PLoS ONE: Secretome-Based Identifikation af ULBP2 som en roman Serum Marker for kræft i bugspytkirtlen Detection

Abstrakt

Baggrund

At opdage nye markører til at forbedre effektiviteten af ​​kræft i bugspytkirtlen (PC) diagnose, secretome af to PC cellelinier (BxPC-3 og MIA PaCa-2) blev profileret. UL16 bindende protein 2 (ULBP2), en af ​​de proteiner, der er identificeret i PC celle secretome, blev udvalgt til evaluering som en biomarkør til PC detektion fordi dens mRNA-niveau også viste sig at være signifikant forhøjet i PC væv.

Metoder

ULBP2 udtryk i PC væv fra 67 patienter blev undersøgt ved immunhistokemi. ULBP2 serumniveauer i 154 PC-patienter og 142 raske kontroller blev målt ved perle-baseret immunassay, og effekten af ​​serum ULBP2 til PC detektion blev sammenlignet med den udbredte serologiske PC markør carbohydratantigen 19-9 (CA 19-9).

Resultater

Immunohistokemiske analyser viste en forhøjet udtryk for ULPB2 i PC væv sammenlignet med tilstødende ikke-kræft væv. I mellemtiden, serum niveauer af ULBP2 blandt alle pc-patienter (n = 154) og i den tidlige fase kræftpatienter var væsentligt højere end hos raske kontroller (

s

0,0001). Kombinationen af ​​ULBP2 og CA 19-9 udkonkurrerede hver markør alene i skelne PC patienter fra raske individer. Vigtigt er det, en analyse af området under modtageren opererer karakteristiske kurver viste, at ULBP2 var bedre CA 19-9 i diskriminere patienter med tidlig-fase pc fra raske kontrolpersoner.

Konklusioner

Kollektivt, vores resultaterne viser, at ULBP2 kan repræsentere en ny og nyttig serum biomarkør for kræft i bugspytkirtlen primær screening

Henvisning:. Chang YT, Wu CC, Shyr YM, Chen TC, Hwang TL, Yeh TS, et al. (2011) Secretome-Based Identifikation af ULBP2 som en roman Serum Marker for kræft i bugspytkirtlen Detection. PLoS ONE 6 (5): e20029. doi: 10,1371 /journal.pone.0020029

Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: Januar 21, 2011; Accepteret: April 10, 2011; Udgivet: May 20, 2011

Copyright: © 2011 Chang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Taiwan National Science Rådet (NSC 96-2320-B-182-031-MY3), Department of Health (DOH-99-TD-C-111-006), og Undervisningsministeriet (EMRPD180241 og EMRPD180091). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen (PC) er den fjerde-hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA med en 5-års overlevelse mindre end 7% [1], [2]. I 2010 blev mere end 43.000 nye PC tilfælde skønnes at udvikle og 36.800 dødsfald blev forventet i USA [1]. I Taiwan, er det rangeret tiendedel blandt kræftrelaterede dødsfald i 2008 og viser øget dødelighed i de sidste ti år [3]. På grund af den tidlige udbredelse af pc og den sene indtræden af ​​åbenlyse symptomer, er mindre end 8% af pc-patienter diagnosticeret på den lokaliserede fase, hvor et kirurgisk helbredelse er mulig [1], [4], [5]. Følgelig er der et presserende behov for at udvikle bedre strategier for tidlig påvisning af PC.

Aktuelle tilgange til PC diagnose er hovedsagelig baseret på billedbehandling og endoskopiske metoder [6], som på grund af den retroperitoneal placering i bugspytkirtlen , har en begrænset sandsynlighed for tidlig diagnose [7], [8]. En forhøjelse i serum niveauer af kulhydrat antigen 19-9 (CA 19-9) har været meget anvendt til PC påvisning men denne fremgangsmåde er utilstrækkelige med hensyn til både specificitet og følsomhed [6], [9], [10]. Udover CA 19-9, har mere end 40 proteiner blevet rapporteret som potentielle serologiske biomarkører for PC detektion [11]. Desværre er de fleste har enten begrænset specificitet og /eller sensitivitet, eller afvente validering med en storstilet kohorte af enheder [11] – [17], på trods beviser for, at anvendelsen af ​​et kombinatorisk biomarkør panel forbedrer nøjagtigheden af ​​PC diagnose [12] . Derfor opdagelsen af ​​nye og nyttige serum markører kunne fremme forbedringen af ​​PC diagnose og /eller prognose.

