PLoS ONE: MicroRNA-150 forudsiger en Gunstige Prognose i patienter med epithelial kræft i æggestokkene, og Hæmmer Cell Invasion og metastase ved at undertrykke transkriptionsrepressor ZEB1

Abstrakt

MicroRNA (MIR) -150 er blevet rapporteret til at blive dramatisk nedreguleret i human epitelial kræft i æggestokkene (EOC) væv og patienternes serum sammenlignet med normale kontroller. Denne undersøgelse havde til formål at undersøge den kliniske betydning og molekylære mekanismer i miR-150 i EOC. I den aktuelle undersøgelse, viste kvantitativ real-time PCR-analyse, at MIR-150 blev signifikant nedreguleret i humane EOC væv sammenlignet med normale vævsprøver. Derefter viste vi de betydelige sammenslutninger af miR-150 nedregulering med aggressive klinisk-patologiske funktioner i EOC patienter, herunder høj klinisk fase og patologisk klasse, og kortere overordnede og progressionsfri overlevelse. Endnu vigtigere er, den multivariate analyse identificerede miR-150 udtryk som en selvstændig prognostisk biomarkør i EOC. Efter dette, demonstrerede luciferasereporteren assays at zinkfinger E-Box Binding homeobox 1 (ZEB1), en afgørende regulator af epitel-til-mesenchymal overgang (EMT), var et direkte mål for MIR-150 i EOC-celler. Endvidere fandt vi, at ektopisk ekspression af MIR-150 effektivt kunne inhibere celleproliferation, invasion og metastase ved at undertrykke ekspressionen af ​​ZEB1. Desuden er vi også observeret en signifikant negativ korrelation mellem miR-150 og ZEB1 mRNA-ekspression i EOC væv (rs = -0,45, P 0,001). Afslutningsvis disse resultater giver overbevisende dokumentation for, at afvigende ekspression af MIR-150 kan spille en rolle i tumorudvikling og prognosen hos patienter med EOC. Desuden vore data viser, at MIR-150 kan fungere som en tumorsuppressor og modulerer EOC celleproliferation og invasion ved direkte og negativt regulerer ZEB1, hvilket indebærer genekspressionen af ​​MIR-150 kan være en potentiel terapeutisk strategi til EOC.

Henvisning: Jin M, Yang Z, Ye W, Xu H, Hua X (2014) MicroRNA-150 forudsiger en gunstige Prognose i patienter med epithelial kræft i æggestokkene, og Hæmmer Cell invasion og metastase ved at undertrykke transkriptionsrepressor ZEB1. PLoS ONE 9 (8): e103965. doi: 10,1371 /journal.pone.0103965

Redaktør: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Forskningscenter, Saudi-Arabien

Modtaget: 25. maj 2014; Accepteret: 9 jul 2014; Udgivet: 4 August, 2014

Copyright: © 2014 Jin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Natural Science Foundation of Shanghai Municipal Health Bureau (nr 20114y079); Medicin og Engineering Foundation of Shanghai Jiaotong Universitet (nr YG2011MS33). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) repræsenterer den femte mest dødbringende gynækologisk malignitet og stammer fra æggestokkene overflade, inklusion cyster i æggestokkene parenkym, eller fra den nærliggende distale æggelederen epitel [1]. Fordi der er få effektive biomarkører og terapier, EOC er en aggressiv sygdom, som medfører anslået 125.000 dødsfald verden over årligt [2]. Fem-års overlevelsen af ​​patienter med EOC er kritisk afhængig af det kliniske fase på patienternes diagnose; hvis diagnosticeres og behandles, mens lokaliseret (fase I og II), kan de 5-årige overlevelsesrater nå over 90% [3]. Men de fleste EOC patienter diagnosticeret som avanceret sygdom (fase III og IV), hvor 5-års overlevelsen er kun 30-40% [4]. Disse data antyder, at det kliniske resultat af EOC patienter kan være signifikant højere med tidlig diagnose, men i øjeblikket er der ingen ikke-invasiv metode til nøjagtigt at detektere EOC på et tidligt stadium. I betragtning af dette scenario, udvikling af hidtil ukendte og effektive diagnostiske og prognostiske molekylære biomarkører for EOC er nødvendig. Salg

