PLoS ONE: Induktion af Immune mediatorer i gliom samt prostata cancer celler fra ikke-dødelige Fotodynamisk Therapy

Abstrakt

Baggrund

Fotodynamisk terapi (PDT) anvender kombinationen af ​​fotosensibiliserende lægemidler og harmløse lys at forårsage selektiv skade på tumorceller. PDT er derfor en mulighed for fokal terapi af lokaliseret sygdom eller på anden måde inoperable tumorer. Derudover er der en stigende bevis for, at PDT kan inducere systemisk anti-tumor-immunitet, støtte kontrol med tumorceller, og som ikke blev fjernet ved den primære behandling. effekten af ​​ikke-dødelige PDT på adfærd og maligne potentiale af tumorceller overlevende PDT er dog molekylært ikke veldefineret.

Metode /vigtigste resultater

Her har vi evalueret ændringer i transkriptomet af menneskelige glioblastom (U87, U373) og human (PC-3, DU145) og murine prostatacancerceller (TRAMP-C1, TRAMP-C2) efter ikke-dødelige PDT

in vitro

in vivo

anvendelse af oligonukleotid microarray analyser. Vi fandt, at den samlede respons var ens mellem de forskellige cellelinjer og fotosensibiliserende både

in vitro

in vivo

. De mest fremtrædende opreguleres gener kodede proteiner, der hører til veje aktiveres af cellulær stress eller er involveret i cellecyklusstop. Denne reaktion var magen til redning respons af tumorceller efter højdosis PDT. I modsætning hertil blev tumorceller, der beskæftiger sig med ikke-dødelige PDT fundet væsentligt opregulere en række immun gener, som omfattede chemokin generne

CXCL2

,

CXCL3

IL8 /CXCL8

samt generne for IL6 og dets receptor IL6R, som kan stimulere proinflammatoriske reaktioner, mens IL6 og IL6R også kan forbedre tumorvækst.

konklusioner

Vores resultater indikerer, at PDT kan understøtte anti-tumor immunrespons og er derfor en rationel terapi, selv om tumorceller ikke kan elimineres fuldstændigt ved hjælp af primære fototoksiske mekanismer alene. Dog kan ikke-dødelige PDT også stimulere tumorvækst-fremmende autokrine loops, som ses ved opregulering af IL6 og dens receptor. Således effektiviteten af ​​PDT til behandling af tumorer kan forbedres ved bekæmpelse af uønskede og potentielt skadelige vækst-stimulerende veje

Henvisning:. Kammerer R, Buchner A, Palluch P, Pongratz T, Oboukhovskij K, Beyer W, et al . (2011) Induktion af Immune mediatorer i gliom samt prostata cancer celler af ikke-dødelige Fotodynamisk terapi. PLoS ONE 6 (6): e21834. doi: 10,1371 /journal.pone.0021834

Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center og Beckman Research Institute, USA

Modtaget: 11. december 2010; Accepteret: 13 Juni 2011; Udgivet: 30 Jun 2011

Copyright: © 2011 Kammerer et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Deutsche Krebshilfe (107.320, https://www.krebshilfe.de/deutsche-krebshilfe.html). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Fotodynamisk terapi (PDT) i onkologi er baseret på den selektive akkumulering af en fotosensibilisator (PS) i cancerceller, efterfulgt af aktivering ved lavenergi væv-gennemtrængende lys. I nærværelse af oxygen, det exciterede PS producerer reaktive oxygenarter (ROS), såsom singlet-oxygen, som er toksiske for levende celler [1].

Various PS eksisterer som alle har deres fordele og deres begrænsninger. 5-Amino-levulinsyre (5-ALA) er et naturligt forstadium til hæm i pattedyrceller. Celler metaboliserer 5-ALA til hæm, der producerer protoporphyrin IX (PpIX) som et mellemprodukt i deres mitokondrier. Fordi omdannelsen af ​​PpIX til hæm er et hastighedsbegrænsende trin, PpIX ophobes i cancerceller som følge af præference-optagelse og fastholdelse af 5-ALA. PpIX lokaliserer intracellulært til mitochondrier og til cytoplasmaet [2]. Photofrin®, på den anden side, er en exogen fotosensibilisator som også akkumuleres i cancerceller men er placeret på forskellige cellulære membraner [3]. Generelt aktivering af PS, der målretter mitokondrier føre til kræft celle apoptose, mens PS de associerer med cellemembraner overvejende inducerer nekrose [2].

