PLoS ONE: Udskilte frizzlede-relateret protein 4 Forhindrer gliom Stem-lignende celler ved at vende Epithelial til Mesenchymale Transition, inducere apoptose og Faldende Cancer Stem Cell Properties

Abstrakt

Wnt vej er integreret involveret i reguleringen af ​​selv- fornyelse, proliferation og vedligeholdelse af kræft stamceller (CSCS). Vi undersøgt virkningen af ​​Wnt-antagonisten, secerneres Frizzled-relateret protein 4 (sFRP4), til modulering epitelial til mesenkymale overgang (EMT) i CSCS fra humane glioblastom cellelinier, U87 og U373. sFRP4 kemo-sensibiliseret CSC-berigede celler til de mest almindeligt anvendte anti-glioblastom stof, temozolomid (TMZ), ved tilbageførsel af EMT. Cell bevægelse, kolonidannelse, og invasion

in vitro

blev undertrykt af sFRP4 + TMZ behandling, som korrelerede med kontakten af ​​ekspressionen af ​​markører fra mesenkymale (Twist, Snail, N-cadherin) til epitel (E-cadherin ). sFRP4 behandling fremkaldte aktivering af Wnt-Ca

2

+ pathway, som antagoniserer Wnt /ß-catenin pathway. Betydeligt blev kemo-sensibilisering virkning sFRP4 korreleret med reduktionen i ekspressionen af ​​lægemiddelresistens-markører ABCG2, ABCC2, og ABCC4. Effekten af ​​sFRP4 + TMZ behandling blev påvist

in vivo

hjælp nøgne mus, som viste minimum tumor transplantation hjælp CSCS forbehandlet med sFRP4 + TMZ. Disse undersøgelser viser, at sFRP4 behandling ville bidrage til at forbedre respons på almindeligt anvendte kemoterapeutika i gliomer ved at modulere EMT via Wnt /ß-catenin vej. Disse resultater kunne udnyttes til at designe bedre målrettede strategier for at forbedre kemo-respons og i sidste ende eliminere glioblastom CSCS

Henvisning:. GB, Arfuso F, Millward M, Dharmarajan A, Warrier S (2015) Udskilt frizzlede-relateret protein 4 Forhindrer gliom Stem-lignende celler ved at vende Epithelial til Mesenchymale Transition, inducere apoptose og Faldende Cancer Stem Cell Egenskaber. PLoS ONE 10 (6): e0127517. doi: 10,1371 /journal.pone.0127517

Academic Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES

Modtaget: December 13, 2014 Accepteret: April 15, 2015; Udgivet: 1 juni 2015

Copyright: © 2015 G et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Curtin University Kommercialisering Advisory Board og Skole Biomedicinsk Institut strategiske forskningsmidler, Indien Research Initiative midler (Prof Arun Dharmarajan), midler fra Institut for Bioteknologi, Indien (BT /PR8493 /mED /31/226/2013) og midler, som Prof Michael Millward, University of Western Australia, Perth, Western Australia

Konkurrerende interesser:. Dette arbejde blev støttet af Curtin University Kommercialisering Advisory Board og Skole Biomedicinsk Institut strategiske forskningsmidler, Indien Research Initiative midler (Prof Arun Dharmarajan), finansiering fra Institut for Bioteknologi, Indien (BT /PR8493 /mED /31/226/2013) og midler tilvejebragt af Prof Michael Millward, University of Western Australia, Perth, Western Australia. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

glioblastoma multiforme (GBM) er en WHO grad IV tumor og er den mest almindelige og aggressive hjernetumor hos voksne [1] . GBM udgør 15 til 20% af alle primære intrakranielle tumorer og trods multimodale behandlingsmuligheder, den overordnede prognose er grim med en median overlevelse på omkring 14,6 måneder og to års overlevelse på 30 [2]%. De primære årsager til de fattige resultater af GBM er de høje tilbagefald og resistens mod kemoterapi. Den væsentligste årsag til gentagne tilbagefald og varieret kemoterapeutisk respons har vist sig at være de cancerstamceller (CSCS) inden for gliom tumor [3]. Gliom CSCS (GSCS) blev først identificeret ved tilstedeværelsen af ​​et unikt celleoverfladeprotein, prominin 1 eller CD133. Efterfølgende blev mange andre definerer markører identificeret for gliom CSCS. Som med CSCS fra andre tumorer, såsom blod, bryst, prostata, og colon, gliom CSCS også overudtrykker multilægemiddelresistens (MDR) markører, såsom ABC transportører, som er en af ​​de primære årsager til forøget kemo-resistens [4] .

