PLoS ONE: microRNA-21 regulerer TORC1 Aktivering i Renal Cancer Cell Proliferation og Invasion

Abstrakt

Metastatisk nyrekræft manifesterer flere underskrifter genekspression. Afvigelse i ekspression af modne miRNA er blevet forbundet med humane cancere. Betydningen af ​​miR-21 i nyrecellecarcinomer foreslås fra profilering undersøgelser med anvendelse af prøver tumor væv. Imidlertid er endnu ikke blevet vist, rolle MIR-21 funktion i forårsager renal cancer celleproliferation og invasion. Anvendelse af dyrkede renale carcinomaceller udviser vi forøget ekspression af modent MIR-21 foruden den og PRI-MIR-21 ved forøget transskription sammenlignet med normale proximale tubulære epitelceller. Overekspression af MIR-21 Sponge til standsning endogene MIR-21 niveauer inhiberede proliferation, migration og invasion af nyrecancerceller. I fravær af mutation i PTEN tumorsuppressorgen, er PTEN proteinniveauer ofte nedreguleret i nyrekræft. Vi viser, at MIR-21-mål PTEN mRNA 3′-utranslaterede region at falde PTEN proteinekspression og øger Akt phosphorylering i renale cancerceller. Nedregulering af PTEN samt overekspression af konstitutivt aktive Akt kinase forhindrede MIR-21 Sponge-induceret inhibering af renal cancer celleproliferation og migration. Endvidere viser vi, at MIR-21 Sponge hæmmede inaktiverende phosphorylering af tumorsuppressorproteinet tuberin og svækkede TORC1 aktivering. Endelig viser vi, at ekspression af konstitutivt aktive TORC1 svækket MIR-21 Sponge-medieret suppression af proliferation og migrering af nyrecancerceller. Vores resultater afdække et lag af post-transkriptionel regulering af PTEN ved transkriptionel aktivering af miR-21 for at tvinge den kanoniske onkogene Akt /TORC1 signalering kanal til at køre nyrecancer celledeling og invasion

Henvisning:. Dey N, Das F, Ghosh-Choudhury N, Mandal CC, Parekh DJ, Block K, et al. (2012) microRNA-21 regulerer TORC1 Aktivering i Renal Cancer Cell Proliferation og Invasion. PLoS ONE 7 (6): e37366. doi: 10,1371 /journal.pone.0037366

Redaktør: Soumitro Pal, Børnehospital Boston Harvard Medical School, USA

Modtaget: December 22, 2011; Accepteret: 20. april, 2012; Udgivet: 4. juni 2012

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. En USA National Institutes of Health (NIH) RO1 DK50190 tilskud til GGC støttet dette arbejde. En del af dette arbejde blev også støttet af VA Research Service Merit anmeldelse tilskud til GGC. GGC støttes også af Juvenile Diabetes Research Foundation 1-2008-185 tilskud og er modtager af VA Senior Research Career Scientist Award. NGC er støttet af VA Merit Review, NIH RO1 AR 52425 stipendier og Ronald P. Williams Ortopædisk Oncology Developmental Research Award fra Cancer Therapy og Research Center, San Antonio, Texas. KB, BSK og HEA er støttet af tilskud, NIH RO1 CA 131.272 (KB), NIH RO1 DK 077.295 (BSK), NIH RO1 DK078971 (HEA), NIH RC2a 036.613 (BSK) og VA Research Service Career Scientist Award (KB) og Merit anmeldelse Awards (KB, BSK og HEA)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Renalcellecarcinom repræsenterer den mest almindelige. nyre malignitet; omkring 70.000 nye tilfælde er blevet rapporteret i år 2011 (www.cancer.gov). Blandt de fem undertyper, klarcelle renal carcinoma (RCC) tegner sig for ca. 70% af [1] sager. Omkring 30% af patienter med RCC udvikle invasiv sygdom almindeligvis metastaserer til knogle, lunge, hjerne og lever [2], [3]. Tab af VHL (von Hippel-Lindau) proteinekspression grund kimcellelinje mutation, biallellic somatisk mutation eller hypermethylering af dets gen locus udgør en høj risiko for klare celle renalt carcinom, hæmangiomer og fæokromocytom [4], [5]. Defekt VHL ekspression forårsager stabilisering af Hifα transkriptionsfaktorer, som bidrager til den forøgede ekspression af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) at opretholde vaskulær tumorens natur. Også Hifα regulerer anaerob respiration ofte fundet i RCC [5]. Hifα-uafhængig funktion af VHL er blevet rapporteret i kørsel nyre karcinom, herunder regulering af ældning [5], [6]. Desuden VHL positiv nyre tumorer udnytte alternative mekanismer til at øge Hifα transkriptionsfaktorer for VEGF-ekspression, og Hifα-uafhængig vækstfaktorreceptor opregulering [5], [7].