Oprindeligt målet af PDT i onkologi var helt at eliminere lokaliserede tumorer . Imidlertid har den kliniske anvendelse af PDT til behandling af cancer nu begyndt at ændre. For nylig er behandlinger blevet anvendt som søger at fremkalde vaskulær målretning eller anti-tumor immune virkninger [4] – [7]. Dette indikerer, at PDT også kunne være en rationel behandling mulighed for ikke-overfladiske tumorer, såsom prostatakræft og glioblastoma.

Prostatacancer er den tredje hyppigste årsag til kræft dødsfald for nordamerikanske mænd [8]. Den primære behandling af prostatacancer omfatter radikal prostatektomi, androgen-berøvelse terapi, strålebehandling og transperineal brachyterapi. Alle disse behandlinger har en række bivirkninger, som har en betydelig indvirkning på patienterne [9]. På grund af de dramatiske forbedringer i tidlig prostatakræft diagnose fokale behandlinger, såsom kryoterapi, høj intensitet fokuseret ultralyd og PDT dukker op som nye terapeutiske muligheder [10], [11]. Den største ulempe ved fokale terapi er usikkerheden på komplet tumor celle udryddelse, især da lidt er kendt om svaret af tumorceller, der undslipper fra den centrale terapi. En uønsket scenario er, at disse tumorceller Gain øget malignitet eller begynder at hemmelige faktorer, der understøtter proliferation eller infiltration af tilbageværende kræftceller i en parakrin måde.

glioblastoma multiforme (GBM) er den mest almindelige og mest aggressive form for primære hjernetumorer hos mennesker. Den mediane overlevelsestid på GBM patienter er 14,6 måneder [12]. Et af de karakteristiske træk ved glioblastomas er deres diffuse infiltrativ karakter [13]. For nylig blev det observeret, at fluorescens-vejledt resektion og gentagne PDT betydeligt kan forlænge median overlevelse hos patienter med GBM [14], [15]. Endvidere blev overlevelse GBM patienter langsigtet efter PpIX-baserede PDT rapporteret fra andre kliniske undersøgelser [16], [17]. På trods af disse lovende observationer forskellige spørgsmål skal behandles for at optimere PDT som en behandlingsmulighed for GBM. For eksempel er reaktion af tumorceller, som overlever PDT grund af deres avancerede infiltration i det normale hjernevæv ikke veldefineret, men kunne være et mål for en adjuvans terapi.

Vi har tidligere rapporteret, hvordan transkriptomet af prostata cancer cellelinie PC-3 reagerer på 5-ALA-baserede PDT [18]. Overraskende PC-3-celler opreguleres ikke kun stress og DNA reparation gener, men også gener, der koder for proteiner, som er involveret i reguleringen af ​​immunresponser, herunder visse kemokiner og cytokiner. Derfor ønskede vi at vide, om ikke denne bemærkning gælder for andre PS, for andre prostatacancer cellelinjer, for tumorceller i en anden væv oprindelse og for tumorer

in vivo

. Til dette formål relativt analyserede vi den hele genomet transkriptionelle ændringer efter lavt niveau, ikke-dødelige PDT i to humane prostata- og glioblastomcellelinier hver, sammenlignet transkriptomet af den humane prostatacancer line PC-3 efter 5-Ala- og Photofrin -baseret PDT og analyseret de transkriptionelle ændringer i murine prostatacancerceller subkutant transplanteret ind albino C57BL /6-mus efter PDT. Vi observerede, uafhængig af vævet oprindelse og typen af ​​sensibilisator, en markant transkriptionel stimulering af gener, der koder for proinflammatoriske cytokiner, som stimulerer og tiltrækker overvejende myeloide leukocytter og, på samme tid, aktivering af gener, der koder proteiner involveret i cellecyklusstop. Tilsammen kan det uundgåelige ufuldstændige ødelæggelse af tumorvæv ved PDT under kliniske omgivelser endda støtte anti-tumor immunrespons.

