PLoS ONE: microRNA-17 er den mest opreguleret Medlem af miR-17-92 Cluster under Tidlig Colon Cancer Evolution

Abstrakt

dereguleret microRNA’er spiller en rolle i udviklingen og progressionen af ​​tyktarmskræft, men lidt er kendt om deres væv og celler fordeling i kontinuum af normal slimhinde gennem præmaligne adenom til invasive adenokarcinom. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge ekspressionsmønsteret af MIR-17-92 klynge (MIR-17, MIR-18, MIR-19, MIR-20 og MIR-92) samt MIR-21, MIR-31 , mIR-135b, og mIR-145 i begyndelsen af ​​klinisk diagnosticeret tyktarmskræft. MikroRNA’er blev analyseret ved kromogene

in situ

hybridisering i normal-adenom-adenocarcinom sekvens af ni adenocarcinomer udviklet i slimhinde kolon polypper. Efterfølgende blev ekspressionen af ​​udvalgte microRNA’er valideret i 24 slimhinde tyktarmskræft polypper. Ekspression af miR-17 var begrænset til de epitelceller, og ekspressionsniveauerne steg i overgangszonen fra normal til adenomatøs væv. MIR-17-92 klynge medlemmer, miR-19b, miR-20a, og miR-92a, fulgte samme udtryk mønster, men miR-17 var den mest fremherskende. En øget ekspression af MIR-21 blev fundet i det tumor-associerede stroma med den mest dramatiske stigning fra adenom til adenocarcinom, mens antallet af positive MIR-145 fibroblastlignende celler i normale lamina propria (stroma) faldt på en trinvis måde hele normal-adenom-adenocarcinom sekvens. Det konkluderes, at ekspressionen af ​​miR-17, miR-21, og miR-145 ændringer i tidlige stadier af den normale-adenom-adenocarcinom sekvens. Således kan disse microRNA spille en rolle i udviklingen af ​​tyktarmskræft

Henvisning:. Knudsen KN, Nielsen BS, Lindebjerg J, Hansen TF, Holst R, Sørensen FB (2015) microRNA-17 er den mest Up -Regulated medlem af miR-17-92 Cluster under Tidlig tyktarmskræft Evolution. PLoS ONE 10 (10): e0140503. doi: 10,1371 /journal.pone.0140503

Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES

Modtaget: Juni 11, 2015; Accepteret: September 24, 2015; Udgivet: 14 Okt 2015

Copyright: © 2015 Knudsen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. undersøgelsen blev finansieret af Region Syddanmark Danmark ph.d. Fund (tilskud nummer 12/6786, https://www.regionsyddanmark.dk/wm325002), The Syddansk Universitet Danmark (www.sdu.dk), Forskningsrådet for Lillebælt Hospital (https://www.sygehuslillebaelt.dk/wm223295), Kong Christian X Foundation (https://kongehuset.dk/Menu/Fonde–legater/Kong-Christian-den-Tiendes-Fond/kong-christian-den-tiendesfond), Familien Spogaard Foundation (https://www.cancer.dk/forskning/stoette-til-forskning/familien-spogaards-fond/), Aase og Ejnar Danielsens Fond (tilskud nummer 10-000.789, http: //www.danielsensfond .dk /default.aspx), og parlamentsmedlem J. Christensen og hustru K. Christensen Foundation. Alle tilskud, der er nævnt ovenfor, blev givet til KNK. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. BSN er ansat af en kommerciel virksomhed (Bioneer A /S, Danmark). Den bidragyder støttede i form af løn, men havde ikke nogen yderligere rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. BSN er ansat af en kommerciel virksomhed (Bioneer A /S, Danmark). Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Tyktarmskræft er blandt en af ​​de mest almindelige kræftformer i verden [1]. En betydelig del af disse cancere antages at udvikle sig i en trinvis måde fra normal colon mucosa gennem en præmalign adenom til invasive adenocarcinom som følge af komplekse genetiske og epigenetiske ændringer [2-4]. MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af ikke-kodende RNA mediering post-transkriptionel regulering, der har været impliceret i colorektal carcinogenese og tumorudvikling ved at fungere som onkogener og tumor suppressorer [5-7]. De miRNA, som generelt indeholder ~ 22 nukleotider, der er målrettet mere end 60% af alle protein-kodende gener [8], og hver miRNA kan potentielt undertrykke hundredvis af målgener [9].