For nylig de secretome tilgange har været almindeligt anvendt i identifikationen af ​​potentielle kræft biomarkører [18], [ ,,,0],19]. I den foreliggende undersøgelse, analyserede vi secretome af to PC cellelinier, BxPC-3 og MIA PaCa-2 og vurderes et af de identificerede proteiner, UL16 binding protein 2 (ULBP2), som en potentiel PC biomarkør. Immunhistokemisk farvning resultater bekræftede de forhøjede niveauer af ULBP2 i PC væv sammenlignet med tilstødende ikke-kræft modstykker. Bead-baserede immunoassays yderligere valideret de forhøjede serumniveauer af ULBP2 i PC patienter versus raske personer. Vigtigst, den kombinerede anvendelse af ULBP2 med CA 19-9 forbedret følsomhed og nøjagtighed PC tidlig påvisning i dette tilfælde kontrol undersøgelse, hvilket giver en lovende fremgangsmåde til PC diagnose på et tidligt stadium.

Materialer og metoder

Patient befolkning og kliniske prøver

Tumor prøver fra 67 PC patienter (median alder, 64; interval: 35-82) blev indsamlet i Chang Gung Memorial Hospital (CGMH), Lin-Kou, Taiwan. Vævsprøverne blev opsamlet ved kirurgi, vurderes af patologer, og lagres i CGMH Tissue Bank indtil anvendelse. Serumprøver fra 154 PC patienter (median alder, 70, range, 31-87) blev indsamlet i Taipei Veterans General Hospital, Taipei, Taiwan. Yderligere blodprøver, herunder 142 serumprøver fra raske donorer (median alder, 58, range, 34-86), 25 plasmaprøver fra raske donorer (median alder, 54; range, 29-79), 28 serumprøver fra nasopharyngeal karcinom ( NPC) patienter (median alder, 46; interval, 31-80), 29 serumprøver fra kolorektal carcinom (CRC) patienter (median alder, 61, rækkevidde, 30-83), og 30 plasmaprøver fra mavekræft (GC) patienter (median alder, 66; interval, 33-83), blev indsamlet i CGMH, Lin-Kou, Taiwan. Portioner af disse prøver blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Denne forskning fulgte læresætninger Helsinki-deklarationen og alle fag underskrev et informeret samtykke, der er godkendt af Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital eller Taipei Veterans General Hospital, Taiwan før deres deltagelse i denne undersøgelse og for anvendelse af vævs- eller blodprøver indsamlet før behandling.

Cell kultur

PC cellelinier BxPC-3, MIA PaCa-2, PANC-1 og AsPC-1 blev købt fra Bioresource Indsamling og Research center (Hsinchu, Taiwan) . BxPC-3 og AsPC-1 blev opretholdt i 10% føtalt bovint serum (FBS, Biological Industries, Israel) -supplemented RPMI-1640 medium (Invitrogen, CA, USA). MIA PaCa-2 og PANC-1 blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Invitrogen) med 10% FBS plus 2,5% hesteserum (Biological Industries) og 10% FBS, henholdsvis. De fire cellelinjer blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 miljø.

Generering af secretome datasæt af cancer cellelinjer

De metoder, der anvendes til fremstilling af kræftcellen konditionerede medier (CM) og secretome profilering blev beskrevet tidligere [20] og detaljeret i Materialer og metoder S1.

Public domain søgning database for udtryk profiler af udvalgte målgener

udtrykket profiler af udskilte proteiner i PC væv blev søgt i National center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Den GSE1542 datasæt blev udvalgt til at identificere kandidatgener med forhøjede ekspressionsniveauer i PC celler [21]. Den GSE1542 datasæt indeholder genekspressionsprofilerne af pankreatiske duktale celler isoleret fra 24 patienter med pancreatisk duktalt adenokarcinom og 25 donorer med en normal pancreas [21]. De gennemsnitlige intensiteter af hvert gen probe hos raske og cancerøse grupper blev beregnet til opnåelse af tumorvæv /normalt (T /N) forhold; gener med T /N-forhold ≥2 blev anset opreguleret kandidater. Blandt dem, dem med

s

-værdier mindre end 0,05 beregnet af

t

-test blev yderligere udvalgt som de mest lovende kandidater til forhøjet udtryk i kræft væv.