Resultater

Sensibilisering og bestrålingsforhold for ikke-dødelige

in vitro

PDT

for at kunne reproducerbart indlæse tumorceller med fotosensibilisator bestemte vi kinetikken og 5-ALA-koncentration afhængighed af PpIX dannelse i tumorcellelinjer anvendes. Vi valgte to humane prostata (PC-3, DU145) og to glioblastoma-cellelinier (U87, U373) samt murine prostata carcinoma cellelinier TRAMP-C1 og TRAMP-C2 som er afledt af tumorer i transgene mus linje “transgen model af prostatakræft “(TRAMP) [19], [20]. Ophobningen af ​​fotosensibilisator blev kvantificeret ved flowcytometri (fig 1E). Vi bemærkede store cellelinje-specifikke forskelle i niveauerne af PpIX dannelse efter inkubation med PpIX precursor 5-ALA (Figur 1A-C, E). Dette kunne skyldes forskelle i ATP-bindende kassette transportør ABCG2 som vides at være ansvarlig for eksport af PpIX fra celler [21]. Faktisk, idet tilstedeværelsen af ​​ABCG2 mRNA i de forskellige cellelinjer korreleret med lave niveauer af PpIX efter inkubation med 5-ALA med de højeste mængder af ABCG2 mRNA observeret for TRAMP-C1 og TRAMP-C2 celler, som udviste de laveste PpIX ( Figur S1, figur 1). Desuden blev akkumulering af PpIX formindsket 2-3 gange når inkubation med 5-ALA blev udført i nærvær af serum i medierne (figur 1B, C). Dette skyldtes sandsynligvis binding af PpIX til serumalbumin når transporteres ud af cellen, således forskydning af PpIX steady state niveauer [22], [23]. Baseret på disse data blev en 16 h inkubationstid med 50 ug /ml 5-ALA i nærvær eller fravær af 5% serum valgt til den humane prostata (PC-3, DU145) og det humane glioblastom og murine prostatacancercellelinjer (U87, U373; TRAMP-C1, TRAMP-C2), hhv. En temmelig lav, men effektivt sensibiliserende Photofrin koncentration (5 ug /ml) blev udvalgt til at undgå mulig cytotoksicitet i fravær af lys (Figur 1D).

Tumor celler blev inkuberet med 50 pg /ml (A, E) eller med de angivne koncentrationer af 5-ALA (B, C) eller Photofrin (D) i nærvær (PC-3, U373, A, D, E og røde linier i B, C) eller fravær af 5% serum (TRAMP -C1, TRAMP-C2; A og blå linier i B, C). Medmindre andet er angivet, blev PpIX indholdet af cellerne kvantificeres efter 16 timer ved anvendelse af flowcytometri i fluorescens kanal 3 (medianværdier ± standardafvigelse). Repræsentative histogrammer for 5-ALA-behandlede humane tumorcellelinier er vist i E. Ubehandlede celler blev anvendt som kontrol; en repræsentant kontrolprøve uden 5-ALA inkubation vises (rød udfyldt kurve). De fotosensibilisatorer viste mættelig akkumulering afhængigt inkubationstid og koncentration. Serum i dyrkningsmediet stærkt reduceret ALA-baserede PpIX formation. Betingelserne for sensibilisator loading anvendes til transkriptomet analyser er angivet med lodrette punkterede linjer. AU, arbitrære enheder.

Dernæst lys doser for bestråling af sensibiliserede celler blev defineret som ville tillade celleoverlevelse i en periode på 24 timer til 48 timer, hvorunder beskadigede celler kunne aktivere gener. Vi fandt, at PDT betingelser, som forårsagede en reduktion af aktivitet i celleviabilitetstest med 30% 24 timer efter PDT i sammenligning med en ikke-bestrålet cellekultur snarere resulterede i vækststandsning med ringe eller intet tab af celler i en periode på 48 timer (Figur 2E). For at bestemme lysdosis inducerer en 30% reduktion af cellelevedygtighed ved måling mitokondriel aktivitet blev celler sensibiliseret som beskrevet ovenfor og bestrålet med stigende doser af laserlys. Tab af celleviabilitet steg med tiden efter bestråling og lysdosis og var forskellige mellem cellelinier. For eksempel en 4 gange højere lysdosis var nødvendig for at fremkalde en 30% reduktion af cellelevedygtighed 24 timer efter PDT for DU145 celler sammenlignet med U373 eller TRAMP-C1-celler (figur 2A-D; Tabel S1). Denne differentielle følsomhed af de forskellige cellelinjer korrelerede ikke med deres evne til at akkumulere PpIX i nærvær af 5-ALA. Interessant, lysdoser der fører til samme tab 30% af cellelevedygtighed inducerede et andet niveau af apoptose i de analyserede humane cellelinjer som målt ved aktiveringen af ​​caspase 3 og caspase 7. der blev observeret ingen eller en ubetydelig grad af apoptose i de prostatakræft-cellelinier DU145 og PC-3, henholdsvis maksimal apoptose blev observeret i glioblastom cellelinier under de samme betingelser (figur 2F). Salg