MikroRNA’er udtrykkes som udskrifter indeholder en enkelt miRNA som miR-21 eller en række modne miRNA (polycistrons), ligesom miR-143/145 og miR-17-92 klynger. MIR-17-92 klynge indeholder seks forskellige miRNA: MIR-17, miR-18a, miR-19a, miR-19b, miR-20a, og miR-92a, med en meget lignende sekvens mellem miR-19a og miR-19b og mellem mIR-17 og mIR-20a [10]. Alle klyngens medlemmer er blevet fundet forhøjet i kolorektal cancervæv sammenlignet med normalt væv, om end med varierende ekspression af hver enkelt komponent [11-13]. Andre hyppigt beskrevet opreguleret miRNA i kolorektal cancer er MIR-21 og MIR-31 [14-16], mens MIR-145 er blandt de mest konsekvent nedreguleres miRNA [15-18]. Desuden miR-135b er blevet rapporteret, at være involveret i tidlig tumorgenese [19,20].

På trods af den massive igangværende forskning på miRNA i kolorektal cancer, har kun få studier undersøgt miRNA ændringer langs hele normaliseret adenom-adenocarcinom (NA-AC) sekvens [20-24]. Bartley

et al

fundet i alt 230 differentielt udtrykte miRNA i NA-AC evolutionære model herunder miR-17, miR-19, miR-92a, og miR-21 [21], mens andre forskere har rapporteret miR-31 og miR-135b for at være blandt de mest hyppige ændringer miRNA [20,22,25]. Det har også vist sig, at MIR-21 opregulering fra adenom til adenocarcinom er et resultat af forøget ekspression i cancerassocierede stromale fibroblaster i tumoren mikromiljø [26]. Imidlertid information om væv og celler fordeling af miRNA i kontinuum af N-A-AC-sekvens er stadig sparsomme. Kendskab til miRNA lokalisering og udtryk er af fundamental betydning for at forstå deres nøjagtige rolle i initiering, udvikling og progression af tyktarmskræft.

De adenokarcinomer udviklingslande i slimhinder polypper (AVS) giver en enestående mulighed for at studere den tidlige sekventiel udvikling af adenocarcinom i den samme patient. Anvender ACP af tyktarmen som en model af NA-AC-sekvensen, er formålet med denne undersøgelse var at beskrive ekspressionsmønstre på MIR-17-92 klynge medlemmer samt MIR-21, MIR-31, MIR-135b og miR-145 i tyktarmskræft udvikling med fokus på deres forekomst, væv distribution og cellulære oprindelse.

Materialer og metoder

undersøgt i nærværende studie væv bestod af to uafhængige sæt kliniske, diagnostiske prøver: en test sæt af ni formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) AVS-lande og en validering sæt af 24 FFPE AVS-lande fra tyktarmen. Alle væv blokke blev opnået fra den diagnostiske patologi arkiv af Institut for Klinisk Patologi, Vejle Sygehus. Prøverne til prøven undersøgelsen blev oprindeligt diagnosticeret under en tyktarmskræft screening forundersøgelse fra 2005 til 2006 i Vejle Amt, Danmark, mens validering sæt stammede fra henviste patienter diagnosticeret på Vejle Sygehus fra 2005 til 2009. Kun konventionelle adenocarcinomer var medtaget, og slimhinder polypper indeholdende savtakkede adenomer blev udelukket. Bekræftelse af diagnose og re-grading af adenomatøse komponenter i polypperne blev udført af en erfaren mave patolog. Detaljerede patientinformation er vist i tabel 1.

Ved undersøgelse debut, hver histologisk snit indeholdt alle tre komponenter i AVS-landene,

jeg

.

e

. normal slimhinde, adenomatøs væv, og invasiv adenokarcinom. Men som flere sektioner blev skåret fra væv blokke manglede nogle områder af interesse, og dermed to prøver fra testen sæt og op til seks fra validering sæt undladt at give fuldstændige data fra alle tre rum i NA-AC sekvens.

undersøgelsen blev godkendt af de regionale Videnskabsetiske komitéer for Southern Danmark (ID # S-20120075) og givet afkald på informeret samtykke. Undersøgelsen blev registreret i Dansk Datatilsynet, og Det Danske Registry for Human Tissue Udnyttelse er blevet hørt inden eventuelle vævsprøver blev anvendt.