Western blot analyse

proteiner i celleekstrakter og CM blev separeret ved SDS-PAGE, overført til PVDF-membraner (Millipore, MA, USA) og probet med antistoffer mod transformerende vækstfaktor-β-induceret protein ig-h3 ( BIGH3) (1:1000 fortynding Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), ULBP2 (1:1000 fortynding R R 1, svag; 0, ingen celle farvning), og procentdelen af ​​cellefarvning [3 , ≥90%; 2, 50-89%; 1, 10-49%; 0, 0-9%)]. De to scoringer blev mangedoblet og derefter divideret med 3 for at få det endelige resultat. Positiv farvning blev defineret som en endelig score ≥0.67 [22], [23]

Serum analyser

Serum BIGH3 og CA 19-9 niveauer blev bestemt ved hjælp af ELISA-kits fra R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle data blev behandlet ved hjælp af SPSS software-version 13.0 (IL, USA).

Resultater

Secretome analyse af to bugspytkirtelkræft cellelinjer

At opdage potentielle serum PC biomarkører, de udskilte proteiner af PC cellelinjer blev systemisk analyseret. Den skematiske repræsentation af rutediagrammet anvendes, er illustreret i fig. 1A. Proteinerne til stede i 24 h serumfri CM af BxPC-3 og MIA PaCa-2-celler blev separeret ved SDS-PAGE, visualiseret ved Coomassie blue-farvning (fig. 1B, øvre panel), skåret i 40 fraktioner, spaltet individuelt med trypsin og analyseret ved C-18 omvendt fase væskekromatografi-tandem-massespektrometri (LC-MS /MS). Proteinet farvningsmønster af cellelysatet er også vist i parallel at påvise, at de udskilte proteiner blev beriget i CM, og dens mønster var helt forskellig fra den, der genereres af intracellulære proteiner (fig. 1B, øvre panel). Fordelingen af ​​det cytosoliske protein, alpha-tubulin, blev yderligere undersøgt som en kontrol. Alpha-tubulin blev klart påvist i celleekstrakterne, men ikke i CM (fig. 1B, nederste panel), hvilket indikerer, at proteiner udvundet fra CM ikke skyldtes celledød.

(A), The strategi består af kræft secretome og væv tranacriptome analyse. (B), Proteinerne (50 ug) i CM og celleekstrakter (CE) af cancerceller blev opløst ved 10% SDS-PAGE og farvet med Coomassie blue (øvre panel) eller gennemgik immunblotanalyse med alpha-tubulin (nedre panel ). (C), Immunblotanalyse med anti-BIGH3 og ULBP2 antistoffer.

Efter at have søgt med Mascot algoritme og sætte en cutoff på 95,0% peptid sandsynlighed og 95,0% protein sandsynlighed i Scaffold software, 1011 og 1141 proteiner med flere (≥2) peptid hits blev fundet i BxPC-3 og MIA Paca-2 CM henholdsvis (Støtte Borde S1 og S2), hvilket resulterer i 1427 ikke-redundante og 725 overlapper proteiner.

Generering af kandidat biomarkør liste til PC afsløring

for at indsnævre kandidatlisten blev ekspressionsniveauer for de fælles 725 proteiner i pancreas ductusceller celler undersøgt i et array-baseret analyse publiceret af Ishikawa et al. [21], hvor de sammenlignes genekspression i pankreatiske duktale celler afledt fra 24 pancreas ductus-adenocarcinom-patienter og 25 donorer med en normal pancreas (fig. 1A). Denne analyse viste, at 10 af de 725 proteiner blev signifikant opreguleret (≥2 gange overekspression,

s

0,05) i bugspytkirtlen duktalt karcinom sammenlignet med ikke-tumor pancretiske ductusceller (tabel 1). Blandt dem er ceruloplasmin blevet bekræftet at være overudtrykt i PC væv [24], og forhøjet serumniveau af ERO1-lignende protein alfa er rapporteret i PC patienter sammenligning med raske kontroller [17], hvilket indikerer, at den kombinerede analyse af secretome og transkriptomet er en realistisk strategi for at opdage nye kandidat PC markører.