Human (A, B, DF) eller murine tumorceller ( C) blev sensibiliseret ved inkubation med 50 ug /ml af 5-ALA (DU145: 100 ug /ml) eller med de angivne koncentrationer af Photofrin i 16 timer i nærvær (A, D, E, F, PC-3, DU145 ) eller fravær af 5% serum (B, C, F, U87, U373). Celler blev bestrålet med laserlys (635 nm) leverer de angivne lysdoser. Efter de indikerede tidspunkter blev cellelevedygtighed og caspase3 /7-aktivering bestemmes og vises enten som% af kontrol for hvert tidspunkt (A-D, F) eller i relative fluorescensenheder (RFU, E, F). Bemærk de forskellige tilbøjelighed prostata og gliom celler til at lide af apoptose ved lavdosis PDT.

Den transskription af en delmængde af kemokin og cytokingener er stærkt opreguleret i tumorceller efter ikke-dødelige

in vitro

PDT

for at bestemme de gener, som allerede er liberaliseret 4 timer og 24 timer efter ikke-dødelige PDT vi udførte transkriptom analyse af bestrålede og ikke-bestrålede menneskelige og murine tumorceller sensibiliseret ved inkubation med 5 Ala (betingelser er opsummeret i tabel S1). En stor del af probe sæt /gener opreguleres efter PDT blev delt mellem cellelinier selv mellem cellelinjer afledt tumorer i forskellige væv oprindelsesbetegnelser (fx ~30-60% 24 timer efter PDT; Tabel S2, tabel S3). Pathway analyser ved hjælp af Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) program afslørede, at 24 timer efter bestråling, ud af i alt 3479 gen-sæt, 208 gen sæt blev signifikant opreguleret i glioblastom celler, 156 gen sæt i prostatakræft, og 508 gen sæt i de kombinerede prøver (p 0,01) (tabel S4). De sæt af gener mest fremtrædende opreguleret i alle cellelinjer tilhører veje aktiveres af cellulært stress, herunder processer igangsat af skader gennem ultraviolet lys, hypoxi og ioniserende stråling samt gen-sæt, de kodede proteiner, der hindrer spredning ( “negativ regulering af celle cyklus “,” cellecyklusstop “og” apoptose “tabel 1). Mest signifikant blev en række immune pathways transkriptionelt aktiveret af ikke-dødbringende PDT, sådanne veje indbefatter “proinflammatoriske gener”, “interferon-β-vejen” og “neutrofil aktivering i sårheling” (tabel 1, figur 3). Gene Ontology gensæt mest markant nedreguleret i alle analyserede cellelinier viste sig at være associeret med mitochondriale pathways (3 ud af 5), som er i overensstemmelse med mitokondrier er det sted, PpIX produktion og primær skade ved ROS (tabel S4) .

sæt berigelse Gene analyse (GSEA) afslørede aktivering af et sæt gener 24 timer efter ikke-dødbringende PDT af alle 4 prostata- og glioblastomcellelinier (data er vist for PC-3), som også viser sig at være karakteristisk for neutrofil aktivering under sårheling [55]. Opregulering illustreres af koncentrationen af ​​de lodrette sorte linjer (der repræsenterer gen sæt medlems stillinger inden for rangeret gen listen) på venstre side af genet listen ( “nul cross”, se “vandfald plot” i bunden af ​​grafen) . Denne fordeling fører til en høj og markant berigelse score (maksimale afvigelse af den grønne linje fra nul; P 0,001 og falsk opdagelse sats (FDR) 0,001). |