Aktiveret selvfornyelse, øget kemo-resistens, og opreguleret epithelial til mesenkymale overgang (EMT), som er de karakteristiske kendetegn for CSCS, er blevet associeret med afvigende Wnt /β-catenin signalering [4 -6]. Adskillige proto-onkogener fremme GBM vækst og øge CSC befolkning ved at aktivere Wnt pathway komponenten, TCF-4 [7]. Secerneret Frizzled-relaterede proteiner, DKK1 til 4, og WIF1 hindre initiering af Wnt signalering ved celleoverfladen ved at interferere med interaktionen mellem Wnt ligander og FZD receptoren og coreceptor LRP5-6 [8].

Secerneret Frizzled-relateret protein 4 (sFRP4) er en af ​​fem medlemmer af SFRP familien, og har været impliceret at have en pro-apoptotiske funktion i mange væv [9-15]. Over-ekspression af sFRP4 er blevet forbundet med en nedsat hastighed af proliferation, nedsat forankringsuafhængig vækst og nedsat invasivitet i prostatacancer-cellelinie, PC-3 [16]. Silencing af SFRP gener gennem hypermethylering af promotorregionen er blevet påvist i cancere såsom leverkarcinom [17,18] og GBM [19]. I vores tidligere rapporter om gliom og hoved- og halscancer stamceller-lignende celler, sFRP4 væsentligt reduceret CSC befolkning og faldt stemness gener [20,21]. sFRP4, er et fysiologisk secerneret inhibitor i sig selv ikke har udvist potent apoptotisk evne i CSCS undersøgt. Men rollen som sFRP4 syntes at være kemo-sensibiliserende den CSCS til almindeligt anvendte kræftpsykologisk terapi, som CSCS er refraktære. I en søgen efter at løse nogle af de plausible årsagsfaktorer, som sFRP4 kunne handle på CSCS, vi studerede gliom CSCS for deres reaktion på sFRP4. Vi viser, at der er en sammenhæng mellem EMT signatur egenskaber, kemo-resistens inducerende faktorer, og sFRP4 medieret kemo-overfølsomhed i gliom CSCS; hvilket giver en virkningsmekanisme af denne Wnt antagonist. Denne kombination tilgang sFRP4 og narkotika lover for CSC-rettet terapi for at forbedre overlevelsen og reducerer glioblastom gentagelse.

Resultater

Kræft stamceller berigelse og karakterisering af gliom kugler

Vi først beriget en CD133-positiv population i U87 og U373 gliom cellelinjer ved at dyrke dem i kugleformede kulturer i fravær af serum, suppleret med vækstfaktorer LIF, EGF, og B27 i ikke-adhærente dyrkningsplader. Sfæroide kolonier er et typisk karakteristisk træk ved CSCS, som er i stand til at formere sig, forbliver udifferentieret, og bevarer deres stemness profil i serumfrie kulturer. Efter første celledød, et par af de resterende celler voksede og prolifererede hurtigt og danner neurosfære kolonier. Efter immunhistokemi for CD133-ekspression, blev der observeret en tydelig farvning af sfæroide kolonier. Dyrkning af celler i et serum-beriget monolagskultur viste farvning lavt niveau for CD133 (Fig 1A). Ekspression af CD133 mRNA var tydelig kun i kugleformede kulturer, som vist ved semikvantitativ RT-PCR (S1 Fig) og kvantitativ PCR, som viste en stigning i ekspression af CD133 i sfæroider over monolagskultur for begge cellelinier (fig 1B) . Protein ekspression af CD133 blev observeret at være højere i kugleformede kulturer end i monolagskultur for begge cellelinier undersøgt (S2 Fig). Endelig kendetegnet vi tilstedeværelsen af ​​CD133-positive celler ved flowcytometri og fandt, at 94,12% af U87 sfæroider og 83.91% af U373 sfæroider var positive for CD133, hvorimod monolagskultur havde kun 63,56% for U87 og 67,6% for U373 cellelinier henholdsvis (fig 1C).