MikroRNA’er (miRNA), som en ny klasse af små ikke-kodende enkeltstrengede RNA’er, er for nylig blevet påvist at regulere gen ekspression post-transkriptionelt gennem basepar komplementære til bindingsstederne på 3′-UTR af mål-mRNA, der fører til mål-mRNA-spaltning eller translationel undertrykkelse [5]. Ved at binde med deres målgener, er miRNA impliceret i forskellige biologiske processer, herunder celleproliferation, apoptose samt celledifferentiering [6]. En voksende beviser har rapporteret, at miRNA kan spille vigtige roller i kræftcellen invasion og metastase. Især i EOC, Yeh et al. [7] indikerede nedregulering af miRNA-138 i de meget invasive celler, og dens funktion som inhibitor af cellemigration og invasion; Wang et al. [8] fandt, at MIR-182 kan virke som et onkogent miRNA og fremme cancercellevækst, invasion, og kemoresistens ved at målrette PDCD4 i EOC celler; Wu et al. [9] foreslog, at MIR-145 kan modulere EOC vækst og invasion ved at undertrykke p70S6K1 og MUC1, fungerer som en tumorsuppressor. Disse tidligere undersøgelser forudsat indledende fingerpeg for bidragene fra tab eller gevinst funktion af specifikke miRNA til tumorigenese og kræft progression af EOC.

MIR-150, lokaliseret på kromosom 19q13, er blevet angivet som en hæmatopoietisk-specifik miRNA i der er observeret malignt lymfom og at være signifikant nedreguleret i tumorceller sammenlignet med raske celler [10]. Den abnorme ekspression af MIR-150 er også blevet fundet i andre forskellige faste tumorvæv, såsom lungecancer, mavecancer, kolorektalcancer, endometrisk cancer, EOC, og pancreascancer [11] – [16]. Især, Vang et al. [14] fandt, at miR-150 viste lav ekspression i de fleste primære EOC væv; Shapira et al. [15] rapporterede også, at MIR-150 viste mindst en 10-gange fald i ekspression i præ-kirurgisk plasmaprøver fra kvinder diagnosticeret med EOC sammenlignet med plasmaprøver fra kvinder uden en kendt pelvic masse (raske kontroller). Disse resultater indebærer en mulig rolle miR-150 i human EOC, der fik os til at identificere og funktionelt validere miR-150-associerede kliniske betydning og molekylære mekanismer i EOC.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

Kliniske prøver blev opnået fra Xinhua hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Kina. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, og undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Xinhua hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Kina.

For kvantitativ real-time PCR assay, 100 EOC vævsprøver og 10 normale æggestokkene vævsprøver blev snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C efter operationen, der blev udført på Institut for Obstetrik og Gynækologi, Xinhua hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine i december 2006 til januar 2008. Alle 10 normal ovariale væv blev opnået fra kvinder, som undergik hysterectomies for benign sygdom. Alle EOC patienter blev behandlet uden præoperativ strålebehandling, kemoterapi eller hormonbehandling. Kirurgisk iscenesættelse blev etableret i henhold til den internationale sammenslutning af Gynækologi og obstetrik (FIGO) system. De kliniske funktioner i 100 EOC patienter blev opsummeret i tabel 1.

Regelmæssig opfølgning (interval: 2.08-119.06 måneder, 62,86 måneder i median, 62.66 måneder i gennemsnit) blev udført efter behandling af alle 100 EOC patienter indskrevet i den aktuelle undersøgelse, med deres overlevelse, bliver dødsdato og dato for sidste opfølgning registreres. Samlet overlevelse (OS) blev defineret som tidsperioden fra datoen for diagnosen på vores center til dødsdagen eller den sidste opfølgning. Progressionsfri overlevelse (PFS) blev defineret som tidsperioden fra diagnose på vores center til progressiv sygdom, død andre årsager end progression, eller en anden primær cancer.

Cell kultur

humanovarie serøs cystisk adenocarcinomacellelinie OVCAR3 og human serøs papillære cystisk adenocarcinom cellelinie SKOV3 blev erhvervet fra American Tissue Type Collection (Manassas, VA). Begge cellelinier er egnede transfektions værter. Alle celler blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt kalveserum (GIBCO) i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C.