In situ

hybridisering analyse

In situ

hybridisering (ISH) for miR-17, miR-21, miR-145, miR-126, miR-31, miR-125b, miR-135b, miR-200b, miR-18a, miR19b , mIR-20a, og mIR-92a blev i det væsentlige udført som tidligere [27] beskrevne. De miRNA probe sekvenser og eksperimentelle detaljer præsenteres i S1 tabel. Kort fortalt blev ISH analyse udført på 6 um tykke snit under anvendelse af en Tecan Evo instrument (Männedorf, Schweiz). Assay optimering for at bestemme optimal probekoncentrationer og hybridiseringstemperaturer blev opnået inden analysen. Snit blev præ-spaltet med proteinase-K (15 ug /ml) ved 37 ° C i 8 minutter, præ-hybridiseret ved 57 ° C i 15 minutter, og hybridiseret med dobbelt-carboxyfluorescein (FAM) mærket Locked Nucleic Acid (LNA) sonder (Exiqon A /S, Danmark). Efter stringente vaske i saltvand-natriumcitrat-buffer, blev proberne detekteret med alkalisk phosphatase-konjugeret fåre-anti-FAM Fab-fragmenter efterfulgt af inkubering i substrat indeholdende 4-nitroblue tetrazolium og 5-brom-4-chlor-3′-indolylphosphat (Roche , Danmark), hvilket resulterer i en mørk-blå farvning, og endelig kontrastfarvet med nuklear hurtig rød (Vector Laboratories, CA)

Morfologisk evaluering af miRNA-ekspression og β-catenin

Alle objektglas blev vurderet subjektivt og afsluttet semikvantitativt ifølge miRNA intensitet (0 = negativ, 1 = svag, 2 = stærk) og andelen af ​​farvede celler (0 = 50%, 1 = 50%) med undtagelse af mIR-21. Den samlede score blev bestemt ved at tilføje intensitet og andelen scores og dichotomising summen i “lav” (score 0-1) eller “høj” (score 2-3) udtryk. På grund af et bredt udvalg af MIR-21 positive celler i de prøver, blev andelen af ​​MIR-21 farvede celler kategoriseret som 0 = 1%, 1 = 1% -50% og 2 = 50%, og intensitet score blev anvendt som beskrevet ovenfor. Den samlede miR-21 point er opdelt i tre kategorier: 0-1 = lav; 2-3 = moderat; 4 = høj ekspression.

β-catenin-ekspression blev bedømt for membranøs, cytoplasmatisk, og nuklear farvning. Da det cytoplasmatiske reaktion homogent fordelte i tumoren rum, blev kun intensiteten scoret (svag, moderat og stærk). Fordi den cytoplasmatiske farvning tilsløret membranøs immunreaktion i mange adenomatøs og invasive områder, blev membranøs farvning ikke scoret i disse rum. Nuklear farvning blev delt i to grupper: negativ = ingen kernereaktion set og positiv = spænder fra et par spredte positive celler, fokal reaktion eller diffus reaktion

Billedanalyse

Den morfologiske vurdering dokumenteret. en udtalt opregulering af miR-17 i de epitelceller, som opfordrede til yderligere analyse ved hjælp af følgende objektiv tilgang: Digitale hele lysbilederne blev opnået med en x20 målsætning ved hjælp af en Axio Scan Z1 lyse felt scanner (Carl Zeiss, Tyskland). Billedanalyse af de digitale objektglas blev udført under anvendelse VisiomorphDP software (Visiopharm, Danmark). I de 16 tilfælde blev kvantitative estimater af miR-17 ISH signal opnået i regioner med normal colon mucosa (N), lav kvalitet adenom (LGA), høj kvalitet adenom (HGA), og adenocarcinom, hvor sådanne homogene væv komponenter var tydelige . Regionerne blev identificeret ved en erfaren mave patolog og omgivet som områder af interesse (ROI) i de digitale hele dias. Otte sager blev analyseret dobbelt og data fra de to dias blev samlet. De gennemsnitlige områder evalueret (af ROI’er) var: N: 5,2 mm