miRNA er korte ikke-kodende oligonukleotider med ufuldkommen komplementaritet overvejende til 3′-utranslaterede region (UTR) af target mRNA’er [8], [9], [10]. Næsten 1000 miRNA hos mennesker regulere ekspressionen af ​​en tredjedel af det totale protein-kodende transkriptom på posttranskriptionel og translationel niveau [9]. miRNA overvejende handle ved at hæmme mRNA translation selvom mRNA nedbrydning og mRNA spaltning også kan bidrage til nedregulering af protein niveauer. Upassende ekspression af miRNA har været knyttet til onkogenese [10], [11]. miRNA er kodet efter de introniske og intergeniske samt exon sekvenser i genomet [12]. De syntetiseres hovedsageligt af RNA-polymerase II-afhængig transskription til frembringelse PRI-miRNA hårnål, som binder drosha /DGCR8 kompleks. Det dobbeltstrengede RNA-bindende protein DGCR8 genkender de proksimale baser (~ 10 bp) af den pri-miRNA stamceller efterfulgt af spaltning med RNase III-enzymet drosha at frigive pre-miRNA korte hårnål [13]. Exportin-5 og partneren Ran-GTP inducerer nuklear eksport af før-miR til cytoplasmaet, hvor det behandles af dicer RNase III /TRBP til opnåelse -22 nukleotid lille RNA duplex. Guiden streng så er indarbejdet i effektor Argonaute kompliceret at danne RISC (RNA-induceret lyddæmpning kompleks) og til at binde med ufuldkommen komplementaritet til mRNA for translationel undertrykkelse [12].

Seneste rapporter etableret en fast rolle specifik miRNA signatur i renal tumorigenese. Profileringsværktøjer viste, at flere miRNA er nedreguleres i RCC end opreguleret [14], [15], [16], [17]. For eksempel i en indledende screening af 470 miRNA, fandtes kun seks miRNA at være opreguleret i RCC mens 15 blev nedreguleret [16]. I en anden undersøgelse blev kun 2 miRNA steg i RCC herunder MIR-21 henviser ekspressionen af ​​17 miRNA faldt [17]. Tilsvarende viste en nyere rapport forøget ekspression af MIR-21 blandt 9 miRNA mens ekspressionen af ​​26 miRNA blev undertrykt [14]. For nylig, en omfattende undersøgelse under anvendelse af et stort antal prøver cancer fra 31 forskellige faste tumorer beskrevet en signifikant stigning i MIR-21 tyder funktion i onkogenese [18]. Men dets funktionelle rolle i mange cancertyper, herunder renal carcinoma ikke er klarlagt,. I den foreliggende undersøgelse, finder vi forøget ekspression af moden, præ- og PRI-MIR-21 i renale cancerceller sammenlignet med normale proximale tubulære epitelceller. Denne stigning i MIR-21 var forbundet med nedsat PTEN niveauer. Neutralisering af miR-21 forhindret spredning, migration og invasion af disse celler samtidig med øget PTEN og reduceret tuberin phosphorylering og mTORC1 aktivering.