RNA og miRNA-ekstraktion

i mRNA kvantificering, totale RNA’er fra cellelinier og væv blev ekstraheret ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. For miRNA kvantificering blev totalt miRNA ekstraheret fra cellelinier og væv ved hjælp af Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA) ifølge producentens anvisninger.

Kvantitativ realtids-PCR-assay

i mRNA og miRNA kvantificering, blev kvantitativ real-time PCR-analyse udført for at henholdsvis detektere ekspressionsniveauerne af mIR-150 og ZEB1 i cellelinier og væv. Kort beskrevet 10 ug af små RNA og 20 ug af total RNA blev underkastet revers transkription. CDNA’et blev anvendt til amplifikation af modent MIR-150, ZEB1 og de endogene kontroller, U6 og β-actin, ved PCR. De anvendte PCR-primere var som følger: MIR-150 fremad, 5′-CAG TAT TCT CTC CCA ACC CTT GTA-3 ‘og revers 5′-AAT GGA TGA TCT CGT CAG TCT GTT-3′, U6 fremadrettet, 5’- ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3 ‘og omvendt, 5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′; ZEB1 fremadrettet 5’-CAG GCA GAT GAA GCA GGA TG-3 ‘og revers 5′-CAG CAG TGT CTT GTT GTT GTA G-3′; β-actin fremadrettet 5’-GGC GGC ACC ACC ATG TAC CCT-3 ‘og revers 5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3’. PCR-betingelserne var:. Indledende denaturering ved 95 ° C i 3 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s, 62 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s

Real- time PCR blev udført under anvendelse SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) på en ABI 7300HT real-time PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Standardkurver blev dannet, og den relative mængde af MIR-150 eller ZEB1 blev normaliseret til mængden af ​​U6 eller β-actin henholdsvis. Relativ kvantificering af target genekspression blev evalueret ved brug af 2

-. △△ CT metode

Konstruktion af ekspressionsvektorer og celle transfektion

pcDNA_6.2-GW /EmGFP-miR plasmid vektoren (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med en spectinomycin-resistent gen blev anvendt til at konstruere en mIR-150 overudtrykkende plasmid. En 62 bp DNA-fragment med modne MIR-150 eller en negativ kontrol (NC) uoverensstemmende sekvens blev kemisk syntetiseret og tilsat til denne vektor ved Shanghai Shenggong Biotech (Shanghai, Kina).

EOC-celler blev høstet og udpladet på 6-brønds plader med 70-80% konfluens natten over før transfektion. HSA-MIR-150 vektor og NC blev transficeret med Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved en koncentration på 100 nM i 48 timer ved 37 ° C ifølge producentens anvisninger.

ZEB1 siRNA og celletransfektion

ZEB1 siRNA (siRNA-ZEB1) og kontrol siRNA (siRNA-NC) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) og blev transficeret ind EOC celler under den logaritmiske vækstfase ved hjælp Lipofectamine 2000 liposom (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) ved en koncentration på 100 nM i 48 timer ved 37 ° C ifølge producentens anvisninger. Ekspressionsniveauet af ZEB1 blev påvist ved Western blot for at bestemme interferens for ZEB1.

Western blot-analyse

EOC celler blev høstet 72 timer efter transient transfektion og Western blot-analyse blev udført for at detektere ekspressionsniveauerne af ZEB1 protein. Cellerne blev lyseret ved anvendelse af RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,8, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS). Proteinerne blev opløst på en SDS denaturerende polyacrylamidgel og derefter overført til en nitrocellulosemembran. Filtrene blev blokeret i PBS-Tween skummetmælk og undersøgt med anti-ZEB1 antistof (fortynding 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) eller undersøgt med anti-β-actin-antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) . β-actin blev anvendt som en intern kontrol til en normalisering af kandidatgener. Membranerne blev vasket og inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer. Proteinekspression blev vurderet ved forøget kemiluminescens og udsættelse for kemiluminescens film (Pierce Biotechnology).