2 (n = 24); LGA: 6,1 mm

2 (n = 9); HGA: 7.4 mm

2 (n = 21), og adenocarcinom: 8.2 mm

2 (n = 24), hvor n er antallet af repræsentative ROIs. En pixel klassifikatør blev uddannet til at skelne den blå ISH signal fra den røde kontrastfarve, den ufarvede og svagt farvede væv, og væv-frie områder, og med en intensitet tærskel diskriminere mellem blå fra intens blå. Følgende parametre blev opnået under billedbehandling fra hvert ROI: område med medium blå, område med intens blå, og det samlede areal af de enkelte ROIs. Det relative areal fraktioner, områder af medium + intens blå divideret med det samlede areal (vilkårlig enhed), blev anset for repræsentative for de relative miR-17 ekspressionsniveauerne.

Immunhistokemi (IHC)

IHC blev udført på 4 um vævssnit fra de samme blokke anvendt til ISH analyse. EnVision FLEX +, Mus, High pH, ​​(Link) (Dako, Glostrup, Danmark kode K8002) blev anvendt til epitopgenfinding og IHC-farvning.

I phosphatase og tensin homolog (PTEN) -analyse, blev objektglassene inkuberet med PTEN-antistof (1: 200, Dako, Danmark, kode M3627) i 30 minutter, amplificeret med muse link antistof i 20 minutter efterfulgt af peberrodsperoxidase-polymer detektion i 30 minutter. Antistof farvning blev udført på en Dako Autostainer Plus (Dako, Danmark) under anvendelse af 3,3′-diaminobenzidin som chromogen og Mayers hematoxylin som kontrastfarve. Komplet negativ IHC reaktion blev betragtet som tab af PTEN.

Uoverensstemmelse reparation protein status var blevet udført rutinemæssigt bruger IHC på ca. halvdelen af ​​prøverne under den primære pato-anatomiske diagnostisk procedure. De resterende tilfælde blev farvet med antistoffer mod MLH1 (1: 100, Novocastra, UK, kode NCL-L-MLH1), MSH2 (1: 100, Novocastra, UK, kode NCL-MSH2), MSH6 (BD Transduction Laboratories, USA, kode 610.919) og PMS2 (1: 500, BD Pharmingen, USA, kode 556.415). Ikke neoplastiske celler i og omkring tumoren tjente som intern positiv kontrol, og for negative kontroller det primære antistof blev udeladt

IHC analyser for glatmuskelactin (1: 1000, Dako, Danmark, M0851)., Desmin (1: 400, Dako, Danmark, M0760) og h-caldesmon (1: 200, Dako, Danmark, M3557) blev udført på prøver fra af pakningen, mens analyse for β-catenin (1: 2000, BD Biosciences, USA , kode 610.153) blev udført på validering sæt.

Statistisk analyse

Kontinuerlig miR-17 data fra billedanalyse var log-transformeret til at give en normalfordeling af restprodukter. For at justere for variation inden for individet blev en multivariat blandede effekter lineær regressionsmodel med tilfældige virkninger for prøven ID bruges til at undersøge sammenhænge mellem log-miR-17 og de faste kovariater: væv type, alder, køn, og histologi af adenom. Bagefter blev lineære kombinationer af estimatorer anvendt til at sammenligne MIR-17 ekspressionsniveauer mellem grupperne. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle analyser blev udført i STATA version 13 (STATACorp, TX, USA)

Resultater

Test tilfælde:. Morfologisk evaluering

Baseret på litteratur [5-7,21 , 22,28-30], valgte vi at undersøge ekspressionen af ​​mIR-17, mIR-21, mIR-31, mIR-125b, mIR-126, mIR-135b, mIR-145, og mIR-200b i testen gruppe på ni AVS-lande.