Resultater

Øget ekspression af miR-21 i renalcellecarcinom

miRNA ekspression profilering ved anvendelse tumorprøver fra patienter med renalt carcinom er blevet rapporteret. I tre undersøgelser fandtes ekspressionen af ​​MIR-21 øges [14], [17], [19]. Men i en anden undersøgelse i 16 clear cell renal carcinoma og 4 kromofobt nyrekarcinom prøver, MIR-21 blev ikke påvist [16]. Vi anvendte et panel af tumorvæv fra klar celle nyrecarcinomer at detektere ekspressionen af ​​moden MIR-21. Real time QRT-PCR afslørede markant forøget ekspression af modent miR-21 i al grad 2 (3 ud af 3) og grad 3 (3 ud af 3) renalcellecarcinom prøver (fig. S1A og S1B). Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​MIR-21 i ACHN renal carcinomceller. Vi fandt signifikant forøget ekspression af modent MIR-21 i ACHN celler sammenlignet med hK2 normale proximale tubulære epitelceller (fig. 1a). Lignende resultater blev opnået i en anden renal cancercellelinie Caki-2 (fig. S2). Nylige rapporter har vist, at MIR-21 reguleres på niveauet for modning [20]. Derfor undersøgte vi niveauerne af præ-MIR-21. Real time QRT-PCR viste markante ekspression af præ-MIR-21 i ACHN celler sammenlignet med HK2 celler (fig. 1b). Tilsvarende blev forøget ekspression af PRI-MIR-21 også påvist i ACHN celler (Fig. 1C). Denne stigning i PRI-miR foreslog en transkriptionel mekanisme af MIR-21-ekspression. Til direkte undersøge den transkriptionelle regulering af MIR-21-ekspression anvendte vi en MIR-21-promotor-drevet ildflueluciferase reporterkonstruktion (MIR-21-Luc). Forbigående transfektionsassays i ACHN celler afslørede væsentligt forøget transkription af reportergenet (fig. 1D). Disse resultater indikerer, at forøgede niveauer af kønsmodne MIR-21 i renale carcinomaceller kan skyldes den øgede transkription af MIR-21-genet til frembringelse af PRI-mir-21

(A – C). Totale RNA’er fra HK2 proximal tubulære epitelceller og ACHN renal cancer celler blev anvendt til at detektere modne mIR-21 (panel A), præ-mIR-21 (panel B) og pri-mIR-21 (panel C) ved realtid QRT-PCR som beskrevet i Materialer og metoder. Middelværdi ± SE af 4 målinger er vist. I panel A og B, * p = 0,004 vs HK2 celler. I felt C, * p = 0,02 vs. HK2 celler. (D) HK2 og ACHN-celler blev transficeret med MIR-21-Luc reporter sammen med Renilla null plasmid. Cellelysaterne blev anvendt til at bestemme luciferaseaktivitet som beskrevet i Materialer og Metoder. Middelværdi ± SE af 6 målinger er vist. * P = 0,001 vs HK2 celler. (E) Øget phosphorylering af p65 NFkB i renale cancerceller. Lysater hK2 og ACHN celler blev immunblottet med phospho-p65 (Ser-536), p65 og aktin antistoffer. (F) Mutant p65 S536A inhiberer MIR-21 transkription. ACHN renale cancerceller blev cotransficeret med MIR-21-Luc og p65 S536A ekspressionsvektor. Luciferaseaktiviteten blev bestemt i cellelysaterne. Middelværdi ± SE for firdobbelte målinger er vist. * P = 0,02 vs. vektor. Bundpaneler viser ekspression af HA-mærket p65 S536A og actin.

Transkription af MIR-21-genet har for nylig vist at blive reguleret af NFKB [21]. NFKB er opreguleret i nyrekræft [22], [23]. Den transkriptionelle aktivitet af p65-underenheden af ​​NFKB er afhængig af dets phosphorylering ved Ser-536 [24]. Derfor undersøgte vi phosphorylering af p65. Som vist i fig. 1E, phosphorylering af p65 ved Ser-536 blev øget væsentligt i de ACHN nyrecancerceller forhold til hK2 celler. Endvidere blev forbedret p65 niveauer også observeret (fig. 1E, midterste panel). Dernæst testede vi inddragelse af NFKB i transkription af MIR-21 i renale cancerceller. MIR-21-Luc reporter blev cotransficeret med enten S536A mutant af p65 eller med en vektor plasmid. Ekspression af p65 S536A inhiberede signifikant reporter aktiviteten i ACHN celler. Disse data indikerer, at opregulering af miR-21 til dels kan skyldes øget NFicB aktivitet i renale cancerceller.

miR-21 Regulerer spredning og invasion af nyrekræft Cells

MIR-21 anses at være en kræftpsykologisk miR i mange cancertyper. Men dens rolle i renalcellecarcinom ikke er blevet udforsket,. Derfor testede vi inddragelse af MIR-21 i mitogenese af ACHN celler under anvendelse af en plasmidvektor, der udtrykker syv kopier af den udbulende MIR-21 bindingssted placeret i 3′-enden af ​​CMV-promotor-drevet GFP-mRNA (fig. S3) [ ,,,0],25]. Ekspression af dette konstrukt tjener som en “svamp”, der kvæler niveauerne af endogent MIR-21 [25], [26]. ACHN-celler blev transficeret med denne konstrukt (MIR-21 Sponge). DNA-syntese blev målt som

3H-thymidin. Ekspression af MIR-21 Sponge signifikant inhiberede DNA-syntese i ACHN celler (Fig. 2A og fig. S4A). For at bekræfte denne observation, udførte vi proliferation assay ved at tælle antallet af celler efter transfektion MIR-21 Sponge. Ekspression af MIR-21 Sponge undertrykt cellevækst (fig. 2B og fig. S4b).