a) mikrofotografier af monolag og sfæroide kolonier (venstre panel, skala bar = 50 um, n = 3) og CD133 markør-farvning (højre panel, skala bar = 100 um) som vist ved immunocytokemi i monolag og sfæroide kolonier af U87 og U373 cellelinier. b) Kvantitativ RT-PCR af CD133 mRNA ekspression af U87 og U373 cellelinier dyrket i CSC-medium. Resultaterne er middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg udført in triplo (* p-værdi 0,05, ** p værdi 0,01, n = 3). ML = monolag, CSC = cancer stamceller. c) Flowcytometrianalyse af CD133 i U87 og U373 celler dyrket i CSC medium.

sFRP4 undertrykker væksten af ​​GSCS fra U87 og U373 cellelinjer og øger reaktion neurosfærer at temozolomid

for at estimere effekten af ​​sFRP4 og TMZ, enten alene eller i kombination, på væksten af ​​kugleformede kolonier fra U87 og U373 cellelinjer, blev de 3D kulturer inkuberes med sFRP4 (S), temozolomid (T) eller S + T for 24h. Væksthæmning blev estimeret ved MTT, BrdU, og sfære inhiberingsassays. Anvendelse af MTT-assayet, blev det observeret, S eller T alene inhiberede proliferation af U87 og U373 sfæroider med 25%. Men S + T havde større inhiberende virkning på ca. 50% i sfæroider fra begge cellelinier (figur 2A). Et lignende mønster blev observeret ved anvendelse af BrdU-celleproliferationsassay, hvor S + T behandling blev set at inhibere proliferation op til 40% (figur 2B). I ubehandlede kontrolkulturer, viste resultaterne, at sfæroiderne forblev intakt. Behandling med S alene eller T alene viste en beskeden reduktion i sfære størrelse i modsætning til S + T, hvor opløsningen af ​​kuglerne var mere dramatisk. Dette blev yderligere bekræftet ved at mærke sfæroiderne for CD133 markør med immuncytokemi, som udviste en markant reduktion af CD133-farvning i S + T-behandlede prøver (Fig 2C). For at estimere procentdelen af ​​inhibering og døde celler blev GSCS fra U87 og U373 cellelinjer underkastet propidiumiodid (PI) farvning efter forskellige lægemiddelbehandlinger. Procentdelen af ​​raske celler var 83% i den ubehandlede kontrol, faldt marginalt til 79% i S behandlet, med en mere udtalt fald på 68% i T behandlet, som faldt drastisk til 27% i S + T behandlede GSCS fra U87-celler. I GSCS fra U373 celler, den ubehandlede kontrol havde 86% raske celler, som faldt til 55% ved S-behandling. I modsætning til U87-celler, T behandling og S + T behandling af U373 GSCS blev set at have en lignende procentdel (26%) af sunde celler (Fig 3). At afgøre, om celledød skyldes apoptose undersøgte vi afbrydelse af det mitokondrielle membran, som er en indikator for apoptose, ved hjælp af JC-1 farvestof [22]. Procentdelen af ​​apoptotiske celler steg i S, T og S + T behandlet U87 og U373, hvilket indikerer indtræden af ​​apoptose ved ændringer i mitokondrisk membranpotentiale (Fig 4). I begge cellelinjer, blev det højeste niveau af apoptose (57% for U87 GSCS og 38% for U373 GSCS) observeret i kombination behandlet GSCS. For at vurdere faldet i CD133 positive population efter lægemiddelbehandling, flowcytometri blev udført analyse. Som forventet var der et fald i CD133 positive celler i både U87 og U373 GSCS, faldet er fra 69% i den ubehandlede til 62% i S behandlet, 54% i T, behandlet til 47% i S + T behandlet U87 GSCS og fra 68% i den ubehandlede, 64% i S behandlet, 62% i T behandlet, til 56% i S + T behandlet U373 GSCS (fig 5).

a) og b) Grafer repræsenterer inhibering af U87 og U373 CSCS henholdsvis efter behandling for 24 timer med sFRP4- 250pg /ml (S), temozolomide- 25 uM (T), og sFRP4 + temozolomid (S + T). Resultaterne er middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg udført in triplo (* p-værdi 0,05, ** p værdi 0,01, n = 3). c) mikrofotografier af kugle dannende assay og immuncytokemisk farvning med CD133 efter behandling med kontrol, S, T og S + T. Kerner blev modfarvet med DAPI (blå), (skala bar = 100 um).