Overekspression af ULBP2 og BIGH3 i PC væv

Vi fokuserede vores opmærksomhed på ULBP2 og BIGH3 som potentielle PC markører (tabel 1) fordi en anden matrix-baseret analyse også havde vist, at deres mRNA-niveauer blev øget betydeligt i pc-væv [25], og hverken var endnu ikke blevet undersøgt i PC. Vi bekræftede tilstedeværelsen af ​​BIGH3 og ULBP2 i CM indsamlet fra fire PC cellelinier (BxPC-3, MIA Paca-2, Panc-1 og aspC-1) ved Western blot-analyse (fig. 1C). Yderligere immunhistokemiske analyser viste positiv farvning for BIGH3 og ULBP2 i 41,9% (13/31) og 100,0% (67/67), henholdsvis af pc vævssnit. Inspektion af hvert væv sektion indeholder både ikke-kræft og cancerøse duktale væv afslørede højere ekspression af begge proteiner i cancervæv end i de ikke-kræft modstykker i de fleste vævssnit undersøgte (figur 2A;. Støtte figurer S1 og S2). De immunohistokemiske snesevis af begge proteiner i tumorvæv var statistisk højere end i ikke-kræft modstykker: 0,54 ± 0,46 versus 0,14 ± 0,27 for BIGH3 (

s

0,0001) og 2,71 ± 0,49 versus 1,89 ± 0,74 for ULBP2 (

s

0,0001) (fig 2B.). Yderligere analyser viste, at deres ekspressionsniveauer i tumorvæv ikke var statistisk forbundet med alder, køn, histologisk klasse, samlet tumor stadie, eller tumor-node-metastaser (TNM) klassifikation af bugspytkirtelkræft (Støtte Borde S3 og S4).

(A), Immunohistokemisk farvning for BIGH3 (venstre panel) og ULBP2 (højre panel) i parret pericancerous tilstødende ikke-kræft (nedre felt) og tumor (øvre panel) væv. Scale bar, 100 pm. Original forstørrelse, × 400. (B), Box-plot analyse af de immunhistokemiske farvning scoringer i parrede tilstødende ikke-kræft (AN) og tumorvæv. Boksen viser den 25

th og 75

th percentiler af dataområde; den midterste linje angiver median; den stiplede linje viser den midterste 90% distribution.

Serum niveauer af BIGH3 og ULBP2 i PC patienter

For at vurdere potentialet i BIGH3 og ULBP2 som serum PC markører, vi undersøgte deres niveauer i sera fra PC patienter (n = 154) og raske kontroller (n = 142). Vi målte serum BIGH3 niveauer ved hjælp af et kommercielt ELISA kit og bestemte serum ULBP2 niveauer ved anvendelse af en perle-baseret immunassay udviklet i vores laboratorium, der er i stand til at detektere de typisk meget lave niveauer af serum ULBP2 ( 1 ng /ml), som ikke kunne være målt præcist ved hjælp af vores in-house sandwich-ELISA. Vores bead-baseret immunassay kunne præcist afsløre ULBP2 niveauer over et interval på 4,3 pg /ml til 31,9 ng /ml (Støtte fig S3). Vi fandt, at serumniveauer af ULBP2, men ikke BIGH3, var signifikant forhøjet i pc-patienter sammenlignet med dem i de raske kontrolpersoner: 1,87 ± 1,67 versus 1,29 ± 0,49 mg /ml for BIGH3 (

s

= 0,328; fig 3A) og 200,2 ± 168,6 versus 51,4 ± 64,6 pg /ml for ULBP2 (

s

. 0,0001;. figur 3B). Ved hjælp af en cutoff-værdi på 60 pg /mL for ULBP2, fandt vi, at sensitivitet og specificitet værdier for detektion af kræft var 83,8% og 73,9%, hhv. Serum BIGH3 og ULBP2 niveauer blev ikke statistisk korreleret med alder, køn, histologisk klasse, samlet tumor stadie, eller TNM klassifikation af pc i denne case-kontrol undersøgelse (Støtte tabel S5). Disse fund indikerer, at ULBP2 kan være en hidtil ukendt serum markør til PC detektion.