af de otte testede miRNA, miR-17, miR-21, og miR-145 viste forskellen udtryk i NA-AC sekvens (fig 1A-1F). I syv ud af ni tilfælde blev en øget miR-17 ekspression i epitelceller ses i overgangszonen fra normal til adenomatøs væv. Udtrykket blev opretholdt i kræft epitelceller. I alle prøver blev MIR-21-ekspression overvejende fundet i fibroblastlignende stromaceller i de dysplastiske og invasive områder af AVS-landene med kun sparsom og fokal reaktion i de ondartede epitelceller. Ekspressionsmønsteret syntes at stige på en trinvis måde i hele den N-A-C-sekvens. Alle tilfælde udviste kraftig ekspression af MIR-145 set i de glatte muskelceller (SMC) og vaskulære glatte muskelceller (VSMC) samt i fibroblastlignende stromaceller. De sidstnævnte celler blev lokaliseret i umiddelbar nærhed af de epiteliale krypter og syntes at falde i adenomatøs og kræft væv i seks ud af syv ledige sager. IHC på de samme prøver afslørede en positiv reaktion for glatte muskel α-actin og desmin, mens h-caldesmon var negativ, hvilket tyder på, at disse miR-145-positive celler er af myofibroblastisk oprindelse

(A . B ) mIR-17 i normal (N) og adenomatøs (A) væv og i adenocarcinom (AC); (C (E) MIR-145 ses i glatte muskelceller (pil) og vaskulære glatte muskelceller (pilespids); i forstørrelse (F) et reduceret antal MIR-145 positive fibroblastlignende celler findes i adenom (pil) sammenlignet med normalt væv (pilespids); (G) Svag MIR-125b signal blev set i muscularis mucosa (mm); (H) MIR-200b blev set i epitelcellerne på basen af ​​krypterne, men i dette tilfælde også i de epiteliale cancerceller; (I) MIR-126 er udelukkende ses i endotelceller; (J) Den scramble sonde viste kun diskret baggrund farvning.

Et positivt signal for miR-125b, miR-126, og miR-200b var til stede i prøverne, dog ingen differential udtryk for nogen af disse tre Mirs blev observeret når man sammenligner de tre rum (fig 1G-1I). En svag MIR-125b signal blev set i de fibroblaster i den normale slimhinde og SMC i fem ud af ni tilfælde. Alle prøver viste MIR-200 mia positive epitelceller, især ved basis af normale colon krypter, samt et positivt signal i adenomatøs og kræft epitel. miR-126-ekspression var begrænset til de endotelceller og var til stede i alle tre rum.

Ingen udtryk for miR-31 og miR-135b blev påvist i de ni prøveemner.

Validation undersøgelse : Morfologisk evaluering af miR-17, miR-21, og miR-145-ekspression

Baseret på de opnåede resultater fra testen sæt, analyser af miR-17, miR-21, og miR-145 blev yderligere forfulgt i valideringen sæt af 24 AVS-lande. MIR-17 signal blev udelukkende fundet i epitelcellerne. Lav ekspression blev set i de normale epitelceller ved basis af krypterne, mens høj ekspression blev observeret i overgangszonen fra normal til adenomatøs væv i 96% (23/24) af tilfældene (tabel 2). Udtrykket blev opretholdt i adenocarcinom i 96% (22/23) af tilfældene, mens signalet faldt i ét tilfælde (4%). Kun en prøve viste øget udtryk fra adenom til adenocarcinom. Disse to sager afveg ikke klinisk fra andre tilfælde af valideringen sæt.

Svarende til resultaterne i testen sæt, miR-21-ekspression overvejende findes i de stromale celler omgiver dysplastiske og kræft kirtler. Et tilfælde, viste imidlertid MIR-21 ekspression i ondartede epitelceller, og i tre andre prøver fokal ekspression i de epiteliale tumorceller blev også observeret. Ingen histopatologiske eller kliniske forskelle blev dokumenteret blandt disse fire sager i forhold til de øvrige 20 sager. Moderat udtryk for miR-21 dukkede op i overgangszonen fra normal til adenom i stromale celler i 71% (17/24) af tilfældene. De resterende tilfælde viste øget ekspression fra adenom til adenocarcinom (tabel 2). I 41% (9/22) af tilfældene blev den opregulering intensiveret hele NA-AC-sekvens med en moderat MIR-21-ekspression i adenom og høj ekspression i den invasive foci.

