0,01, ***:

s

0,001 (B) Niveauerne af MMP2 og MMP9 protein produceret af forældrenes, CD24

+ eller CD24

– celler fra TW02 og TW04 cellelinjer blev kvantificeret ved Western blotting-analyse. Kvantitativt resultat blev beregnet ved ImageJ software. *:

s

0,05. (C) mRNA ekspressionsniveauer af MMP2 og MMP9 i parental, CD24

+, og CD24

– celler blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR fra TW02 og TW04 cellelinier. De viste resultater repræsenterer et gennemsnit fra tre uafhængige forsøg. *:

s

0,05, **:.

s

0,01

Diskussion

Resultaterne af denne undersøgelse tyder at CD24 repræsenterer en ny CSC overflademarkør i NPC. De karakteristiske træk ved CD24

+ celle subpopulationer isoleret fra TW02 og TW04 NPC cellelinier er de samme som tidligere er rapporteret for CSCS afledt af NPC [21] – [23]. Disse egenskaber omfatter øget ekspression af gener, der er involveret i udvikling og vedligeholdelse af stamceller, øget selv-fornyelse og vedligeholdelse af celledifferentiering kapacitet efter længere tids kultur, øget sfære dannelse evne (også observeret i CD24

+ celler isoleret fra NPC cellelinjer HK1 og TW076, se figur S1), øget Hoechst 33342 farvestof udstødelse og kemoresistens, øget evne til at initiere tumorer i immunsvækkede mus og øget celle invasion

celleoverfladeprotein, CD24, stærkt udtrykt i mange menneske. kræft [13], [48], [49]. CD24 udtrykt på cancerceller interagerer med P-selectin fundet på endotelceller, hvilket viser, at CD24 kan binde til P-selectin og initiere rulning af kræftceller på endotelet, som kan efterfølges af initiering af metastase [47]. Foruden NPC-celler, er CD24 forbundet med CSCS af andre tumorer, såsom ovarie [13] og pancreascancer [48]. For eksempel CD24

+ CD44

+ ESA

+ bugspytkirtelkræftceller besidder CSC egenskaber [48]. For nylig blev en lignende konklusion rapporteret for æggestokkene CSCS; dvs. en xenotransplantat injektion af 5.000 CD24

+ -celler producerede tumorer i nøgne mus, mens injektion af et lige antal CD24

– celler undladt at gøre det [49]. Desuden CD24

+ cancer cellekolonier isoleret fra ovarietumorer af en human patient viste heterogenitet i proliferationshastighed, cellecyklusfordeling, og ekspressionsprofil af gener og proteiner, og demonstrerede stamcelle egenskaber [49]. Desuden CD24

+ stamceller-lignende celler detekteret i kræft i æggestokkene udstillet også forbedret kemoresistens [50]. Især i brystkræft, fravær af CD24 kombineret med tilstedeværelsen af ​​CD44 og EpCAM (CD24

-CD44

+ EpCAM

+) ser ud til at være kritisk for identifikation af bryst CSCS [15]. En tidligere undersøgelse har rapporteret, at CD44 repræsenterer en CSC biomarkør i NPC [23]. I overensstemmelse med dette fund, at CD24

+ celler, vi isoleret fra TW02 og TW04 NPC cellelinjer var for det meste CD44

+ (figur 1B). Desuden, at langt størstedelen af ​​CD24

+ -celler i HK1 og TW076 cellelinier var også CD44

+ (Fig S2). Både CD24 og CD44 kan således være involveret i dannelsen af ​​CSCS i NPC, og funktionen af ​​disse proteiner i udvikling og vedligeholdelse af CSCS garanterer yderligere undersøgelse.

Vi observerede, at CD24

+ celler isoleret fra de TW02 og TW04 NPC cellelinjer udtrykker højere mRNA niveauer af

Sox2

,

Oct-4

,

Nanog

,

Bmi-1

, og

Rex-1

sammenlignet med forældre eller CD24

– celler. Et lignende fænomen blev også observeret i HK1 og TW076 cellelinjer (Fig S3). Disse karakteristika ligner dem rapporteret for embryonale stamceller [27] – [33] og æggestokkræft stamceller-lignende celler [51]. Dette mønster af embryonale stamceller genekspression i CD24

+ NPC CSCS indikerer tilstedeværelsen af ​​en konserveret mønster af stamceller genekspression i embryoniske stamceller og CSCS. I embryonale stamceller, co-ekspression af

Sox2

,

Oct-4

,

Nanog

, og

Rex-1

er afgørende for opretholdelsen af pluripotens og selvfornyelse, og forhindrer celledifferentiering langs trofoblasten celle afstamning [30], [33].