serumniveauer af BIGH3 (A), ULBP2 (B), og CA 19-9 (C) blev målt i 154 patienter med pancreascancer (PC) og 142 raske kontrolpersoner (Ctrl). Data er præsenteret som Kassegrafer. (D), ROC-kurve analyser af evne BIGH3, ULBP2, CA 19-9, og de to-markør panel bestående ULBP2 og CA 19-9 at skelne pc patienter fra kontroller.

Den effekt af ULBP2 og CA 19-9 til PC screening

serum niveauer af CA 19-9, et aktuelt anvendte serum PC biomarkør, blev desuden analyseret i de samme prøver. Vi fandt, at serum CA 19-9 niveauer var højere i PC patienter end hos raske kontroller (63,4 ± 24,4 versus 28,3 ± 20,2 U /ml,

s Restaurant 0,0001, figur 3C.); ligesom ULBP2 blev CA 19-9 niveauer ikke korreleret med klinisk-patologiske karakteristika (Støtte tabel S5). Yderligere analyse viste, at der ikke var nogen sammenhæng mellem de to molekyler i patientens kohorte (r = 0,061,

s

= 0,453 ved Pearson korrelation, Støtte Figur S4). Ved 40 U /ml, cutoff værdi i øjeblikket anvendes til PC screening, de sensitivitet og specificitet værdier for CA 19-9 var 84,4% og 74,6%, hhv. Især anvende en afskæringsværdi på 60 pg /mL for ULBP2, var vi i stand til at skelne 21 af 24 PC patienter med CA 19-9 niveauer 40 U /ml fra raske individer. Desuden 24 af 36 raske individer med CA 19-9 niveauer 40 U /ml kunne være længere skelnes fra patienter baseret på ULBP2 niveauer. 60 pg /mL

Nytten af ​​ULBP2 og CA 19 -9 som detection markører blev yderligere testet ved at påføre en ROC-kurve analyse. Denne analyse viste, at ULBP2 (AUC = 0,862; 95% konfidensinterval [CI], 0,821-0,904) udføres lidt bedre end CA 19-9 (AUC = 0,856; 95% CI, 0,809-0,902) som en screening markør (fig. 3D). Vigtigst, en logistisk regressionsmodel [26] viste, at den diagnostiske kapacitet af kombinationen af ​​ULBP2 og CA 19-9 var større end den af ​​enten markør alene (AUC = 0,910; 95% CI, 0,877-0,943;. Fig 3D) . Kollektivt, disse resultater, at ULBP2 kunne være en nyttig serum PC markør, især når de anvendes sammen med CA 19-9.

egnethed ULBP2 og CA 19-9 til PC tidlig påvisning

Vi derefter evaluerede egnethed ULBP2 som en tidlig påvisning markør for PC ved at teste serum ULBP2 hos patienter med tidlige fase primære tumorer (TNM-T1 /T2), ingen lymfeknude metastaser (TNM-n0), og ved begyndelsen af ​​den samlede tumor stadier (stadie I-II). Vi fandt, at serum ULBP2 niveauer signifikant højere hos patienter med tidlige fase primære tumorer (205,7 ± 184,3 pg /ml,

s

0,0001, n = 34), ingen lymfeknude metastaser (191,6 ± 155,2 pg /ml,

s

0,0001, n = 57), og på et tidligt samlet tumor stadie (181,2 ± 158,8 pg /ml,

s

0,0001, n = 106) end hos raske kontroller (51,4 ± 64,6 pg /mL; n = 142;. figur 4A). Serum CA 19-9 niveauer blev også forhøjet i de tidlige stadier af primær tumor (56,3 ± 26,9 U /ml,