Luciferase reporter assay

3′-UTR af ZEB1 mRNA blev klonet og indført i nedstrøms luciferse gen i pGL3 /luciferase-vektoren (Promega, Madison, WI, USA). Mutanten 3′-UTR af ZEB1 mRNA blev klonet under anvendelse af vildtype 3′-UTR som en skabelon og indsat i pGL3 /luciferase som beskrevet for vildtype 3′-UTR. EOC-celler blev dyrket i plader med 24 brønde og blev co-transficeret med MIR-150 efterligner og pGL3-ZEB1-wt eller pGL3-ZEB1-mut. Ved 48 timer efter transfektion blev EOC celler høstet og luciferaseaktiviteten blev målt ved anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) ifølge producentens anvisninger. De Renilla luciferase aktiviteter blev anvendt som en intern kontrol. blev udført forsøgene uafhængigt tredobbelt.

In vitro celleproliferationsassay

In vitro celle proliferation af EOC celler transficeret med HSA-MIR-150 vektor og NC vektoren blev bestemt ved 24, 48 og 72 timer ved hjælp af CellTiter 96 Aqueous One Solution celleproliferationsassay kit (Promega, Madison, WI) ifølge producentens protokol. Absorbansen ved 490 nm blev målt under anvendelse af en mQuant Universal Microplate Spectrophotometer (BioTek, Winooski, VT). Data er præsenteret som gennemsnittet for tredobbelte eksperimenter.

In vitro invasion assay

invasion evne EOC-celler transficeret med HSA-MIR-150 vektor og NC vektor blev testet i Matrigel coated celle kultur kamre (8 um porestørrelse, Millipore, Billerica, MA, USA). EOC-celler blev transficeret og dyrket til konfluens eller nær ( 90%) sammenløb i 24-brønds skåle. Derefter blev EOC-celler resuspenderet i 200 pi serumfrit 1640 medium blev anbragt i det øvre kammer af indsatsen med Matrigel. Medium med 5% FBS blev tilsat til de nedre kamre ifølge en kemoattraktant. Efter 24 timers inkubation blev celler, der forbliver på den øvre membran omhyggeligt fjernet. Celler, som havde invaderet gennem membranen blev manuelt talt ved 200 ganges forstørrelse fra ti forskellige områder af hvert filter. Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer.

In vitro migration assay

Migrationen evne EOC-celler transficeret med HSA-miR-150 vektor og NC-vektor blev testet i Corning Transwell indsætte kamre. Kort fortalt, 48 timer efter transfektion blev EOC-celler resuspenderet i 200 pi serumfrit 1640 medium blev anbragt i det øvre kammer af indsatsen uden Matrigel. Medium med 5% FBS blev tilsat til de nedre kamre ifølge en kemoattraktant. Efter 24 timers inkubation blev celler, der forbliver på den øvre membran omhyggeligt fjernet. Celler, der var migreret gennem membranen blev manuelt talt ved 200 ganges forstørrelse fra ti forskellige områder af hvert filter. Alle eksperimenter blev udført tre gange.

Statistisk analyse

Data er udtrykt som middelværdi ± S.E. Sammenligninger mellem grupper blev udført ved hjælp af Kruskal- Wallis test for kontinuerlige variabler og χ

2 test for kategoriske variable. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til overlevelse analyse, og forskelle i overlevelse blev estimeret under anvendelse af log-rank test. En multivariat overlevelse analyse blev udført for alle parametre, der var betydelig i de univariate analyser ved hjælp af Cox-regressionsmodel. P 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

nedregulering af miR-150 i humane EOC væv

Expression niveau af miR-150 i 100 EOC vævsprøver og 10 normal æggestokkene. vævsprøver blev påvist ved QRT-PCR og normaliseret til RNU6B. Som et resultat, ekspressionsniveauet af MIR-150 i EOC væv var signifikant lavere end i normale ovariale væv (EOC vs. Normal: 2,38 ± 0,80 vs. 3,83 ± 0,77, P 0,001, figur 1). Medianværdien (2,36) af MIR-150-ekspression i alle EOC væv påvises ved QRT-PCR blev anvendt som en cutoff punkt til klassificeret 100 EOC patienter til MIR-150-lav (n = 58, 58,00%) og MIR-150- . høj (n = 42, 42,00%) udtryksgrupper