Analysen af mIR-145 viste en positiv pericryptal fibroblastlignende stromaceller i den normale lamina propria foruden SMC af arterier og muskellag i tyktarm. I halvdelen af ​​tilfældene, antallet af MIR-145 positive pericryptal, fibroblastlignende celler faldt i overgangszonen fra normal til adenomatøs væv. Dette fald var endnu mere tydelig, når man sammenligner normal til kræft væv med en reduktion set i 86% (19/22) af tilfældene (tabel 2). Det positive signal i SMC og VSMC forblev uændret i alle tre rum.

Analyse for miR-135b blev gentaget i alle 24 validering prøver, men ingen ISH signal blev fundet. Sagen med mismatch reparation proteinmangel ikke vise en miRNA udtryk profil forskellig fra de dygtige sager, heller ikke de tre sager med metastaser.

Angivelse af β-catenin i NA-AC sekvens

Distinct fremherskende membranøs og svage cytoplasmisk farvning for β-catenin var til stede i alle 24 tilfælde (100%) af den ikke-neoplastiske epitel, mens ingen kerneakkumulation sås (S2 tabel og A i S1 fig). I de adenomatøs komponenter blev cytoplasmatisk udtryk steget i 95% (20/21) af tilfældene (S2 tabel). 62% (13/21) af de adenomer vises også positive nuklear farvning, medens dette blev set i 95% (20/21) af de adenocarcinomer, oftest på den invasive front og /eller i tumor spirende celler (B + C i S1 fig). Øget cytoplasmatisk reaktion blev set i alle 21 (100%) adenokarcinomer (S2 tabel).

Billedanalyse af miR-17

En undergruppe af 16 tilfældigt udvalgte prøver fra valideringen sæt blev yderligere undersøgt ved billedanalyse at opnå kvantitative miR-17 udtryk skøn i områder med normalt væv, LGA, HGA og adenocarcinom. Skøn over miR-17-ekspression blev opnået som områdets fraktioner (

jeg

.

e

. Farvede område divideret med det samlede areal), og statistiske analyser blev udført på log transformerede data. Resultater fra multivariate blandet lineær regression er vist i tabel 3. Log-MIR-17 steg fra normalt væv til lav og høj kvalitet adenomatøs væv og også til invasiv cancer (p = 0,03, p 0,001 og p 0,001; intra- class korrelationskoefficient = 0,19). Fig 2 viser en samlet stigning på 10% (af den vilkårlige enhed) i hele NA-AC-sekvens, og at opreguleringen forekom på en trinvis måde ud med en 2,4% stigning fra normal til LGA (p = 0,03) og en yderligere stigning 6,9% fra lav kvalitet til HGA (p 0,001). Ingen forskel i log-MIR-17 ekspression blev set i progressionen fra HGA til adenocarcinom (p = 0,84). Den histologiske type adenom, rørformede, villøs eller tubulo-villøs, var ikke forbundet til log-miR-17 udtryk, men en forening med en alder af mandlige patienter blev set (p 0,001). (Tabel 3)

Øget ekspression af miR-17 i lav kvalitet adenom (LGA), høj kvalitet adenom (HGA) og adenocarcinom (AC) af tyktarmen i forhold til normalt væv

Angivelse af miR-17-92 klynge medlemmer

mIR-17 er en af ​​seks modne miRNA kodet fra polycistroniske miR-17-92 klynge. Derfor blev seks sager fra valideringen sæt med den subjektivt stærkeste miR-17-ekspression udvalgt til yderligere ISH analyse vedrørende klynge medlemmer miR-18a, miR-19b, miR-20a, og miR-92a. MIR-19b probe blev anset fælles for de to MIR-19 isoformer, som MIR-19a afviger fra MIR-19b ved kun at gøre 100% diskrimination usandsynlig i ISH assayet et enkelt nukleotid. MIR-17 probesekvens afviger fra MIR-20a med tre nukleotidpositioner (S1 Table). Signalerne af MIR-19b, MIR-20a, og MIR-92a var, ligesom MIR-17, begrænset til epitelceller, men udtrykket var svagere end den, der ses for MIR-17 (fig 3A og 3C-3E). En opregulering blev observeret i overgangszonen fra normal til adenomatøs væv, og op-reguleret ekspression blev opretholdt i adenocarcinom. En meget svag MIR-18a signal i epitelcellerne blev set i fire ud af seks tilfælde i overgangszonen fra normal til præcancer væv (Fig 3B), mens mere intens ISH signal blev fundet i et par små, afrundede lymfocyt-lignende celler i stroma af lamina propria