Flowcytometrisk analyse af cellecyklus profiler af U87 og U373 CSCS efter behandling med kontrol, S, T eller S + T efter farvning med propidiumiodid.

JC-1 mitokondrie depolarisering assay efter kontrol, S, T eller S + T behandling af U87 og U373 CSCS.

Flow cytometri af CD133-ekspression analyse af ubehandlet, S, T, og S + T behandlet U87 og U373 CSCS sammen med kontrol farvning med iso PE.

sFRP4 nedregulerer EMT fremme gener og kemo-resistens gener

Analyse ved semikvantitativ og kvantitativ RT-PCR blev anvendt til at bestemme ekspressionsniveauerne ændringer af CD133, EMT markører og lægemiddelresistente gener. Behandling af U87 og U373 GSCS med sFRP4 og TMZ resulterede i en signifikant stigning i ekspressionen af ​​epitelial markør E-cadherin. Ekspressionen af ​​den mesenchymale markør N-cadherin blev observeret at have reduceret betydeligt i S + T behandlet GSCS, med et udtalt fald i U87 GSCS. Et fald i den stemness relaterede markør CD133 blev observeret til at være dramatisk i S + T behandlede GSCS fra U87 og U373 cellelinjer. For at vurdere, om de strukturelle ændringer i EMT blev afspejlet i ændringer af transkriptionelle regulatorer af EMT, udtryk for

Snail

,

Twist

, og

Slug

blev undersøgt. Forventeligt, behandling med S + T førte til et signifikant fald i ekspression af disse tre transkriptionsfaktorer i begge cellelinier som set af RT-PCR (S3 Fig) og qPCR (figur 6A og 6B). Disse resultater peger klart til ændringer i forbindelse med EMT på det molekylære niveau. For at analysere, om følsomheden lægemidlet blev ledsaget af et fald i ekspressionen af ​​narkotika transportører, blev udtryk studier udført på

ABCG2

,

ABCC2

, og

ABCC4

. Det blev observeret, at ekspressionen af ​​disse markører reduceret betydeligt ved behandling med S + T, og niveauet af

ABCC2

var målbart i S + T behandlet U87 GSCS (Fig 6A og 6B).

a) og b) Repræsentative grafer, der viser relativ mRNA ekspressionen af ​​CSC markør, EMT-relaterede gener (

N-cadherin

,

Twist

,

Snail

, og

Slug)

og narkotika transporterer gener (

ABCG2

,

ABCC4

, og

ABCC2

) i U87 (a) og U373 (b) CSCS efter narkotikabehandling blev udført ved kvantitativ RT-PCR. Resultaterne er middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg udført in triplo (* p-værdi 0,05, ** p værdi 0,01, n = 3).

sFRP4 nedregulerer fibroblastiske markører for EMT og aktiverer Wnt /calcium vej

De typiske ændringer observeret i EMT omfatter mindre intercellulære vedhæftning, færre tætte forbindelser, og tab af cellulære polaritet. β-catenin aktivering og co-ekspression af fibroblastisk markører vimentin og α-glatmuskelactin (α-SMA) er cellulære begivenheder, der ledsager disse forandringer [23].

Vi undersøgte ekspressionen af ​​de tre EMT relaterede markører, β-catenin, α-SMA, og vimentin på proteinniveauet. I U87 sfæroide kulturer behandlet med forskellige lægemiddelkombinationer, de celler, der udtrykker α-SMA, vimentin, og β-catenin blev analyseret ved immunhistokemisk lokalisering. De sfæroide kulturer mistet deres sfæriske morfologi, og ekspressionen af ​​α-SMA og vimentin i S + T behandlede celler var svag. Cellerne havde gennemgået massive celledød, sfære forstyrrelser, og var tilhænger i S + T behandlede U87 sfærer; og andelen af ​​β-catenin farvende celler var meget lav i sammenligning med de ubehandlede kontrol sfæroide celler (Fig 7a). Den observerede mønster ved immunohistokemisk farvning blev yderligere bekræftet ved Western blotting. Behandling af U87 sfæroider med S + T resulterede i en betydelig reduktion i α-SMA, vimentin, og β-catenin-protein ekspression sammenlignet med de ubehandlede kontrol U87 sfæroide celler (Fig 7b).