resultaterne viste, at ekspressionsniveauet af mIR-150 i EOC væv var signifikant lavere end i normale ovariale væv (EOC vs. Normal: 2,38 ± 0,80 vs. 3,83 ± 0,77, P. 0,001)

nedregulering af miR-150 medarbejdere med aggressiv tumor progression af human EOC

tabel 1 viste sammenhængen mellem forskellige clinicopathologic variabler og miR -150 ekspressionsniveauer i tumor prøver fra EOC patienter. EOC væv med avanceret klinisk stadie (III~IV) oftere viste lav miR-150 udtryk end dem med lav klinisk fase (I~II, P = 0,005, tabel 1). Derudover MIR-150-ekspression udviste en tendens, der korrelerede med patologisk bedømmelse (P = 0,02, tabel 1). Vi fandt, at MIR-150 aberrerende blev nedreguleret i tumorvæv med høj patologisk kvalitet sammenlignet med dem med lav patologisk kvalitet. Imidlertid blev miR-150-ekspression ikke forbundet med andre clinicopathologic variabler, herunder alder, klasse, histologisk type og residual tumor efter operationen (alle P 0,05).

nedregulering af miR-150 medarbejdere med dårlig prognose hos patienter med EOCs Salg

OS og PFS kurver blev plottet ifølge ekspressionsniveauet af mIR-150 i tumorprøver fra EOC patienter ved Kaplan-Meier-metoden. Som vist i figur 2, EOC patienter med lav MIR-150-ekspression havde signifikant kortere samlede (P 0,001, figur 2A) og progressionsfri (P 0,001, figur 2B) overlevelse end dem med høj MIR-150-ekspression gjorde

Epiteliale æggestokkene kræftpatienter med lav miR-150-ekspression havde betydeligt kortere samlet (P 0,001) og progressionsfri (P 0,001) overlevelse end dem med høj miR-150 udtryk gjorde

.

univariat analyse med Cox proportionel risiko model identificeret tre prognostiske faktorer: klinisk fase, patologisk kvalitet og miR-150 udtryk. De andre klinisk-patologiske træk, såsom alder, klasse, histologisk type og residual tumor efter operation, var ikke statistisk signifikante prognostiske faktorer (tabel 2). En multivariat analyse af prognosen faktorer med en Cox proportionel risiko model bekræftet, at klinisk udvikling og miR-150-ekspression var to væsentlige uafhængige prædiktorer for både OS og PFS hos patienter med EOC (tabel 3).

miRNA-150 mål ZEB1 i EOC væv

for at bestemme, hvordan den nedregulering i miR-150 udtryk kan fremme tumor progression, de kandidat målgener af miR-150 blev indsamlet fra miRTarBase (Release 4.5: November 1, 2013, https://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/), der har samlet mere end halvtreds tusind miRNA målgruppen interaktioner (MTIs), som er indsamlet ved manuelt opmåling relevant litteratur efter data mining af teksten systematisk at filtrere forskning artikler relateret til funktionelle studier af miRNA [17], [18]. I den aktuelle undersøgelse, kun valgte vi de kandidat målgener, som blev valideret eksperimentelt ved reporter assay, western blot og kvantitativ real-time PCR. Som følge heraf blev tre gener, såsom MYB, EGR2 og ZEB1, valgte kandidat målgener af MIR-150. Desuden blev RNAhybrid (Version 2.1, https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html) anvendes til at beregne den minimale frie energi (MFE) af duplex miRNA: mRNA [19]. Den miRNA er hybridiseret til målet i en energisk optimal måde. RNAhybrid blev optimeret til at vise hybridisering ved 3’UTR af målgenerne. Duplex miRNA: mRNA med lavere MFE er mere stabil end den, med højere MFE. Som følge heraf MFE værdierne af MIR-150: MYB, MIR-150: EGR2 og MIR-150: ZEB1 var henholdsvis -11,51 kcal /mol, -14,30 kcal /mol og -18,00 kcal /mol. Duplex miR-150: ZEB1 har den bedste MFE, derfor valgte vi ZEB1 som kandidat target gen for miR-150 i de videre validering eksperimenter