s

0,0001), lymfeknude metastaser (62,1 ± 25,5 U /ml,

p

0,0001), og den samlede tumor stadie (60,7 ± 24,4 U /ml,

s

0,0001) sammenlignet med raske kontroller (28,3 ± 20,2 U /ml, n = 142,) ( fig. 4B). ROC kurve analyser viste desuden, at ULBP2 var mere passende end CA 19-9 til at skelne raske kontrolpersoner fra patienter med PC diagnosticeret som TNM-T1 /T2 (AUC = 0,854 [95% CI, 0,778 til 0,930] versus AUC = 0,796 [95% CI, 0,690-0,901]), TNM-n0 (AUC = 0,866 [95% CI, 0,811-0,920] versus AUC = 0,841 [95% CI, 0,764 til 0,917]) eller fase I /II (AUC = 0,846 [95% CI, 0,798 til 0,895] versus AUC = 0,839 [95% CI, 0,782-0,896]. figur 4C). Endnu vigtigere er, at kombinationen af ​​de to markører var bedre til at skelne mellem raske individer og TNM-T1 /T2 (AUC = 0,883; 95% CI, 0,816-0,949), TNM-N0- (AUC = 0,893; 95% CI, 0,841-0,946), eller fase I /II-pc-patienter (AUC = 0,897; 95% CI, 0,856-0,937) end enten markør alene (figur 4C).. Disse resultater antyder, at ULBP2 er en potentielt nyttig serummarkør til PC tidlig påvisning, navnlig i forbindelse med CA 19-9.

Serumniveauer af ULBP2 (A) og CA 19-9 (B) i raske kontroller ( Ctrl) blev sammenlignet med patienter med tidlige fase PC. Data er præsenteret som Kassegrafer. (C), ROC-kurven-analyser af evnen hos ULBP2 (sort linie), CA 19-9 (stiplet linie), og en kombination af begge proteiner (tyk linie) at skelne den tidlige fase PC patienter fra kontroller.

Blood ULBP2 niveauer hos patienter med andre typer kræft

for at teste, om ULBP2 er også en markør for andre maligne sygdomme, vi bestemt ULBP2 i blodet hos patienter med CRC, NPC, og GC. Vi fandt, at serum ULBP2 niveauer trended at være højere hos patienter, der lider af NPC (65,5 ± 74,3 pg /ml,

s

= 0,122, n = 28) sammenlignet med raske kontroller (51,4 ± 64,6 pg /ml) og var moderat, men signifikant, højere i CRC patienter (70,6 ± 73,8 pg /ml,

s

= 0,038, n = 29;. figur 5A); plasmaniveauer af ULPB2 var ikke signifikant forskellig mellem raske individer (86,1 ± 101,2, n = 25) og GC patienter (78,1 ± 79,7 pg /ml, n = 30,

s

= 0,673;. figur 5B). Imidlertid blev serum ULBP2 niveauer påfaldende forhøjet i pc-patienter sammenlignet med dem i CRC (200,2 ± 168,6 versus 70,6 ± 73,8 pg /ml,

s

0,0001) og NPC (200,2 ± 168,6 versus 65,5 ± 74,3 pg /ml,

s

0,0001) patienter (figur 5A).. Den iagttagelse, at ULBP2 niveauer var uændrede eller kun marginalt forhøjet i to andre gastrointestinale cancerformer, CRC og GC, antyder, at ULBP2 kan udgøre en relativt specifikt PC markør.

(A), Serum ULBP2 niveauer i raske kontroller (Ctrl ) blev sammenlignet med dem hos patienter med nasopharyngeal carcinom (NPC, n = 28) og colorectalt carcinom (CRC, n = 29). (B), Plasma ULBP2 niveauer i kontroller (Ctrl, n = 25) blev sammenlignet med dem i mavecancerpatienter (GC, n = 30).