ACHN celler blev transficeret med MIR-21 svamp eller vektorplasmider. (A) Serum-udsultede celler blev inkuberet med

3H-thymidin og dets inkorporering i DNA blev bestemt som beskrevet i Materialer og metoder [115]. Middelværdi ± SE for 12 målinger er vist. * P = 0,004 vs vektor alene. (B) Cellerne blev talt ved angivne tidsperioder som beskrevet i Materialer og Metoder. Diamond og firkantede symboler repræsenterer vektor og MIR-21 Sponge-transficerede celler. Middelværdier ± SE af tredobbelte målinger er vist. * P 0,05 vs vektor alene. (C) Serum-udsultede celler blev podet på membranen i en trans-brønd kammer. Migration assay blev udført, og de migrerede celler på den modsatte side af membranen blev farvet som beskrevet i Materialer og metoder [111]. (D) De pletter i de migrerede celler i panel C blev elueret som beskrevet i Materialer og metoder [111]. Middelværdi ± SE af tredobbelte målinger er vist. * P 0,0001 vs vektor-transficerede celler. (E) Transficerede serum-udsultede celler blev podet på collagen-indlejret membran i en trans-brønd kammer. Invasion assay blev udført, og den invaderede celler på den modsatte side af membranen blev farvet som beskrevet i Materialer og metoder [111]. (F) De pletter i de invaderede celler i panel E blev elueret som beskrevet i Materialer og metoder [111]. Middelværdi ± SE af tredobbelte målinger er vist. * P. 0,001 vs vektor-transficerede celler

Renalcellecarcinom er ofte meget metastatisk. Vi testede, om MIR-21 styrer ACHN cellemigrering anvendelse af trans-brønd kammer assay. Celler dyrket i et serum-frit medium på toppen af ​​membranen migreret til bunden af ​​membranen (fig. 2C, panel a). Ekspression af MIR-21 Sponge forhindrede migrering af ACHN-celler (fig. 2C og fig. S4C). Kvantificering af disse resultater viser signifikant inhibering af migrering af nyrecancerceller som respons på MIR-21 Sponge (fig. 2D).

Det første trin i metastase består af lokal invasion af cancerceller (intravasation). For at undersøge metastatiske potentiale ACHN renal cancerceller, anvendte vi en invasion assay under anvendelse af collagen-indlejret membraner i trans-brønde. Vektor-transficerede ACHN celler viste markant invasion (fig. 2E, panel a). Ekspression af MIR-21 Sponge blokeret invasionen af ​​tumorceller (fig. 2E og fig. S4D). Kvantificering viste signifikant hæmning af invasion af ACHN celler ved miR-21 Sponge (fig. 2F).

MIR-21 Mål PTEN i nyrekræft Celler

Mutation i PTEN tumorsuppressorgen eller dens reducerede ekspression bidrager til tumorgenese og metastase af mange cancere [27], [28]. Dog er PTEN mutation ikke ofte findes i renalcellecarcinom [29]. PTEN er blevet valideret til at være et mål af miR-21 [30]. Vi undersøgte niveauerne af PTEN i ACHN renal cancerceller. Som vist i fig. 3A, den overflod af PTEN i ACHN blev signifikant reduceret sammenlignet med den i HK2 celler. Identiske resultater blev opnået i Caki-2 renalt carcinom cellelinje (fig. S5A). PTEN reducerer niveauerne af PIP

3, som styrer phosphoryleringen /aktivering af Akt [27], [31], [32]. Reducerede PTEN niveauer i ACHN og Caki-2-celler var forbundet med øget fosforylering af Akt ved Thr-308 og Ser-473 (fig. 3B og fig. S5B), hvilket indikerer aktivering [32].

(A ) lysaterne af celler fra tre uafhængige brønde hK2 og ACHN celler blev immunblottet med PTEN og aktin antistoffer. (B) De samme cellelysater blev immunoblottedes med phospho-Akt (Thr-308), phospho-Akt (Ser-473) og Akt antistoffer.