For at kontrollere kandidat mål for HSA-miR-. 150, transficerede vi EOC-celler med HSA-mIR-150 vektor, negativ vektor (NC), og blank kontrol dyrkningsmedium (mock), hhv. Ved 24 timer efter transfektion blev western blot-analyse udføres, og resultaterne i Figur 3A~B viste, at tvungen ekspression af HSA-MIR-150 førte til en markant nedgang i ekspressionsniveauerne af endogent ZEB1 protein sammenlignet med EOC celler transficeret med NC eller mock (SKOV3 og OVCAR3 cellegrupper: både P 0,001). Desuden blev luciferase reporter assay udført ved co-transfektion af MIR-150 og et luciferase reporter plasmid indeholdende 3’UTR af human ZEB1. Ifølge miRTarBase (Release 4.5: Nov. 1, 2013 https://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/), der er en valideret bindingssted og to forudsagte bindingssteder for MIR-150 i ZEB1 3’UTR . I den aktuelle undersøgelse analyserede vi kun den validerede bindingssted som vist i figur 3D. For at kontrollere, om en direkte interaktion er involveret mellem miR-150 og dens mål onkogen ZEB1, vi udførte luciferase reporter assays (figur 3E). Vi fandt, at co-transfektion af MIR-150 sammen med vildtype 3’UTR af ZEB1 forårsagede et signifikant fald i luciferaseaktivitet sammenlignet med kontroller (figur 3F og G).

(A) Ekspressionsniveauer af miR -150 i SKOV3 og OVCAR3 celler ved kvantitativ realtids-PCR-assay på 24 timer efter transfektion af mIR-150 vektor. (B~C) The ZEB1 protein i SKOV3 og OVCAR3 celler ved Western blot ved 24 timer post-transfektion af MIR-150 vektor. β-actin blev anvendt som en intern loading kontrol. ‘NC’ refererer til negativ kontrol vektor. (D) MIR-150 bindingssteder i ZEB1 3′-UTR. (E) RNA sekvensalignment viser 3′-UTR af ZEB1 mRNA indeholder et komplementært site for frø regionen MIR-150. ZEB1 mut er en mutant med substitutioner i den komplementære region som en negativ kontrol. (F og G) Luciferase rapport assay blev udført for at bekræfte MIR-150 bindende mål. Luciferaseaktiviteten blev detekteret efter co-transfektion af pGL3-ZEB1-wt eller pGL3-ZEB1-mut, MIR-150 vektor eller negativ kontrolvektor (NC) ind SKOV3 og OVCAR3 celler.

MiR- 150 hæmmer celledeling af EOC celler in vitro ved at målrette ZEB1

for at vurdere effekten af ​​miR-150 på maligne fænotyper i EOC-celler, vi transficeret siRNA-ZEB1 til specielt at undertrykke endogene ZEB1 udtryk. Som vist i figur 4, kan transfektion af siRNA-ZEB1 effektivt inhibere ekspressionen af ​​ZEB1 protein i både SKOV3 og OVCAR3 cellelinier (både P 0,001). Derudover observerede vi, at tvungen ekspression af MIR-150 signifikant inhiberede celleproliferation af SKOV3 og OVCAR3 celler, men denne ændring blev tilbageført ved transfektion af siRNA-ZEB1. Som vist i figur 5, at tvungen ekspressionen af ​​miR-150 signifikant hæmmede celle spredning af SKOV3 og OVCAR3 celler transficeret med siRNA-NC (begge P = 0,006, 5A og C), men undlod at gøre det i SKOV3 og OVCAR3 celler transficeret med siRNA-ZEB1 (begge P 0,05, figur 5B og D).

Western blot-analyse blev udført til påvisning ekspressionsniveauerne af ZEB1 protein i siRNA-ZEB1 transficeret, siRNA-NC transficerede og ikke-transficerede (blank ) SKOV3 (A og B) og OVCAR3 (C og D) celler. β-actin blev anvendt som en intern loading kontrol.