Diskussion

CA 19 -9 øjeblikket betragtes som den mest praktiske serum PC markør [27], [28]. Men fordi CA 19-9 er også forhøjet i andre gastrointestinale sygdomme, herunder pancreatitis, hepatitis, biliær obstruktion, og andre gastrointestinale kræftformer, [9], [27], [28], dens specificitet ikke er pålidelig. Endvidere er det ikke udtrykkes hos forsøgspersoner med Lewis a-b- genotype [29], og dårligt differentieret PC synes at producere mindre CA 19-9 end moderat eller godt differentierede cancere [28], hvilket begrænser dets påvisningssensitivitet. Det er klart, identifikation af nye PC-markører, der omgås disse begrænsninger ville være en velkommen udvikling.

I denne undersøgelse anvendte vi en integreret tilgang, kombineret analyser af PC celle secretome og transkriptom at identificere nye PC markør kandidater, og give den første bevis på, at ULBP2 er en potentiel hidtil ukendt kandidat serummarkør til PC diagnose. ULBP2 blev overudtrykt i PC celler sammenlignet med tilstødende ikke-kræft væv (fig. 2). Bead-baserede immunoassays udført med mere end 150 serumprøver fra PC patienter viste, at serum ULBP2 niveauer ikke kun skelnes patienter fra raske donorer, men også demonstreret stort potentiale til PC tidlig påvisning (fig. 3 og 4). Selv om flere potentielle serum PC markører er blevet rapporteret, har meget få blevet vist at være bedre end CA 19-9 [30], [31]. Vigtigere er det, vores sammenligning af serum ULBP2 med CA 19-9 i denne case-kontrol undersøgelse viste, at serum ULBP2 er overlegen i forhold til CA 19-9 som en tidlig diagnostisk markør (fig. 4). Denne konstatering er særlig vigtig i lyset af det faktum, at de fleste pc-patienter dør inden for et år, fordi de ikke er diagnosticeret indtil kræft når et fremskredent stadium [1]. Den diagnostiske og prognostiske potentiale ULBP2 i et klinisk miljø skal kontrolleres ved hjælp af en større serie af serumprøver. Desuden har flere kandidater, der er anført i tabel 1 ikke undersøgt i detaljer til PC, men deres ekspressionsniveauer kunne undersøges i PC væv ved hjælp af humant protein Atlas (HPA) database, der indeholder den immunhistokemiske (IHC) farvning profiler af 10118 proteiner i en række af cancerøse og ikke-cancervæv baseret på 13154 antistoffer (version 7.1, https://www.proteinatlas.org/) [32]. Vi søgte 8 proteiner i HPA-databasen og fundet 5 af dem blev detekteret i mere end 50% af PC sektioner undersøges. Noteworthily blev alfa-opløseligt NSF fastgørelse protein, annexin A11, og ERO1-lignende protein alfa udtrykkes i mere end 50% af PC sektioner med moderat til stærk IHC-farvning (Støtte Tabel S6). Disse tre proteiner kan repræsentere som potentielle pc biomarkører, der berettiger yderligere undersøgelser.

En konsensus har coalesced omkring ideen, at en effektiv og nøjagtig påvisning af tidlige fase kræft sandsynligvis vil basere sig på markør paneler, der besidder bedre specificitet og følsomhed end hver markør alene [26], [33]. Som bemærket ovenfor, er CA 19-9 øjeblikket anvendes til PC detektion, men dens anvendelse som en primær screening middel er problematisk. Derfor en markør panel, der kombineret CA 19-9 med andre nyttige markører, såsom ULBP2, kunne øge evnen til at opdage og overvåge kræft. Faktisk kombinationen af ​​begge mærker udviste en forbedret diagnostisk effekt sammenlignet med den traditionelle tilgang med CA 19-9 alene, især med hensyn til påvisning af tidlige fase PC (fig. 4).

Selvom ULBP2 har blevet rapporteret som et væv og serum prognostisk markør for ovariecancer [34] og melanom [35], henholdsvis, mener vi, at ULBP2 stadig har potentiale som en relativt specifik og nyttig serum test til PC diagnose. Et antal rækker af beviser understøtter denne: (a) ULBP2 serum /plasma-niveauer blev ikke signifikant forhøjet i GC, CRC eller NPC patienter sammenlignet med raske individer i denne undersøgelse; (B) Li et al. har rapporteret, at ULBP2 ikke kunne påvises i sera fra patienter med ovariecancer [34]; (C) Paschen et al. viste, at ULBP2 ikke var målbar i mere end 20% af testede sera fra melanom patienter, især hos patienter tidlige fase [35]; og (d) ULBP2 modsætning CA 19-9, synes ikke at blive udtrykt på et lavere niveau i dårligt differentieret PC end i moderat eller godt differentierede kræftformer (Støtte tabeller S4 og S5). evaluering af ULBP2 som bugspytkirtelkræft markering, vil imidlertid kræve store counter-screening, især ved hjælp af serumprøver fra pancreatitis patienter.