a) Immuncytokemi af mesenchymal markører a glatmuskelactin (α SMA), vimentin, og ß-catenin i U87 CSCS behandlet med kontrol, S, T eller S + T (skala bar = 100 um). Kerner blev modfarvet med DAPI (blå). b) Immunoblotanalyse af α SMA, vimentin, og ß-catenin i U87 CSCS behandlet med kontrol, S, T eller S + T.

Derefter undersøgte vi virkningen af ​​sFRP4 på ikke- kanonisk arm af Wnt signalering via mobilisering af intracellulær Ca

2

+. Virkningen af ​​sFRP4 på Wnt /calcium signalvejen i CSCS blev undersøgt under anvendelse af et fluorescerende indikator FURA-2. Efter behandling med sFRP4, var der en markant stigning i intracellulær Ca

2

+ frigivelse (Fig 8), hvilket tyder på en inddragelse af ikke-kanonisk Wnt signalering i sFRP4 medieret hæmning af CSCS.

intracellulært calcium assay bestemt ved fluorescerende radiometriske Ca

2

+ indikator Fura-2, i U87 CSCS behandlet med kontrol, S, T eller S + T (* p-værdi 0,05, ** p værdi 0,01, n = 3).

klumpformet celler vise lavere kolonidannende evne, ekstracellulære matrix (ECM) penetration, og vandrende /invasiv potentiale efter behandling med sFRP4 og temozolomid

Hurtig self -renewal er kendetegnende egenskab af CSCS, og tabet af stemness resultater i differentiering og udgang fra cellen cyklus. Som en analogi, vi studerede selvfornyelse træk som en indikator for hæmning eller apoptose af CSCS. Ved kugle-dannende analyser i blød agar, sammenlignede vi evnen til at danne sfærer i ubehandlet kontrol, S, T, og S + T behandlet U87 sfæroider. Ved farvning af kolonier med krystalviolet, blev det observeret, ubehandlede GSCS dannede store kolonier, men i S alene og T alene behandlede celler, kolonierne var mindre og proliferation var svag. Derudover i U87 GSCS behandlet med S + T, kolonierne havde en drastisk reduktion i størrelse og celletal i kolonierne var beskedne (Fig 9A).

a) mikrografi billeder af blød agar koloniassay af U87 CSCS efter behandling med kontrol, S, T eller S + T. Farvning med krystalviolet angivet kolonien størrelse (skala bar = 50 um). b) Angiogen assay af U87 CSCS (behandlet for 24 timer med kontrol eller S, T eller S + T) podet på en pro-angiogenetisk ECMatrix gel pre-belagt plade. Farvning med krystalviolet opdaget rør dannelse og indledende processer (skala bar = 100 um). c) Efter behandling U87 CSC med kontrol, S, T eller S + T i 24 timer, en

in vitro

transwell migration assay blev udført. Crystal violet farvning angivne celle migration på tværs af transwell kammer (skala bar = 100 um).

Den primære evne CSCS er evnen til at initiere væksten af ​​den primære tumor og køre invasion og metastase. Der er et etableret forhold mellem procentdelen af ​​CSCS i brystkræft og manifestationen af ​​metastase [24]. Den invasive evne kan korreleres til cellernes evne til at trænge ind og proliferere gennem ECM. Vi undersøgte evnen hos U87 GSCS at vokse på en ECM og den efterfølgende inhibering af denne egenskab ved lægemiddelbehandling. Det blev observeret, at i S + T behandlede GSCS blev proliferation hæmmet efter 24 timer af samme cellepodning (Fig 9B, panel 2). Farvning med krystalviolet afslørede en klar inhibering af cellevækst gennem ECM i S + T behandlede celler (Fig 9B, panel 3). Invasion fører til metastatisk spredning, og vi undersøgte dette ved at sammenligne den metastatiske potentiale af forskellige lægemiddelbehandlede U87-GSCS bruger Matrigel invasion kammer. Vi observerede en dramatisk forskel mellem ubehandlede og S + T behandlede celler, som de ubehandlede celler migrerede fuldstændigt gennem membranen og samles som kolonier. Den vandrende potentiale S + T behandlede celler blev alvorligt hæmmet, og det blev observeret, at kun nogle få celler med differentieret morfologi havde migreret (Fig 9C).