(A og B) Vækstkurver for SKOV3 og OVCAR3 celler transficeret med siRNA-NC, og SKOV3 og OVCAR3 celler transficeret med siRNA-NC og miR -150 vektor. (C og D) Vækstkurver for SKOV3 og OVCAR3 celler transficeret med siRNA-ZEB1, og SKOV3 og OVCAR3 celler transficeret med siRNA-ZEB1 og MIR-150 vektor.

MIR-150 inhiberer migration EOC celler og invasion in vitro ved at målrette ZEB1

for yderligere at undersøge, om miR-150 hæmmede celle migration og invasion af EOC cellelinjer ved at målrette ZEB1 vi også slået ned udtryk for ZEB1 ved transfektion af siRNA-ZEB1 i både SKOV3 og OVCAR3 celler. Som vist i figur 6, den tvungen ekspressionen af ​​miR-150 hæmmede signifikant cellen migration og invasion af SKOV3 og OVCAR3 celler transficeret med siRNA-NC (begge P = 0,01, figur 6A og C), men undlod at gøre det i SKOV3 og OVCAR3 celler transficeret med siRNA-ZEB1 (begge P 0,05, figur 6B og D).

(A og C) Transwell migration assay og Matrigel invasion assay af EOC celler transficeret med siRNA-NC, og EOC-celler transficeret med siRNA-NC og mIR-150 vektor. (B og D) Transwell migration assay og Matrigel invasion assay af EOC-celler transficeret med siRNA-ZEB1 og EOC-celler transficeret med siRNA-ZEB1 og miR-150 vektor.

Negativ korrelation mellem miR-150 og ZEB1 mRNA ekspressionsniveauer i humane EOC væv

for at vurdere forholdet mellem miR-150 og ZEB1 mRNA-ekspression i EOC væv, vi yderligere detekteret ekspressionsniveauerne af ZEB1 mRNA i 100 EOC vævsprøver og 10 normal ovarievæv prøvemateriale ved QRT-PCR og normaliseret for p-actin. Som vist i figur 7A, ekspressionsniveauet af ZEB1 mRNA i EOC væv var betydeligt højere end i normale ovariale væv (EOC vs. Normal: 4,49 ± 1,52 vs. 2,41 ± 0,49, P 0,001, figur 7A). Mere interessant, at Spearman Correlation analyse viste klart negativ korrelation mellem miR-150 og ZEB1 mRNA-ekspression i EOC væv (rs = -0,45, P 0,001, figur 7B)

Expression niveau af ZEB1 mRNA i EOC væv. var signifikant højere end i normale æggestokkene væv (EOC vs. Normal: 4.49 ± 1,52 vs. 2,41 ± 0,49, P 0,001, A). Mere interessant, at Spearman Correlation analyse viste klart negativ korrelation mellem miR-150 og ZEB1 mRNA-ekspression i EOC væv (rs = -0,45, P 0,001, B).

Diskussion

EOC er stadig et stort gynækologisk problem med lav 5-års overlevelse og alvorligt truer menneskers helbred på grund af afstanden metastaser, trods rutinemæssig kirurgi og kemoterapi. Voksende beviser vise dysregulering af forskellige miRNA i EOC og antyde deres væsentlige roller i tumorigene processer, herunder celleproliferation, apoptose og motilitet. Således er afgørende for at overvinde denne dødelige sygdom afslører de molekylære ændringer i miRNA. Tidligere undersøgelser har vist, at miR-150 dramatisk nedreguleres i humane EOC væv og patienternes serum sammenlignet med normale kontroller [14], [15]. Men rollerne for miR-150 i initiering og progression af EOC og nedregulering af miR-150 udtryk i denne kræft er stadig uklart. I den aktuelle undersøgelse, vi knyttet MIR-150 til dens target-gen ZEB1, og demonstrerede deres Involvering i regulering maligne fænotyper af ovariecancerceller. Vi bekræftede nøglerolle miR-150 som en tumor suppressor ved direkte og negativt målrette ZEB1 i EOC. Beviset for dette kommer fra følgende kilder. Først, vi valideret nedregulering af MIR-150 i EOC væv under anvendelse af en stor gruppe af EOC patienter, og viste at lav MIR-150 ekspressionsniveauet var meget lavere i meget aggressive EOC væv. For det andet blev nedregulering af miR-150 identificeret som en uafhængig prognostisk markør for både overordnede og progressionsfri overlevelse hos patienter med EOC. Tredje, overekspression af MIR-150 kunne dramatisk inhiberer celleproliferation og motilitet af ovariecancerceller in vitro og i det væsentlige undertrykke protein ekspression af ZEB1. Forth, ZEB1 blev identificeret som et direkte mål for miR-150, og knock-down af ZEB1 i æggestokkene cancerceller kunne efterligne hæmning af celleproliferation, migration og invasion af miR-150. Desuden fandt vi en signifikant negativ korrelation mellem miR-150 og ZEB1 mRNA-ekspression i EOC væv.