(A) Ekspression af mIR-17.; (B) MIR-18a; (C) MIR-19b; (D) MIR-20a; (E) MIR-92a og (F) scramble probe i normal (N) og adenomatøs (A) væv. Bemærk den øgede farvning intensitet i de adenomatøs krypter i forhold til den normale krypt.

PTEN udtryk er ikke relateret til miR-17 eller miR-21 udtryk

Alle sager fra begge studie sæt blev farvet for PTEN, en valideret target for både mIR-17 og mIR-21 [31,32]. I valideringen sæt, 21% (5/24) af AVS-landenes viste et fuldstændigt tab af PTEN men kun fokalt inden i epitelet af adenomatøs og /eller invasive områder. Dog blev en omvendt sammenhæng af PTEN og miR-17-ekspression og miR-21-ekspression ikke observeret. Ingen PTEN tab blev set de ni prøvesager.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi udnyttet kliniske, diagnostiske prøver af colonlæsioner indeholder NA-AC sekvens for at udforske udtryk for en række miRNA er kendt fra litteraturen [5-7,28] for at blive udtrykt under udviklingen af ​​tyktarmskræft; miR-17, miR-21, miR-31, miR-125b, miR-126, miR-135b, miR-145, og miR-200b. Anvender kromogene ISH, fandt vi, at ekspressionen af ​​miR-17, miR-21, og miR-145 var særligt dynamisk i de tidlige faser af udviklingen tyktarmskræft. Billedanalyse af Mir-17 farvede læsioner indikerede, at denne miRNA induceres i den tidlige overgang fra N til LGA og endnu mere drastisk til HGA. MIR-17-ekspression viste sig at være af epitelial oprindelse som det også var tilfældet for de andre miRNA i miR-17-92 klynge. MIR-17 viste sig at være den mest udbredte miRNA fra MIR-17-92 klynge.

Vores undersøgelse er den første til at vise, at MIR-17

in situ

ekspression øges tidligt fra normal slimhinde til LGA og når et plateau af udtryk i HGA, som ikke er overdrevet i åbenbar adenocarcinom. Dette fund er i overensstemmelse med resultater fra Bartley

et al

, som rapporterede en lignende miR-17 ekspressionsmønsteret hjælp QRT-PCR [21]. Andre undersøgelser har vist, at miR-17 niveauer fortsatte med at stige fra adenom til adenocarcinom [11,33,34], men i modsætning til vores undersøgelse og resultaterne af Bartley

et al

, har disse undersøgelser ikke sammenligne væv opnået fra de samme individer, og kan således være forbundet med øget inter-individuel variation.

Baseret på simple, morfologiske sammenligning af ISH signal farvning intensiteter, fandt vi miR-17 at være den mest opreguleret klynge medlem i både adenomatøs og cancervæv, efterfulgt af mIR-92a, mIR-20a, mIR-19b, og mIR-18a. Humphreys

et al

, hjælp QRT-PCR-teknik, fandt også miR-17 at være den højeste udtryk miR i miR-17-92 klynge i Dukes A og C tarmkræft [13], mens QRT-PCR resultater fra andre undersøgelser fundet miR-92a at være den mest gennemgribende udtrykte miRNA i adenomatøs og /eller kræft kolorektal væv [11,12,33]. Alle disse tre undersøgelser, dog bestyrke vores fund, at miR-18a er den mindst udtrykt klynge medlem, og at miR-19a /b og miR-20a udtryk er konsekvent højere end miR-18a [11-13,33]. Det kan ikke udelukkes, at den bindende affinitet (smeltetemperaturer) af LNA prober anvendes, kan have bidraget til de forskellige farvningsintensiteter observeret.