Dernæst vi undersøgt, om MIR-21 mål PTEN . Vi anvendte en reporterkonstruktion, hvor 3’UTR af PTEN-mRNA klones nedstrøms for ildflue-luciferase-genet (PTEN 3’UTR-Luc) [25]. ACHN celler blev transficeret med denne reporter og vektor eller MIR-21-ekspressionsplasmid. Ekspression af MIR-21 inhiberede signifikant reporter aktivitet (fig. 4A og fig. S6A). For at bekræfte denne observation, vi brugte miR-21 Sponge. Ekspression af MIR-21 Sponge markant øgede luciferaseaktiviteten af ​​PTEN 3’UTR-Luc (fig. 4B og fig. S6B). Disse resultater antyder, at i renale cancerceller, kan PTEN være en nedstrøms mål for MIR-21. For at teste dette, vi undersøgte PTEN protein niveau i miR-21 Sponge-transfekterede ACHN celler. MIR-21 Sponge forøgede overflod af PTEN (fig. 4C og fig. S6c), samtidig med nedsat phosphorylering af Akt ved Thr-308 og Ser-473 (Fig. 4D).

(A og B) ACHN celler blev transficeret med pCMV-mIR-21-ekspressionsplasmid (A) eller mIR-21 Sponge (B) og vektor sammen med PTEN 3’UTR-Luc reporter konstrukt. Cellelysaterne blev anvendt til at bestemme luciferaseaktivitet som beskrevet i Materialer og Metoder. Middelværdi ± SE af 6 målinger er vist. I felt A, * p = 0,02 vs. vektor alene. I panel B, * p = 0,002 vs vektor alene. (C og D) Lysater af MIR-21 Sponge-transficerede ACHN celler blev immunblottet med PTEN og aktin antistoffer (panel C), og phospho-Akt (Ser-473), phospho-Akt (Thr-308) og Akt antistoffer (panel D).

miR-21 Regulerer renal Cancer Cell Proliferation og migration via PTEN /Akt Axis

Vores resultater ovenfor antyder, at miR-21 fremmer Akt aktivering ved at formindske PTEN niveauer i nyre- cancerceller (fig. 4). For at direkte at undersøge den rolle, som denne signalvej i renal cancer celleproliferation, transficerede vi ACHN og Caki-2-celler med MIR-21 Sponge og siRNA’er rettet mod PTEN (siPTEN). Som forventet, MIR-21 Sponge inhiberede DNA-syntese (fig. 5A og fig. S7A). I modsætning hertil transfektion af siPTEN signifikant forhindrede MIR-21 Sponge-induceret hæmning af DNA-syntese (fig. 5A og fig. S7A, S7B og S7C). Tilsvarende siPTEN vendt faldet i proliferation af ACHN celler induceret af MIR-21 Sponge (fig. 5B og fig. S8). Dernæst bestemte vi effekten af ​​siPTEN på ACHN og Caki-2 celle migration. Ekspression af miR-21 Sponge faldt migration af både disse nyrekræft cellelinjer. siPTEN undertrykte signifikant den inhiberende virkning af MIR-21 Sponge på cellemigrering (fig. 5C, 5D og fig. S9 og S10).

ACHN celler blev transficeret med MIR-21 Sponge sammen med siRNA pools målretning PTEN-mRNA som angivet. (A)

3H-thymidin-inkorporering blev bestemt som beskrevet i Materialer og metoder [115]. Middelværdi ± SE af 6 målinger er vist. * P 0,05 vs vektor; ** P 0,05 vs MIR-21 svampelignende transficerede celler. (B) Transficerede celler blev talt ved angivne tidsperioder. Den symboler diamant, firkantet og kors repræsenterer vektor, miR-21 Svamp og miR-21 Sponge plus siRNA pool mod PTEN hhv. Middelværdi ± SE af tredobbelte målinger er vist. * P 0,05 vs vektor alene; ** P 0,01 vs MIR-21 Sponge alene. (C) Transficerede celler blev podet på membranen i trans-brønd kamre og de migrerede celler blev farvet som beskrevet i Materialer og metoder [111]. (D) Pletter fra membranerne i felt C blev elueret, og absorbans ved 590 nm blev målt. Middelværdi ± SE for 3 uafhængige kamre er vist. * P 0,001 vs vektor alene; ** P. 0,001 vs miR-21 Sponge