MIR-150 har vist sig at være en væsentlig miRNA impliceret i udviklingen og progressionen af ​​forskellige menneskelige maligniteter. For eksempel den nedsat ekspression af MIR-150 virker som en anti-apoptotisk faktor i human diffus gastrisk cancer og kortikotropin hypofysetumorer [20]; Injektion af MIR-150-transducerede muselymfomceller i immunsvækkede mus kan frembringe færre tumorer end kontrolceller [21]; Tvungen ekspression af MIR-150 kan inhibere tumorcellevækst in vitro og inhibere tumorvækst i dyremodeller gennem direkte nedregulering af DKC1 og AKT2, reduktion af phosphorylerede AKTser473 /4 og en stigning i tumorsuppressorer såsom Bim og p53, hvilket fører til telomerase-aktivering og immortalisering af cancerceller [22]; miR-150-ekspression reduceres i ikke-småcellet lungekræft og blev stærkt forbundet med tumor fase, tumor størrelse og patienternes overlevelse signifikant lavt udtryk i avanceret-fase, blev stor størrelse og dårlig prognose tumorer bemærket [13]. Nedsat ekspression af MIR-150 er også observeret i esophageal pladecellecarcinom og er indikeret til at blive indskudt i maligne potentiale, såsom tumor dybde, lymfeknudemetastase, lymfe invasion, venøs invasion, klinisk stadieinddeling og dårlig prognose [23]. I den aktuelle undersøgelse, vore data er i overensstemmelse med disse tidligere offentliggjorte undersøgelser, der beviser for ændringer i MIR-150-ekspression fremme tumordannelse. Vi viste, at miR-150 var funktionelt involveret i at undertrykke EOC cellevækst, migration og invasion, som blev støttet af både cellekultur undersøgelser og kliniske data. I cellekultur eksperimenter, overekspression af MIR-150 førte til faldet af EOC celleproliferation og cellemotilitet. I kliniske prøver, miR-150 var dramatisk nedreguleret i EOC væv med høj klinisk fase og høj patologisk kvalitet sammenlignet med EOC væv med lav klinisk fase og lav patologisk kvalitet, og lav miR-150-ekspression i tumorer var forbundet med dårlig overlevelse patienter med EOC

Endnu vigtigere, vores identificeret mIR-150 target var ZEB1, et medlem af zinkfinger-familien af ​​proteiner [24] -. [26]. ZEB1 er en af ​​den transkriptionelle inducer i proceduren ifølge epitel-mesenkymale overgang (EMT) i cancer af epitelial oprindelse, såsom brystcancer, lungecancer, esophageal pladecellecarcinom, gastrisk carcinom, pancreascancer, cancer i livmoderhalsen, endometriecancer og prostata kræft [23], [27] – [31]. Især i EOC, Chen et al. [32] rapporterede, at nedregulering ZEB1 ekspression med en ekspressionsvektor baseret lille hårnåle-RNA (shRNA) målretning ZEB1 (shZEB1) i EOC SKOV3-celler kunne inhibere EMT af shZEB1-SKOV3-celler og blokere shZEB1-SKOV3 celle metastase in vivo, hvilket antyder dets rolle til forøgelse EMT i EOC celler. De bemærkede også, at shRNA-medieret nedregulering ZEB1 i SKOV3 celler i væsentlig grad kan formindske tumorvækst i xenograft mus.