ULBPs og dominerende histokompatibilitetskompleks-klasse I-relaterede kæde (MIC) er celleoverfladen ligander for NK og T-celle-udtrykt immunoreceptor (NKG2D), der sjældent udtrykkes af normale celler, men forekommer i en bred vifte af maligniteter [36], [37]. Disse ligander kan aktivere naturlige dræberceller (NK) og cytotoksiske T-celler ved binding til NKG2D, og ​​efterfølgende bidrage til cellemedieret cytolyse og clearance af cancer [38], hvilket antyder, at tumorceller overeksprimerer disse ligander er mere modtagelige for cellemedieret immun overvågning. Faktisk har MIC udtryk blevet beskrevet som en indikator for bedre prognose i CRC patienter [39], og frigivelsen af ​​NKG2D ligander fra tumorceller er tidligere blevet påvist som en ny kræft immunoevasion mekanisme [40], [41]. Det er for nylig blevet foreslået, at proteolytisk afgivelse af ULBP2 fra tumorceller medieres af matrix-metalloproteaser (MMP), og kan forringe immunogeniciteten af ​​tumorceller [41]. Via secretome analyse i dette studie, kunne detekteres flere MMP’er, herunder MMP-1, -7, -9, -11, -13, -14, og -28 i CM fra PC cellelinier (Støtte tabel S1 og S2) . Desuden har forhøjet ekspression af MMP-7, -8, -9, og -11 blevet beskrevet i PC væv; to af disse, MMP-7 og MMP-11, er stærkt associeret med dårlig prognose cancer [42]. Disse observationer kollektivt tyder på, at forhøjede serum ULBP2 niveauer i PC patienterne kunne afspejle inddragelse af proteolytisk spaltning af MMPs frigivet fra kræft selv. Ved at aktivere NK og cytotoksisk T-cellemedieret immunitet, eliminering af ULBP2 opløselige form kan være en effektiv terapeutisk strategi i PC. Denne spændende mulighed berettiger yderligere undersøgelse.

Som konklusion, vi heri rapporterer, at ULBP2 serumniveauer i PC patienter er væsentligt højere end hos raske kontroller. Kombinationen af ​​ULBP2 og CA 19-9 udkonkurrerede hver markør alene i skelne PC patienter fra raske personer. Endnu vigtigere, en analyse af arealet under ROC-kurven viste, at ULBP2 var bedre CA 19-9 i diskriminere patienter med tidlig-stadie bugspytkirtelkræft fra raske kontrolpersoner. Således kan ULBP2 repræsentere en ny og nyttig serum biomarkør for primær screening for kræft i bugspytkirtlen.

Støtte oplysninger

figur S1.

Påvisning af BIGH3 udtryk i 31 pancreas cancer væv ved immunhistokemi.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s001

(PDF)

Figur S2.

Påvisning af ULBP2 udtryk i 67 pancreas cancer væv ved immunhistokemi.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s002

(PDF)

Figur S3.

standardkurve for ULBP2 bestemt ved perle-baseret immunassay udviklet i hus.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s003

(PDF)

Figur S4.

Korrelation af serum ULBP2 og serum CA 19-9 niveauer.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s004

(PDF)

tabel S1.

Liste af proteiner identificeret i BxPC-3 konditioneret medium.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s005

(PDF)

tabel S2.

Liste af proteiner identificeret i MIA PaCa-2 konditioneret medium.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s006

(PDF)

tabel S3.

Sammenhæng mellem klinisk-patologiske funktioner og BIGH3 udtryk i vævssnit fra 31 patienter kræft i bugspytkirtlen.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s007

(PDF)

Tabel S4.