lipid fosfatase aktivitet PTEN er kendt for at regulere Akt fosforylering [27]. Vi har vist ovenfor, at reduceret PTEN niveau i renale cancerceller er forbundet med forøget phosphorylering af Akt (fig. 3 og fig. S5). Da MIR-21 regulerer PTEN proteinniveau, som igen aktiverer Akt, testede vi rollen af ​​denne kinase i renal cancer celleproliferation i forhold til MIR-21. Vi transficerede ACHN og Caki-2-celler med konstitutivt aktiv Gag-Akt sammen med MIR-21 Sponge [33]. Ekspression af Gag Akt vendte markant inhibering af DNA-syntese induceret af MIR-21 Sponge (fig. 6A, fig. S11A og fig. S12). Ekspression af Gag Akt vendes også celleproliferation med MIR-21 Sponge (6B og fig. S13A). Tilsvarende konstitutivt aktiv Akt forhindrede signifikant inhibering af migrering af ACHN celler som reaktion på MIR-21 Sponge (fig. 6C, 6D og fig. S13B). Identiske resultater blev opnået med Caki-2 nyrecancerceller (fig. S14A, S14B og S14C). Disse resultater indikerer, at MIR-21-mål PTEN mRNA til undertrykke dets proteinekspression, hvilket fører til Akt-afhængig proliferation og migration af nyrecancerceller.

ACHN celler blev transficeret med MIR-21 Sponge sammen med konstitutivt aktiv Gag Akt plasmider som angivet. (A)

3H-thymidin-inkorporering blev bestemt som beskrevet i Materialer og metoder [115]. Middelværdi ± SE af 6 målinger er vist. * P 0,01 vs vektor; ** P 0,001 vs MIR-21 Sponge alene. (B) Transficerede celler blev talt ved angivne tidsperioder. Den symboler diamant, firkantet og kors repræsenterer vektor, miR-21 Svamp og miR-21 Svamp plus Gag Akt ekspressionsplasmider hhv. * P 0,01 vs vektor alene; ** P 0,001 vs MIR-21 Sponge alene. (C) Transficerede celler blev podet på membranen i trans-brønd kamre og de migrerede celler blev farvet som beskrevet i Materialer og metoder [111]. (D) Pletter fra membranerne i felt C blev elueret og absorbansen blev målt. Middelværdi ± SE for 3 uafhængige kamre er vist. * P 0,001 vs vektor alene; ** P. 0,001 vs miR-21 Sponge

miR-21 modulerer TORC1 aktivitet at fremkalde Renal Cancer Cell Proliferation og migration

Aktiveret Akt phosphorylerer tumor suppressor protein tuberin på Thr -1462 fører frem til dets inaktivering, og Rheb-medieret aktivering af TORC1 [34], [35], [36]. Vi har konstateret, at nedregulering af PTEN grund af øget MIR-21 ekspression i nyrecancerceller aktiverer Akt (fig. 3), som bidrager til proliferation og migration af disse celler (fig. 5 og 6). Vi testede rolle MIR-21 i tuberin phosphorylering. ACHN celler blev transficeret med MIR-21 Sponge. På grund af øget Akt aktivering, ACHN celler udviser forøget phosphorylering af tuberin (fig. 7A, bane 1). Ekspression af MIR-21 Sponge inhiberede phosphorylering af tuberin (fig. 7A og fig. S15A). Svarende til øget tuberin phosphorylering, viste ACHN celler augmented phosphorylering af S6 kinase ved Thr-389 (fig. 7B, bane 1), målt som et surrogat for TORC1 aktivitet. MIR-21 Sponge blokeret S6 kinase-phosphorylering (fig. 7B). Denne reduktion i S6 kinase-phosphorylering af MIR-21 Sponge var forbundet med inhibering af mTOR phosphorylering ved Ser-2448 (fig. 7C). Disse resultater antyder, MIR-21 regulerer TORC1 aktivitet i de renale cancerceller. For at undersøge om MIR-21 Sponge-afhængig mTOR hæmning skyldes inaktivering af Rheb, vi cotransficeret ACHN celler med MIR-21 svamp og et konstitutivt aktiv Rheb ekspressionsplasmid og resultaterne blev sammenlignet med den i MIR-21 svampelignende transficerede celler. mTOR aktivering blev undersøgt i cellelysaterne. Ekspression af konstitutivt aktive Rheb vendt den inhiberende virkning af MIR-21 Sponge på S6 kinase-phosphorylering (fig. 7D og fig. S15B). Tilsvarende blev reduceret phosphorylering af mTOR af MIR-21 Sponge også forhindres ved konstitutivt aktiv Rheb (fig. 7E og fig. S15C). Disse resultater endegyldigt viser, at MIR-21-medieret phosphorylering /inaktivering af tuberin aktiverer Rheb at øge mTOR aktivitet.

