PLoS ONE: rock1 og LIMK2 Interact i spread, men ikke blebbing Cancer Cells

Abstrakt

Kræftceller migrerer i en 3D-mikromiljø er i stand til at vedtage enten en mesenkymale eller amoeboid form for migration. Amoeboid migration er kendetegnet ved membranblæredannelse der er afhængig af Rho effektorer, rock1 /2. Vi identificerer LIMK2 som den foretrukne substrat for rock1 men opdager, at LIMK2 inducerede ikke membranblæredannelse, hvilket tyder på, at en LIMK2 vej ikke er involveret i migration amoeboid-mode. Til støtte for denne hypotese, roman FRET data viser en direkte interaktion mellem rock1 og LIMK2 i polariseret, men ikke blebbing celler. Vores resultater peger på en specifik rolle for rock1:. LIMK2 vej hos migration mesenchymal-mode

Henvisning: Shea KF, Wells CM, Garner AP, Jones GE (2008) rock1 og LIMK2 Interact i spread, men ikke blebbing cancerceller. PLoS ONE 3 (10): e3398. doi: 10,1371 /journal.pone.0003398

Redaktør: Carl-Philipp Heisenberg, Max Planck Institut for Molekylær Cellebiologi og genetik, Tyskland

Modtaget: Juli 8, 2008; Accepteret: September 16, 2008; Udgivet: 14 okt 2008

Copyright: © 2008 Shea et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Medical Research Council (MRC), og tildelingen af ​​en CASE studentship fra BBSRC /AstraZeneca plc

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Brystkræft metastase afhænger cellemigration, en kompleks proces reguleres rumligt og tidsmæssigt af Rho familien GTPaser Rho, Rac og Cdc42 [1]. Disse GTPaser udløse en reaktion på ekstracellulære signaler på actincytoskelettet gennem en række effektorproteiner. I en 3D-mikromiljø kan kræftceller vedtage både mesenkymale og amoeboid ligesom vandrende fænotyper [2]. Amoeboid migration er kendetegnet ved membranblæredannelse [3] – [5] en specialiseret form for celle fremspring, der er reversibel og kan forekomme under cellemigrering eller under initiering af cytokinesen [6]. Membranblæredannelse har vist sig at blive induceret af Rho effektor protein ROCK [7] og amoeboid-lignende bevægelse er helt afhængig af samspillet mellem Rho og ROCK [2], [5].

ROCK-1 og ROCK -2 er serin /threoninkinaser, som har en række cellulære substrater, herunder Myosin Light Chain og LIM kinase (LIMK) [8]. ROCK-afhængig migration af cancerceller vides at være drevet af actomyosin sammentrækninger [9], [10]. Det er dog uvist, om ROCK afhængig kræftcelle amoeboid bevægelse kræver en ROCK:. LIMK interaktion

Aktiveret LIMK proteiner phosphorylerer og inaktivere F-actin overskæring protein, cofilin og dette giver en alternativ mekanisme til Rho-ROCK signalering at mægle dens virkninger på F-actincytoskelettet [11]. ROCK-LIMK signalering menes at fremme tilbagetrækning af neuritter gennem regulering af cofilin aktivitet [12]. Derudover har en rolle for ROCK og LIMK proteiner i human epidermis blevet identificeret [13]. Inhiberingen af ​​cofilin aktivitet ved ROCK-LIMK synes at være nødvendig for celle komprimering, hvor et fald i LIMK aktivitet fører til en stigning i cofilin aktivitet og et fald i celle kompaktering [13].

En stigning i ROCK niveauer er blevet påvist i adskillige humane cancere [14] – [16] og niveauer af LIMK-1 stigning i invasive og metastatiske bryst og prostata cellelinier [17], [18]. Derfor har vi forsøgt at bedre at forstå bidrag en ROCK:. LIMK interaktion til kræftcelle migration af imaging den rumlige samspil mellem ROCK og LIMK i brystkræftceller udstiller både mesenkymale og amoeboid (blæredannelse) morfologier

Materialer og metoder

Antistoffer og reagenser

anti-rock1 blev købt fra Transduction Laboratories, anti-LIMK2, anti-phospho-LIMK1 /2 (Thr508 /Thr505) fra Cell Signalling Technology. HRP-konjugerede sekundære antistoffer fra DAKO og Alexa-phalloidin fra Molecular Probes. Expression plasmider kodende GFP, CFP, YFP og mRFP1 mærkede LIMK1, LIMK2 og rock1 blev genereret ved hjælp af Gateway ™ Technology (Invitrogen), og alle plasmider blev sekventeret. Den ROCK inhibitor Y27632 blev købt fra Calbiochem.