tumorigent potentiale

in vivo

faldt efter behandling af U87 GSCS med sFRP4 og temozolomid

for at bestemme niveauet af tumorgenicitet af U87 GSCS efter behandling med S, T og S + T, observerede vi tumor udvikling i nøgne mus, der var blevet injiceret subkutant med tumorceller. På 4

th dag i injektion, dyr, som fik ingen behandlingsrelaterede udviklet tumorer, mens dyr modtager S + T behandlede GSCS havde ingen tumordannelse. GSCS behandlet med T havde en mindre tumor sammenlignet med S behandlede GSCS, men begge var mindre end den ubehandlede kontrol på 4

th dag injektion (Fig 10A). På den 10

th dag efter høst, der var væsentligt mindre volumener subkutane tumorer fra musene injiceret med S + T behandlede GSCS end det ubehandlede, S behandles, og T behandlede grupper (fig 10B).

Gennemsnitlig tumorstørrelse (a, b) efter subkutan injektion af U87 CSCS behandlet med kontrol (U), S, T eller S + T (* p-værdi 0,05, ** p værdi 0,01, n = 4).

diskussion

gliom stamceller kan opnås ved forskellige strategier såsom celle sortering baseret på overflademarkører såsom CD133, berigelse af farvestoffet effluxing side befolkning, og stof og stråling resistente cellepopulationer, der udtrykker ATP-bindende kassette transportvirksomheder og ATM proteiner henholdsvis [25,26]. I den foreliggende undersøgelse, vi beriget CSC populationer fra to humane glioblastom cellelinier, U87 og U373, ved voksende sfæroider i serumfrie kulturer og bekræftede CSC ejendom i kraft af deres udtalte forøgelse af CD133 ekspression. Brug berigede gliom stamceller fra disse to gliom cellelinjer, vi studerede deres hæmning af kemoterapeutika, suppleret med overfølsomhed med sFRP4. Vi kunne tydeligt viser, at en kombineret behandling af sFRP4 med standard lægemiddel til GBM, temozolomid, inhiberede proliferation af GSCS fra begge cellelinier, forstyrret deres sfære dannelse evne, nedsat deres kolonidannelse i blød agar-assay, og hæmmet cellecyklusfremadskriden som det fremgår af PI-farvning. Depolarisering af den mitokondriske membran er et tydeligt tegn på apoptose, hvor integriteten af ​​det mitokondrielle membran er kompromitteret [22]. Vi kunne tydeligt viser en udtalt mitokondrie membran forstyrrelser i stoffet behandlet GSCS.

For at bestemme tumorigent potentiale af lægemidlet behandlede GSCS

in vivo

, tumor udvikling blev udført i nøgne mus. Resultaterne og mønstre af

in vitro

eksperimenter blev yderligere bekræftet

in vivo

, hvor S + T kombination behandlet GSCS havde de mindste mængder af subkutane tumorer. Kemo-sensibilisering er én strategi til at overvinde kemo-modstand og involverer anvendelsen af ​​et stof til at forøge aktiviteten af ​​en anden ved at modulere mekanismerne i kemo-resistens. Vores undersøgelser viser, at sFRP4 forstærkede virkningen af ​​TMZ på gliom stamceller. Wnt signalering er en vigtig omsætningsvej involveret i normalt væv homeostase. De sFRPs er den største familie af udskilte Wnt-antagonister og er homologe med det ligandbindende cysteinrige domæne af Frizzled familien af ​​Wnt-receptorer. sFRP4 er involveret i reguleringen af ​​apoptose, spredning, vævsdannelse og tumorvækst [10,12,27,28]. Kemo-overfølsomhed ved sFRP4 vil tjene dobbelt formål: faldende den krævede kemoterapeutiske belastning til de kræftformer og fremme en vedvarende Wnt inhibering for at tilvejebringe et terapeutisk vindue til kemoterapi, samtidig skåne de normale Wnt-afhængige væv. Denne dobbelte fordel kunne forhindre langvarig brug af både Wnt-antagonist og temozolomid, og sidespor de uønskede toksiske virkninger af behandling på normale celler.