Fire timer efter ikke-dødbringende PDT, transkripter af “tidlige respons gener” var blandt de stærkest inducerede og mest højt udtrykte gener i både humane og murine tumorceller (figur 4, tabel S2, S3 tabel, figur S2A-C). Denne gruppe af gener koder for transkriptionsfaktorer som FBJ murine osteosarkom viral onkogen homolog (FOS), jun, aktiverende transkriptionsfaktor 3 (ATF3), tidlig vækst svar 1 (EGR1) og DNA-skader-inducerbare udskrift 3 (DDIT3). Opregulering af disse gener fører igen til transkription af typiske stressgener såsom varme shock protein (HSP) gener og kan initiere G1 og apoptose (DDIT3) [24], [25]. Faktisk inducerbare medlemmer af HSP-genet familien, nemlig varme shock 70 kDa protein 6 (

HSPA6

) efterfulgt i rang af

HSPA1A

HSPA1B

var de mest dominant inducerede gener 4 timer efter PDT i de humane tumorcellelinier (Figur 4A-D). I de murine TRAMP-C1 og TRAMP-C2 celler transskripter af orthologer af de to sidstnævnte medlemmer var fremherskende 4 timer efter PDT (fig S2B, C). Dominans af transkripter af tidlig reaktion transkriptionsfaktor og HSP-gener blev tabt 24 timer efter PDT, som blev ledsaget af øget aktivitet af to store grupper af gener involveret i modstående cellulære processer. Et stærkt stimuleret og på højt niveau udtrykt gruppe af gener koder for proteiner, som udviser anti-proliferative, pro-apoptotiske og anti-invasive funktioner induceres af genotoksisk stress ligesom ROS (vækst anholdelse og DNA-skader-inducerbare beta (GADD45B), dual-specifikke fosfatase 1 (DUSP1), ADAM-metallopeptidase med thrombospondin type 1 motiv 1 (ADAMTS1), homocystein-inducerbare, endoplasmatisk reticulum stress-inducerbare ubiquitin-lignende domæne medlem 1 (HERPUD1) [26], zink finger protein 36 (ZFP36); differentiering vækst faktor 15 /NSAI-aktiverede gen 1 (GDF15 /NAG-1 [27], spermidin /spermin N1-acetyltransferase 1 (SAT-1) [28]). Den anden gruppe af gener koder for proteiner, som er kendte eller formodede styrke celleoverlevelse efter cellulær stress ved at inhibere apoptose og cellecyklusstandsning (

hjerne udtrykt X-bundet 2

(

BEX2

) [25]), eller ved at støtte afgiftning af skadelige forbindelser genereret af ROS (

aldo-keto reduktase 1C1

/

1C2 Hotel (

AKR1C1

/

AKR1C2

)) (Figur 4A-D).

Tumor celler blev underkastet ikke-dødbringende PDT efter sensibilisering med 5-ALA (A, C-F) eller Photofrin (B). Totalt RNA blev isoleret 4 og 24 timer efter PDT og analyseret ved hybridisering til oligonucleotid-mikroarrays. Efter normalisering blev fold ændring af genekspression mellem tilsvarende bestrålede og ikke-irridiated prøver beregnes og plottet mod udtrykket niveau efter PDT. Kun gener ( “probe sæt”) er vist som var op- og nedreguleret ≥3 gange og for hvilke en “nuværende call” blev registreret for alle bestrålede og ikke-bestrålede prøver henholdsvis. Den stærkest up-eller ned -regulated og mest højt udtrykte gener i prøverne identificeres ved gen-symboler. multiple skildring af gen symboler skyldes tilstedeværelsen af ​​flere probesæt for enkelte gener. gener, der koder immunmodulerende proteiner desuden markeret med små cirkler. Bemærk, at de sidstnævnte gener er blandt de stærkest opreguleres gener. En farvekode blev anvendt til at diskriminere grupper af gener, der koder funktionelt beslægtede proteiner (se boxed fig legende). for alle prøver betyder udtrykket værdier fra dubletter blev anvendt. FU, fluorescensenheder.