ACHN celler blev transficeret med MIR-21 svamp eller vektor. Cellelysaterne blev immunoblottet med phospho-tuberin (Thr-1462), tuberin (panel A), phospho-S6 kinase (Thr-389), S6 kinase (panel B), phospho-mTOR (Ser-2448) og mTOR (panel C). MIR-21 anvender Rheb aktivering for TORC1 aktivitet. ACHN celler blev cotransficeret med MIR-21 Svamp og CA Rheb plasmid. De Cellelysaterne blev immunoblottedes med phospho-S6 kinase (Thr-389), S6 kinase (panel D), phospho-mTOR (Ser-2448) og mTOR (panel E).

For at belyse, om mIR-21-aktiveret TORC1 bidrager til proliferation af nyrecancerceller, vi cotransficeret ACHN og Caki-2-celler med mIR-21 svamp og et konstitutivt aktiv mTOR ekspressionsvektor.

3H-thymidin-inkorporering blev bestemt. Ekspression af konstitutivt aktive mTOR signifikant forhindrede inhibering af DNA-syntese ved MIR-21 Sponge (fig. 8A, fig. S16 og fig. S17). Tilsvarende konstitutivt aktiv mTOR inhiberede MIR-21 Sponge-medieret fald i ACHN celleproliferation (fig. 8B og fig. S18A). Næste vi undersøgte effekten af ​​konstitutivt aktive mTOR på nyrekræft celle migration. MIR-21 Sponge afskaffet migration af ACHN og Caki-2-celler (fig. 8C, Fig. S18B og fig. S19). Imidlertid coekspression af konstitutivt aktive mTOR med MIR-21 Sponge vendte markant inhibering i migration af begge renale cancercellelinjer som reaktion på MIR-21 Sponge (fig. 8C, 8D og fig. S19). Taget sammen viser disse resultater, at MIR-21 bidrager til renal cancer celleproliferation og migrering via TORC1.

ACHN celler blev transficeret med MIR-21 Sponge sammen med konstitutivt aktive mTOR plasmider som angivet. (A)

3H-thymidin-inkorporering blev bestemt som beskrevet i Materialer og metoder [115]. Middelværdi ± SE af 6 målinger er vist. * P 0,001 vs vektor; ** P 0,001 vs MIR-21 Sponge alene. (B) Transficerede celler blev talt ved angivne tidsperioder. Den symboler diamant, firkantet og kors repræsenterer vektor, miR-21 Svamp og miR-21 Sponge plus konstitutivt aktive (CA) mTOR ekspressionsplasmider hhv. * P 0,01 vs vektor alene; ** P 0,001 vs MIR-21 Sponge alene. (C) Transficerede celler blev podet på membranen i trans-brønd kamre og de migrerede celler blev farvet som beskrevet i Materialer og metoder [111]. (D) Pletter fra membranerne i felt C blev elueret, og absorbans ved 590 nm blev målt. Middelværdi ± SE for 3 uafhængige kamre er vist. * P 0,001 vs vektor alene; ** P 0,001 vs miR-21 Sponge

Diskussion

I renale cancerceller, leverer vi bevis for ekspression af pri-miR-21 til at producere præ- og modne. miR-21, som bidrager til proliferation og migration /invasion. Vi viser en omvendt korrelation mellem MIR-21 niveauer og PTEN overflod. Vi viser, at MIR-21-sensitive PTEN regulerer proliferation og migrering af nyrecancerceller via aktivering af Akt. Endelig har vi etablere en rolle for miR-21-stimuleret TORC1 i nyrekræft celleproliferation og migration (fig. 9).

Forbedret miR-21 dæmper PTEN protein niveauer, hvilket resulterer i aktivering af Akt, der inaktiverer tuberin at øge TORC1 aktivitet fører til proliferation, migration og invasion af nyrecancerceller.