Aktivering af epitelial til mesenkymale overgang er afgørende for effektiv metastatisk kolonisering, og det er en proces aktivt opreguleret i CSCS. Den nye, afgørende træk ved CSCS er erhvervelsen af ​​mesenkymale træk og overgangen fra epitel til mesenkymale fænotype [29]. I denne undersøgelse præsenterer vi et indblik i den mekanisme af hæmning af CSCS ved sFRP4 ved at analysere de epitel og mesenkymale egenskaber af gliom stamceller efter kemo-sensibilisering med sFRP4. Ikke-adhærente sfære dannende assays er pålidelige assays anvendes til at vurdere stamcelle-aktivitet i normale væv og formodede CSCS, og neurosfære er en velundersøgte sfære assay [30]. Vi observerede, at GSCS behandlet med S + T betydeligt havde øget forankring og nedsat sfære danner evne, hvor cellerne kan vokse ud af kuglerne og overholde danne et monolag. I en lignende undersøgelse i CSCS fra hoved og hals karcinom, sfæroide kulturer, hvor der er vist til over-express EMT markører og var faldet klumpformet dannelse evne, og den øgede compliance var proportional med mesenkymale at epitel kontakt [31]. Et andet typisk fænotypisk manifestation af EMT er migration og invasion [32,33]. Vi observerede, at behandling med S + T faldt GSC invasiv gennem ECM og migration gennem transwell kamre, som kunne indbyrdes forbundne til købet af epitel træk ved dette stof kombination.

Stigning i vedhæftning og forankring er ledsaget af manifestationen af den epitheliale markør E-cadherin, desmosomer, og stramningen af ​​adherensovergange, som er forankret til cytoskelettet af ß-catenin; og ved tabet af mesenkymale definerer markører såsom cytoskeletale proteiner vimentin og glatmuskelactin [34]. Dette ledsages af en transkriptionel forskydning af faktorer, der aktiverer mesenchymal gener og undertrykke epiteliale markører, såsom sneglen, ZEB, og bHLH familien af ​​transkriptionsfaktorer, og øger aflejring af ECM protein, fibronectin. Den markante reduktion, som vi observeret af cytoskeletale proteiner, vimentin, og a glatmuskelactin og adherens krydset protein, ß-catenin, i S + T behandlet CSCS er klart vidnesbyrd om skift af status fra mesenkymale til epitel.

medlemmerne af sneglen familie- snail, Slug, og Smuc, har en fælles SNAG domæne og et zinkfinger region ved C-terminalen, hvorigennem de binder til E-bokse i promotorregionerne af målgener. Sneglen familie af transkriptionsfaktorer indleder undertrykkelsen af ​​E-cadherin ved at mediere histon modifikationer, som ændrer deres protein stabilitet og intracellulær lokalisering. Regulering af Snail proteiner er under kontrol af forskellige signaler, herunder Wnt, Shh, EGF, FGF og TGF [35]. Transskriptionsfaktoren Twist interagerer med komponenter af NuRD kompleks, Polycomb repressor komplekser PRC1 og PRC2 på E-cadherin promotor og undertrykker E-cadherin, mens binding Twist 1 til methyltransferase SET8 aktiverer N-cadherin. Inddragelsen af ​​EMT-medierende transkriptionsfaktorer blev tydeligt ses i vores undersøgelse, hvor ekspressionen af ​​

Snail

,

Slug

, og

Twist

faldt til halvdelen i S + T behandlet GSCS. I konkordans, ekspressionen af ​​funktionelle epithelial markør E-cadherin havde en to gange stigning i S + T behandlede GSCS, og dens mesenchymale modstykke N-cadherin faldt efter lægemiddelbehandling.

sFRP4 har en handling på flere niveauer på Wnt /ß-catenin vej og kan modvirke Wnt /ß-catenin og også den ikke-kanoniske Wnt /plane cellepolaritet vej ved at aktivere Wnt /Ca

2

+ vej [36]. Ophobningen af ​​Ca

2

+ af sFRP4 at vi observeret i vores studier kunne indikere aktiveringen af ​​calcineurin, hvilket har vist sig at blive stimuleret af sFRP2 via Wnt /Ca