Interessant blandt generne stærkt opreguleres af tumorcellerne efter PDT var en række immunrespons-gener, især kemokin og cytokingener samt chemokin og cytokin receptor-gener (figur 4, figur 5). Ekspression af en væsentlig del af disse gener var signifikant opreguleret 24 timer efter PDT ofte i både prostata- og glioblastomcellelinier (P 0,05, to-vejs-ANOVA test). Blandt de mest konsekvent opreguleres gener var chemokin generne

CXCL2

,

CXCL3

interleukin-8 Hotel (

IL8

) /

CXCL8

samt cytokingen

IL6

(figur 5A-C, H). Opregulering af

CXCL2

,

CXCL3

gener blev observeret allerede 4 timer efter PDT i de fleste cellelinjer (data ikke vist). Ekspressionsanalyse af netværket af genprodukter der interagerer med IL6 afslørede en mulig autostimulatory løkke i PC-3-celler involverer IL6 og dets receptorunderenheder IL6R /IL6RA og IL6ST /IL6RB (figur 6). Notatet udtryk for

CCAAT /forstærker bindende protein β

(

CEBPB

), som koder for en transskription faktor kendt for at være involveret i regulering af ekspressionen af ​​

IL6

, var 3 fold og 4,2-fold induceret 4 timer og 24 timer efter PDT henholdsvis (ikke vist). Endvidere gener, der koder både negative og positive regulatorer af IL6 signalering nemlig undertrykker af cytokin signalering 3 (SOCS3) og Janus kinase 1 (JAK1) /JAK2 fik henholdsvis opreguleret. På

IL6

gen vi har tidligere vist, at transkriptionel opregulering også udslag forhøjet sekretion af det kodede protein af PC-3-celler efter 5-ALA-baserede PDT [18]. Ingen statistisk signifikant aktivering blev observeret for nogle chemokin og cytokingener (fx

CXCL1

(P = 0,25),

CCL26

(P = 0,24, data ikke vist);

IL18

, fig 5J);

CXCL14

viste sig at være signifikant nedreguleret (figur 5E). At validere ekspressionsdataene opnået ved microarray oligonukleotid eksperimenter analyserede vi mRNA-niveauerne af et udvalgt sæt af gener (IL6, CXCL8 og CXCL14) i totalt RNA fra PDT-behandlede og kontrolceller 24 timer efter bestråling. Vi fandt en god overensstemmelse mellem de to sæt udtryk værdier bestemmes af de to forskellige kvantificeringsfremgangsmåder (Figur S3, figur 5). Dette afspejles af koefficienter af beslutsomhed R

2 tæt på 1,0 (0,947 ± 0,072) og en lignende statistisk signifikant op- (IL6, CXCL8) og nedregulering (CXCL14) som findes ved hjælp af oligonukleotidet microarray datasæt.

Tumorceller blev underkastet ikke-dødbringende PDT efter sensibilisering med 5-ALA eller Photofrin og RNA blev analyseret efter 24 timer restitution fra PDT ved hybridisering til oligonucleotid-mikroarrays som beskrevet i teksten til fIG 4. Mean ekspressionssystemer værdier i relativ fluorescens enheder (RFU) og deres afvigelser for udtrykt interleukin og kemokin og interleukin og kemokinreceptor-gener er vist. For

CXCL8

CXCL14

gener den 202859_x_at og 222484_s_at probe sæt blev anvendt henholdsvis. For PC-3 og U87 prøver betyder udtryk værdier fra dubletter for DU145 og U373 prøver blev anvendt enkelte målinger. Signifikansniveauerne (P) blev beregnet under anvendelse af to-vejs ANOVA.

Ændringerne af genekspression 4 timer og 24 timer efter PDT målt ved oligonucleotid-microarray analyser afbildet som gange ændring (fluorescens af bestrålet /ikke -irradiated prøve). Størrelsen af ​​fold ændring angives af forskellige farver ( 1,2-fold, hvidt; ≥1.2-fold, 2-fold, orange; ≥2-fold, rød). Den stærkeste opregulering af ekspression blev observeret for

IL6

gen (12,3 gange), som kunne en del af en autostimulatory loop med også opreguleres IL6 receptorunderenheder (IL6R og IL6ST). Størrelsen af ​​ovaler angiver det absolutte udtryk niveau efter PDT ( 100 FU, lille symbol, ≥100, 1000, medium symbol ≥1000, stort symbol). Linjerne mellem ovaler symboliserer forskellige typer af interaktion mellem proteinerne eller generne.