Cell Culture

MDA-MB231-celler blev dyrket i DMEM (Sigma) suppleret med 10% FBS (Helena Biosciences), L-glutamin og 100 E /ml penicillin-streptomycin. Celler blev transient transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektion reagens ifølge producentens protokol (Invitrogen)

Phosphorylering assay

celler blev lyseret i NP40-lysepuffer (1% v /v NP40;. 50 mM HEPES pH 7,5; 0,5% vægt /volumen natriumdeoxycholat; 150 mM NaCI; 1 mM EDTA). Prøver blev opløst ved SDS-PAGE og immunblottet. Autoradiogrammer blev scannet og kvantificeret ved hjælp af Adobe-software. Mean og S.E.M. værdier blev beregnet ud fra data fra 3 uafhængige forsøg

Immunofluorescens og analyse

Celler podet på dækglas blev fikseret med 4% paraformaldehyd:. PBS og permeabiliseres med 0,2% Triton X-100: PBS som tidligere beskrevet [19]. Celler blev derefter inkuberet med TRITC-konjugeret phalloidin i 1 time ved stuetemperatur. Billeder af celler blev opnået under anvendelse af et Zeiss LSM510 konfokal laser-scanning-mikroskop (Welwyn Garden City, UK) og blev behandlet i Adobe Photoshop 7.0 ™. Student parret t-test blev anvendt til at sammenligne forskellene mellem grupper. Statistisk signifikans blev accepteret for p ≤ 0,05

FRET: FLIM Mikroskopi

Cellerne blev mikroinjiceret med de passende plasmider 24 timer før fastsættelse. Cellerne blev derefter fikseret som ovenfor og inkuberet med frisk natriumborhydrid (1 mg /ml i PBS) til standsning baggrundsfluorescens som tidligere beskrevet. FLIM blev udført på en multifoton mikroskop som tidligere beskrevet [19]. FLIM analyse for at beregne GFP levetid og FRET effektivitet blev udført under anvendelse TRI2 software [19]. Antallet af pixels for hver FRET for virkningsgraden blev opnået fra TRI2 og normaliseret ved at dividere den med summen af ​​pixels for billedet. Denne normaliserede pixel blev i gennemsnit over seks celler pr tilstand og derefter plottet mod FRET effektivitet til at generere FRET effektivitet histogrammer.

Resultater

rock1 phosphorylerer LIMK1 og LIMK2 i brystkræftceller

En række laboratorier har antydet, at ROCK kan phosphorylere og aktivere LIMK1 og LIMK2 [20] – [26], og dermed vi søgte at fastslå, om det er den samme for MDA-MB231-celler. Præ-inkubation med ROCK inhibitor Y27632 reducerede niveauet af LIMK2 phosphorylering i celler med endogen og overudtrykt CFP-rock1. I modsætning hertil Y27632 reducerer forholdet mellem phospho til total LIMK1 i celler med overudtrykt CFP-rock1 men ikke i dem med endogene niveauer af ROCK protein (fig. 1). Behandling af celler med Y27632 inducerede et lille fald i LIMK1 og LIMK2 overekspression niveauer (fig. 1A og B). Men mens LIMK2 fosforylering er altid følsomme over for ROCK aktivitet LIMK1 fosforylering er kun følsom over for ROCK aktivitet, når FFP-rock1 er overudtrykt. Således er vores resultater viser, at overekspression af rock1 ændrer niveauet af phosphorylering af både LIMK1 og 2, men antyder, at LIMK2 er det foretrukne substrat af rock1 i disse celler.

A) og B) CFP-LIMK1 eller 2, og enten CFP-rock1 eller CFP alene blev forbigående transficeret ind MDA-MB231-celler og behandlet med 10 pM Y27632 i 24 timer. De resulterende lysater blev immunblottet under anvendelse af anti-phospho-LIMK, -LIMK1, -LIMK2 og -ROCK1 antistoffer. (NSB = ikke-specifik binding af anti-rock1 antistof til et protein /s ved 220 kDa). C) Forholdet mellem phospho /total LIMK1 CFP-LIMK1 og D) Ratio af phospho /total LIMK2. (* = P 0,05).

rock1 men ikke LIMK2 inducerer blæredannelse i brystkræftceller

Vi fandt, at mens overekspression af GFP alene forårsager en lille, men statistisk signifikant stigning i antal blebbing celler overekspression af GFP-rock1 inducerer en yderst signifikant stigning i procentdelen af ​​blæredannelse celler (fig. 2A og B). Selvom det ikke er vist tidligere i MDA-MB231-celler dette er rapporteret i andre celletyper [9], [27] – [30]. I modsætning overekspression af GFP-LIMK2 inducerede ikke et højt membranblæredannelse, vi også så ingen indikation af celle blæredannelse efter overekspression af LIMK1 (data ikke vist). I alle tilfælde blæredannelse celler havde en intakt kerne, der ikke gjorde fragment (fig. 2A), hvilket indikerer, at dette ikke er membranblæredannelse forbundet med apoptose [31].