Vi fandt ekspression af alle de undersøgte MIR-17-92 klynge medlemmer at være begrænset til epitelcellerne. Lignende resultater af miR-17 og miR-92a udtryk er blevet rapporteret af andre forskere [31,33-35], selv om en gruppe også observeret nogle miR-17 positive stromaceller [35]. Interessant, observerede vi en intens MIR-18a signal i et par små, afrundede lymfocyt-lignende stromaceller i lamina propria i fire af seks prøver. , Da ingen anden klynge medlem blev udtrykt, at signalet er dog mest sandsynligt, at repræsentere tværs hybridisering med en anden RNA-mål.

rolle miR-17 i kolon epitelceller i udvikling af kræft er stadig uklart. En mulig funktion kunne være inhibering af E2F transkriptionsfaktoren 1,

E2F1

, et formodet tumorsuppressorgen. Forøget ekspression af E2F1 har været forbundet med nedsat proliferation og øget apoptose i kolorektal cancer [36,37]. Interessant nok har et omvendt forhold mellem E2F1 og MIR-17 blevet vist i tyktarmskræft væv [35,38]. Monzo

et al

viste, at transfektion af anti-miR-17 medførte øget E2F1 udtryk og nedsat celledeling [35], og Kanaan

et al

viste, at transfektion af miR-17 i HT-29 colorektale adenocarcinom-celler føre til nedsat E2F1-ekspression [39]. I en undersøgelse af neuronal afstamning differentiering af ubegrænset somatiske stamceller, har en direkte interaktion mellem miR-17 og E2F1 blevet dokumenteret [40]. En øget ekspression af MIR-17 i kolon epitelceller kunne bidrage til tumorgenese ved at fremme celleproliferation. Yderligere undersøgelser er faktisk nødvendige for at vurdere forholdet mellem miR-17 og E2F1 i kolorektal cancer og vil kræve omhyggelig undersøgelse af deres respektive udtryk i tilstrækkelige morfologisk karakteristiske regioner til stede i sådanne unikke prøver. Undersøgelsen sætter ansat i denne undersøgelse ikke gjorde det muligt for den supplerende analyse, da de repræsentative regioner ikke længere var til rådighed i en væsentlig del af materialet.

Den formodede kræftpsykologisk miR, miR-21, var primært findes i stromaceller omgiver dysplastiske, adenomatøse og cancerøse epitelceller. Intensiteten af ​​miR-21-ekspression steget i hele N-A-AC sekvens med det højeste udtryk ses i cancer-associeret stroma. Vores resultater bekræfter resultaterne af Yamamichi

et al

[26]. Med undtagelse af en sag med MIR-21 positive tumor epitel kun blev en overvejende stromal MIR-21-ekspression vist i de resterende 23 + 9 prøver. I betragtning af den lille prøvestørrelse anvendt i undersøgelsen af ​​Yamamichi

et al

samt nærværende en, det kan ikke helt udelukkes, at tidlig miR-21 udtryk kunne være en epitelial fænomen. Alligevel store undersøgelser af MIR-21 i mere avancerede colorektale cancere viser tydeligt MIR-21 at være lokaliseret i det stromale rum [27,41,42].

Vi observerede, at antallet af MIR-145 positive, pericryptal fibroblastlignende celler blev reduceret gradvist i NA-AC-sekvens. Nedsatte niveauer af MIR-145 i colorektal cancer sammenlignet med normale colon, som målt ved qPCR, er blevet fundet i mange undersøgelser, og MIR-145 har længe været betragtet som en mulig tumor suppressor. Men for nylig denne teori blev udfordret [43]. Brug af ISH, Chivukula

et al

fandt, at MIR-145 kun udtrykkes i mesenkymale celler og ikke epitelceller i muse colon, hvorimod MIR-145 var næsten ikke kan påvises ved QRT-PCR i renset muse og human tarmepitelet [ ,,,0],44]. Forfatterne konkluderede, at MIR-145 fungerer som en epitelial tumorsuppressor var usandsynligt, og at tidligere resultater af MIR-145 tab blev mere sandsynligvis relateret til forskelle i cellulær sammensætning af normale og ondartede væv [43,44].