2

+ pathway [ ,,,0],37]. Calcium er blevet impliceret som en vigtig mediator af antagonisme af Wnt signalering ved indgriben i flere punkter. En stigning i intracellulære calcium resulterer i aktiveringen af ​​calcium /calmodulin-afhængig proteinkinase II (CaMKII) og proteinkinase C (PKC), som igen antagoniserer den kanoniske Wnt-vejen [38,39]. Den resulterende apoptose som vi observeret efter sFRP4 behandling kunne således være en effekt af øgede intracellulære calciumniveauer og på sin side, kan stigningen i calcium øger reaktive oxygenarter (ROS), og ROS kan inducere apoptose [36].

CSCS spiller en integrerende rolle i tumor tilbagefald på grund af deres forbedrede kemo-resistente egenskaber. Kemo-resistens manifesteres på det molekylære niveau ved ekspression af lægemiddeltransportere, nemlig ATP bindende kassette (ABC) proteiner associeret med dissemineret lægemiddelresistens [40,41]. Endvidere har en associering mellem De transkriptionsfaktorer regulerer EMT og overekspression af narkotika transportører blevet etableret [42]. Derfor kan nedsat ekspression af narkotika efflux proteiner ABCG2 og ABCC4 af S + T behandling afspejle gevinsten af ​​epitel egenskaber, og at de to processer EMT og kemo-resistens kan være sammenflettet.

Sammenfattende i dette studie vi dokumentere, at endogent udtrykte Wnt antagonist, sFRP4, hjælpemidler i kemo-sensibiliserende gliom stamceller til almindeligt anvendte gliom kemoterapeutisk middel, temozolomid. Vores data giver indsigt i de molekylære mekanismer bag denne virkning af sFRP4, tyder på, at sFRP4 virker gennem at ændre de tæt sammenslyngede og komplekse CSC egenskaber af selvfornyelse, epitelial til mesenkymale overgang, og narkotika effluxing maskiner, som vi har sammenfattet i en skematisk fremstilling (S4 fig). Kombinationsbehandling af sFRP4 med konventionelle kemoterapeutika vil bidrage til at mindske det kemoterapeutiske belastning, som er signifikant fra et klinisk synspunkt. Vore data antyder, at målretning af Wnt-vejen kunne hæmme pro-overlevelse signaler af CSCS i gliom på den ene side, og forsinke invasion og migration på den anden, for derved at forhindre tumormetastase og tilbagefald.

Materialer og metoder

Cell kultur

Menneskelig glioblastom cellelinjer U87 og U373 blev opnået fra National center for Cell Sciences, Pune, Indien, og vedligeholdes i DMEM /F-12 og DMEM-HG (Gibco) (1: 1) indeholdende 1X GlutaMax (Life Technologies), 10% kalvefosterserum (HiMedia), og 100 U /ml PenStrep (Life Technologies). Serumfrit medium (SFM) for sfære kultur blev udført i basalt medium (DMEM /F-12 + DMEM-HG) med 100 U /ml PenStrep, 2 mM GlutaMAX, og indeholdende 20 ng /ml af hver af epidermal vækstfaktor (EGF), basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF; R Chemicon). Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i et fugtigt inkubator med 5% CO

2.

immunfluorescensfarvning

For tidlig karakterisering af CSC markør, CD133, immunfluorescerende (IF) farvning af kugler afledt fra U87 og U373 cellelinier dyrket i CSC-medium blev udført. For yderligere analyse af U87 og U373 CSCS efter lægemiddelbehandling, HVIS farvning blev udført for at undersøge α-SMA, vimentin, og ß-catenin udtryk som beskrevet tidligere [43], med nogle ændringer. Kort fortalt blev cellerne fikseret under anvendelse af 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved 4 ° C, og blokeret med 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev derefter inkuberet i 1 time i mørke omgivelser ved 4 ° C med primære ikke-mærkede muse-anti-humane antistoffer mod CD133, α-SMA, vimentin, og ß-catenin (1: 200 fortyndinger, BD Biosciences), efterfulgt af anti -mouse kanin fluoresceinisothiocyanat (FITC) eller phycoerythrin (PE) -mærket sekundære antistoffer (1: 500 fortyndinger, Invitrogen) i 1 time ved 37 ° C.