ændret genekspression kontrol signaling netværk til at regulere de biologiske output, som bidrager til celletransformation og metastase. Selv transkriptionel regulering af gener til at producere mRNA medierer et væsentligt bidrag til onkogenese, er nylige opdagelse af miRNA spiller en rolle ligner DNA bindende transkriptionsfaktorer etableret i reguleringen af ​​ekspressionen af ​​målgener med post-transkriptionel mekanisme. Mange miRNA er blevet identificeret og karakteriseret som tumor initiativtagere samt tumorsuppressorer. For eksempel ubikvitært miRNA, MIR-21, ofte opreguleres i mange cancere, herunder bryst-, lunge-, neuroblastom, glioblastom, leukæmi, gastrisk cancer, cholangiocarcinom, coloncancer og hepatocellulær cancer [37], [38], [39] , [40], [41], [42]. Men oplysninger om den funktionelle rolle miR-21 er kun tilgængelig fra

in vitro

studier. Først for nylig

in vivo

rolle MIR-21 i udviklingen af ​​kræft er påvist i præ-B-celle lymfom og ikke-småcellet lungekræft. I begge disse kræftformer, er ekspression af MIR-21 signifikant forøget [43], [44], [45]. Brug af musemodeller for overekspression samt deletion af MIR-21, Medina et al og Hatley et al viste for nylig en yderst specifik rolle denne miRNA i udviklingen af ​​præ-B-celle lymfom og ikke-småcellet lungekræft, henholdsvis [ ,,,0],46], [47].

mIR-21 regulerer spredning og mitokondrie apoptotiske veje kontrolleres af tumor suppressor proteiner, celle cyklus regulatorer og vækstfaktorer [48], [49]. MIR-21 udtrykkes rigeligt i nyre proksimale tubuli [50]. I dyremodeller, forøget ekspression af MIR-21 er forbundet med fibrotiske sygdomme i nyre og renal iskæmisk beskadigelse [51], [52], [53], [54]. Vi har for nylig rapporteret forøget ekspression af MIR-21 i en model for type 1 diabetisk nefropati [25]. Vi viste, at MIR-21 regulerer hypertrofi af proximale tubulære epitelceller, indikerer patologisk rolle af denne miRNA i nyresygdomme [25]. Tilsvarende miRNA profilering undersøgelser identificeret forøget ekspression af miR-21 i både klar celle og papillære nyrecellecancere [14], [19], [55]. I modsætning hertil i en nylig microarray analyse af 30 grader 1 og 2 clear cell renal carcinoma væv blev MIR-21 rapporteret at være nedreguleret med mere end 2-fold [56]. Interessant nok blev en svag gensidig korrelation påvist mellem overlevelse af patienter med klar celle renalt carcinom og MIR-21-ekspression [55]. I denne rapport nedregulering af MIR-21 blev fundet i VHL deficiente RCC4 renal cancercellelinie [55]. Rekonstituering af VHL resulterede i forøget ekspression af miR-21 i en Hifα-uafhængig måde. Det skal bemærkes, at 42% af de klare celletumorer viser VHL mutation og 10% af tumorerne bære methylering i VHL-promotoren [57], [58], [59]. I den foreliggende undersøgelse viser vi en betydelig stigning i MIR-21 ekspression i VHL-positive ACHN og Caki-2 nyrecancerceller sammenlignet med normale proximale tubulære epitelceller (fig. 1 og fig. S2) [60]. Desuden viser vores resultater væsentligt forbedret miR-21-ekspression i 100% af grad 2 og klasse 3 renale tumorvæv sammenlignet med matchede kontrol væv (fig. S1). Derudover bruger en VHL negativ renal cancer cellelinie, 786-O, fandt vi signifikant forøget ekspression af MIR-21 sammenlignet med HK2 proximale tubulære epitelceller (fig. S20). Disse resultater viser, at uanset VHL status, nyrekræft celler udtrykker høje niveauer af MIR-21. Salg

Metastatiske renale carcinomaceller udviser forøget TGFp-afhængig Smad 2/3 signalering [61]. For nylig er der rapporteret en rolle TGFp øge niveauerne af modent MIR-21 [62]. Disse forfattere beskrev en transskription-uafhængig funktion af TGFp-specifikke Smad proteiner, som er rekrutteret i RNase III drosha gennem interaktion med RNA helicase p68. Denne mikroprocessor kompleks rekrutterer pri-miR-21 for at lette produktionen af ​​præ-miR-21, hvilket øger niveauerne af modent miR-21 [62]. Denne undersøgelse fandt ikke nogen stigning i pri-miR-21 som reaktion på TGF. For nylig, den samme gruppe rapporterede tilstedeværelsen af ​​TGF-specifik Smad bindende element i stammen regionen i pri-miR-21, som rekrutterer Smad direkte til drosha mikroprocessor /PRI-miR-21 kompleks for øget behandling for at producere pre-miR 5A. 6B.