Sox2

Oct-4

koder transkriptionsfaktorer, der opretholder selvfornyelse og pluripotens i udifferentierede embryonale stamceller tilstand ved at modulere gener, der opretholder eftergivende kromatin struktur og DNA-reparation, og forhindre apoptose [ ,,,0],52]. På den anden side, udtryk for

Nanog

, som også er en transskription faktor kritisk involveret i selvfornyelse, er positivt reguleret af

Sox2

Oct-4

[53]. Disse transskriptionsfaktorer danner en funktionel transkriptionel regulering netværk, der er kritisk for opretholdelse af pluripotens i embryonale stamceller [53]. Desuden Polycomb gruppen (PcG) gen

Bmi-1

tavshed

Hox

gener via modulation af kromatin struktur under fosterudviklingen i bananfluer, og kan muligvis øge den proliferative aktivitet af både normale og leukæmiske stamceller [32]. Som udtryk for

Bmi-1

reguleres negativt af

PTEN

, der fungerer som et tumorsuppressorgen [54], forøget ekspression af

Bmi-1

kan korrelere med undertrykkelse af

PTEN

udtryk og induktion af epitelial-mesenkymale overgang, samt øget motilitet og invasionsevne af humane nasopharyngeale epitelceller [54]. Vores resultater viser, at CD24

+ sub-population af NPC celler også udtrykker stamceller gener og udviser karakteristika af stamceller selvfornyelse og øget spredning kapacitet.

Wnt /β-catenin signalvejen, som er blevet rapporteret at regulere stamcelle funktion og niche-stamceller celle-interaktioner [56], øger ekspressionen af ​​

Sox2

Oct-4

[55]. Desuden blev reduceret E-cadherin-mRNA-ekspression observeret af Gao et al. i CD24

+ æggestokkene cancer stamceller [49]. Disse observationer indikerer, at tabet af E-cadherin ekspression kan tillade β-catenin at re-lokalisere til kernen og aktivere transkriptionelle aktivitet [57]. I denne undersøgelse forøget phosphorylering af GSK-3β, reduceret phosphorylering af β-catenin, og blev observeret nuklear translokation af β-catenin i CD24

+ -celler, sammenlignet med forældre- eller CD24

– celler (figur 2). Disse observationer viser, at Wnt /β-catenin signalvejen er aktiveret i CD24

+ celler

Vores resultater at CD24

+ NPC celler er mere indgribende end forældre- eller CD24

-. NPC celler er i overensstemmelse med resultater fra tidligere undersøgelser af CSCS i pancreas [58], lunge [19], og prostatacancer [59]. Sammen med den øgede invasion evne, cellulære markører, der kendetegner celle invasion, såsom MMP2 og MMP9, blev også øget på højere niveauer i CD24

+ celler. MMP2 og MMP9 er involveret i nedbrydningen af ​​den ekstracellulære matrix, og en stigning i ekspression af begge enzymer inducerer celleinvasion evne [60]. Zhou et al. foreslog, at genetisk polymorfi i MMP2 promotoren kan forklare den forøgede modtagelighed af kinesiske individer for at udvikle NPC [61]. Microarray analyse afslører, at MMP1 og MMP2 er de mest markant opreguleres gener i NPC biopsier, sammenlignet med lymphohyperplasia, adenoid væv, og hoved- og halskræft [62]. Desuden undersøgelser udført på NPC tumorbiopsier eller cellelinier med forbedret invasiv, eller epitel-mesenkymale overgange afslørede også forbedret udtryk for

Sox2

,

Oct-4

, og

Nanog

[63] – [66], svarer til de resultater, der rapporteres her på CD24

+ -celler. Disse resultater indikerer, at CD24

+ NPC CSCS kan fremme tumorigenese og også iværksætte invasion og metastase, og foreslå, at yderligere forsøg for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​CD24

+ CSCS i humane NPC biopsier berettiget. Desuden, hvad enten ekspressionen af ​​stamcelle og invasion generne er under kontrol af en fælles signalvej, såsom Wnt /β-catenin pathway, stadig at blive undersøgt.

Sammenfattende vores resultater viser, at CD24

+ -celler udviser CSC karakteristika i NPC cellelinier. Strategier rettet mod udryddelse af CD24

+ NPC celler kan give nye og mere effektive behandlingsstrategier mod NPC.

Materialer og metoder

Cell kultur

NPC cellelinjer (den keratiniserende skællede TW02 cellelinje, den udifferentierede TW04 cellelinie, differentierede skællede HK1 celler dårligt differentierede planocellulære CG1 celler og keratiniserende skællede TW039 og TW076 cellelinjer) blev leveret af Dr. Yu-søn Chang (Chang Gung University) og opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 25 ug /ml amphotericin B (Invitrogen). Efter sortering som beskrevet nedenfor, blev cellerne dyrket i DMEM suppleret med 20 ng /ml bFGF (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 20 ng /ml EGF (Sigma-Aldrich), 200 enheder /ml penicillin, 200 ug /ml streptomycin, og 50 ug /ml amphotericin B (Invitrogen). Alle celler blev holdt i en befugtet 5% CO

2 inkubator ved 37 ° C.

Flowcytometrianalyse og sortering af NPC celler

Cellerne blev analyseret ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) efter at have nået den logaritmiske proliferation fase. Celler blev spaltet med 0,25% trypsin-0,02% EDTA (Invitrogen), vasket to gange med calcium /magnesium-frit PBS og resuspenderet ved en koncentration på 1 x 10

6 celler /ml i iskold PBS suppleret med 2% FBS. FITC-konjugeret anti-humant CD15, blev CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD59, CD90, CD117 eller CD133-antistof (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mountain View, CA) tilsættes derefter til en endelig koncentration på 1 ug /ml og inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C i mørke under blanding.