Der er imidlertid også en fraktion af gener (-25%), som fortrinsvis blev opreguleret (≥4 gange) i PC-3 eller U87 celle og dermed kunne udvise væv-of-oprindelse-specifik stimulering. De mest differentielt stimuleret gener er enten allerede forholdsvis stærkt udtrykt i ikke reagerer cellelinje (fx

EGR1

,

IL11

,

AKR1C1-3

i U87, CD55 i PC -3), eller sandsynligvis ikke tilhører repertoiret af ekspressér gener i den respektive cellelinje (

nuklear receptor underfamilie 4 gruppe A medlem 1 Hotel (

NR4A1

),

tumornekrosefaktor -α-induceret protein 6

(

TNFAIP6

),

dehydrogenase /reduktase (SDR familie) medlem 9

(

DHRS9

),

cyklin-afhængige kinase inhibitor 1A Hotel (

Kip2

) i U87) (tabel S5)

Til sammenligning kun få gener /probe sæt blev nedreguleret . 3 gange efter PDT (figur 4E , F og data ikke vist). De mest stærkt udtrykte gener, der blev nedreguleret ofte kodet cellevækst og overlevelsesfremmende proteiner.

ROS-inducerbare gener er mere effektivt opreguleres af 5-ALA-baserede PDT end med Photofrin-medieret PDT

Interessant, selvom endogent produceret PpIX og den syntetiske oligomere porphyrin Photofrin menes at virke i forskellige cellulære rum [3], blev et lignende sæt af gener opreguleres både ved 4 timer og 24 timer efter ikke-dødbringende PDT i PC-3-celler (figur 4A, B). Trods et tilsvarende niveau af inhibering af cellernes levedygtighed 4 timer efter ikke-dødbringende PDT (5-ALA 15 ± 3%; Photofrin 17,5 ± 0,5%; tabel 1) 14% (28/204) af generne /probesæt, der var mere end 3 gange opreguleret efter 5-ALA-baserede PDT, udstillet en ≥4 gange højere transkriptionel aktivering i forhold til den, der blev observeret efter Photofrin-medieret PDT (tabel S6). De fortrinsvis opreguleres gener, der blev udtrykt på et højt niveau omfattede blandt andre gener, tidlige respons gener (

FOS

), HSP gener (

HSPD1, HSPA6

), celle overlevelse gener (histon klynge 1 gener), samt immunrespons gener (

IL1A

,

CCL26

). I modsætning hertil udtrykte ingen gen kraftigt efter PDT ( 1000 RFU). Blev selektivt stimuleret af Photofrin-baserede PDT (tabel S6)

Transkriptionel opregulering af proinflammatoriske gener i TRAMP-C2 tumorer efter ikke-dødelige PDT

Da ekspressionen af ​​chemokin og cytokingener konsekvent var opreguleret i cellelinier efter 5-ALA-baserede PDT

in vitro

undersøgte vi, om 5-ALA-baserede PDT også kunne inducere ekspressionen af proinflammatoriske gener i tumorer, som kunne støtte anti-tumor immunreaktioner. Vi bruges som en tumor model murine TRAMP-C2 prostatatumorceller dyrket subkutant i albino C57BL /6-mus, som tillod transdermal bestråling af tumoren med synligt lys. Først vi optimeret sensibilisering betingelser ved at måle akkumulering af PpIX i huden over tumoren efter i.p. injektion af 5-ALA som en tilnærmelse til PpIX dannelse i tumorvæv. I de fleste mus, blev maksimale PpIX niveauer i huden nået efter 2-3 timer (figur 7A). En lignende kinetisk af PpIX akkumulering blev observeret ved spektrofotometrisk bestemmelse af PpIX i tumorekstrakter (Figur 7B).

kinetik PpIX ophobning i mus væv efter i.p. injektion af 5-ALA blev bestemt enten ved direkte måling af PpIX fluorescens i huden, der dækker tumor (A) eller ved fluorescens spektroskopiske bestemmelse af PpIX i tumorekstrakter fra en enkelt mus hver, der blev aflivet på det anførte tidspunkt (B). PpIX akkumulering i forskellige væv i forhold til TRAMP-C2 tumorer 3,5 timer efter 5-ALA injektion er vist i (C). I (A), er en typisk kinetisk af PpIX ophobning i huden vist. Maksimal akkumulering af PpIX i hud- og tumorvæv blev observeret ~180 min efter 5-ALA injektion. Tumorer blev underkastet PDT (75 J /cm

2) efter sensibilisering med 5-ALA i 180 minutter. Bemærk, at 5-ALA-medieret PDT efter maksimal sensibilisering kun havde en marginal (D) eller forbigående inhiberende virkning på tumorvækst (E) selv efter to eksemplarer anvendelse med en uges mellemrum. For transkriptom analyse, lysfølsomme tumorer fra en enkelt mus blev hver behandlet eller ikke med laserlys (635 nm; 75 J /cm

2), udskåret 4, 14 eller 24 timer efter bestråling. RNA blev isoleret og analyseret ved hybridisering til oligonucleotid-mikroarrays. Efter normalisering blev gange ændring af genekspression mellem bestrålede og ikke-irridiated prøver beregnes og afbildet mod ekspressionsniveauet efter PDT (F). Kun gener ( “probe sæt”) vises som blev opreguleret ≥3 gange og for hvilke en “nuværende call” blev registreret i det bestrålede prøve. De mest kraftigt opregulerede og mest højt udtrykte gener i prøverne identificeres ved gen-symboler. Multipel skildring af gen symboler skyldes tilstedeværelsen af ​​flere probesæt for individuelle gener. Gener, der koder immunmodulerende proteiner desuden markeret med små cirkler. AFU; arbitrære fluorescensenheder; n, antallet af mus testes.

I forhold til TRAMP-C2 tumorer, blev relative høje niveauer af PpIX fundet i ekstrakter af lever, sædblæren og hud (figur 7C). Dette kan skyldes, at den stærke udtryk for PPIX efflukstransporteren gen

ABCG2

i C2 tumorer og C2 tumor cellelinje (figur S1) og kunne forklare de dosisbegrænsende bivirkninger, der ses i mus efter PDT. Følgelig er de lysdoser, der kan anvendes førte til en ineffektiv styring af tumorvækst (figur 7D, E). Transkriptom analyser under anvendelse af RNA isoleret fra bestrålede og ikke-bestrålede hele tumorer 14 timer og 24 timer efter PDT afslørede, at den del af stærkt transskriptionelt aktiverede gener efter ikke-dødbringende PDT består mest gener, der koder proinflammatoriske faktorer (figur 7F, figur S2). Som observeret for PDT-behandlede tumorcellelinjer,

Cxcl2

,

Cxcl3

IL6

var blandt de mest stærkt opreguleret gener, selv om vi ikke kan udelukke, at disse cytokiner blev udtrykt ved stromale celler i tumormikromiljøet eller tumorassocieret immunceller. Interessant,

Sprr2h Hotel (

lille prolin-rige protein 2

) et gen er kendt for at være reguleret af IL6 /STAT3 signalering [29] er den anden mest stærkt induceret gen 14 timer efter PDT (figur 7F). Fire timer efter PDT,

Hsp1a

Hsp1b

tilhørte gruppen af ​​stærkest aktiverede og mest udtrykte gener (figur 7F).

Diskussion

der findes forskellige grunde til, at ikke-dødelige PDT anvendes ofte utilsigtet til tumorceller

in vivo

. En af disse grunde er, at celler i en tumor er ofte heterogene og kan afvige i deres evne til at akkumulere PS samt i deres følsomhed over for oxidativ stress. Faktisk observerede vi en slående variabilitet af PpIX akkumulering mellem de forskellige tumorcellelinjer anvendes. Dette er ikke begrænset til tumorceller

in vitro

, men blev også observeret i tumor celler

in vivo

[30], [31]. I den foreliggende undersøgelse identificerede vi gener, der er opreguleret i kræftceller på ikke-dødelige PDT

in vitro

og sammenlignet dem til gener, der blev ramt i tumor væv

in vivo

. Vigtigere, fandt vi, at cancerceller uanset deres vævsoprindelse (prostata og hjerne) i sig selv opregulere immunrelaterede gener som en reaktion på PDT-induceret celle stress. Dette indikerer, at oxidativt stress inducerer lignende responser i forskellige celletyper alle havde til formål at begrænse følsomhed af cellerne til ROS, at reparere påført celle defekter og koordinere immunresponser bestemt til at rydde irreversibelt beskadiget væv fra organismen.