A) MDA-MB231-celler blev transficeret med GFP-rock1 eller GFP-LIMK2, fikseret og farvet med Alexa Fluor 594-Phalloidin og Dapi. 150 celler over 3 uafhængige forsøg blev scoret for synlig blæredannelse +/- middelfejl. P 0,05; *** P 0,001. B) Repræsentative billeder fra varierende optiske skiver af en blebbing celle overudtrykker GFP-rock1. (Bar = 20 um).

rock1 og LIMK2 ikke interagerer i blebbing brystkræftceller

Vores resultater viser, at der er et samspil mellem rock1 og LIMK2 men foreslår, at denne interaktion er ikke involveret i membranblæredannelse. Vi søgte at bekræfte denne hypotese ved direkte billeddannelse af interaktionen mellem rock1 og LIMK2 i blebbing og ikke-blebbing celler under anvendelse FRET: FLIM mikroskopi. Denne metode tillader ikke blot en interaktion mellem rock1 og LIMK2 der skal detekteres, men også lokaliseringen af ​​en sådan interaktion, der skal fastlægges rumligt over hele cellen. For at sammenligne interaktionen af ​​rock1 og LIMK2 i spredte og blæredannelse celler brugte vi mikroinjektion til moderat niveau rock1 udtryk. Ved anvendelse af denne metode størstedelen af ​​celler, (63%), udviste et opslag /polariseret morfologi, med mindre antal blebbing celler (23%). I blebbing celler opdaget vi ingen FRET mellem GFP-ROCK-1 og mRFP-LIMK-2 (fig. 3).

MDA-MB231-celler blev mikroinjiceret med GFP-rock1 og mRFP-LIMK2, fast, afbildet og analyseret ved anvendelse FLIM mikroskopi og TRI2 analyseprogram. A) Billeder af GFP levetid og GFP og mRFP intensiteter på tværs af en typisk blæredannelse celle blev vist til en celle, der udtrykker både GFP-rock1 donor og mRFP-LIMK2 acceptor og til sammenligning, kun GFP -ROCK1 donor. B) Histogram af antallet af normaliserede pixelantal detekteret ved hver GFP levetid. n = 9.

rock1 og LIMK2 interagere i polariserede brystkræftceller

Efter at have konstateret, at rock1 og LIMK2 ikke interagerer i blebbing celler vi analyseret lokaliseringen og interaktion af rock1 og LIMK2 i spread-celler. I spread celler størstedelen af ​​LIMK2 og ROCK ekspression er lokaliseret i cytoplasmaet, men kan påvises ekspression af begge proteiner i kernen (fig. 4). I MDA-MB231 celler med en spredning /polariseret fænotype opdaget vi en nedsat GFP levetid når rock1 og LIMK2 var co-udtrykte, der viser, at rock1 og LIMK2 spiller sammen i spredte celler (Fig. 4). GFP levetid Faldet ses over cellen cytoplasma i en punktformet fordeling. Til sammenligning gør to polariserede celler mikroinjiceret med kun GFP-rock1 ikke vise nogen nedgang i GFP levetid (fig. 4). Der er ingen signifikant fald i GFP levetid under kontrol niveauer, når celler, der udtrykker rock1 og LIMK2 er præ-inkuberes med ROCK inhibitor Y27632 (Fig 4). Interessant i mange celler der er en mangel på påviselig interaktion mellem rock1 og LIMK2 på cellens periferi (fremhævet med pilespidser i fig. 4).

MDA-MB231-celler blev mikroinjiceret med GFP-rock1 og mRFP- LIMK2, fast, afbildet og analyseres ved hjælp af FLIM mikroskopi og TRI2 analyseprogram. A) Billeder af GFP levetid og GFP og mRFP intensiteter på tværs af en typisk langstrakt celle blev vist til en celle, der udtrykker både GFP-rock1 donor og mRFP-LIMK2 acceptor og til sammenligning, kun GFP -ROCK1 donor. B) Histogram af antallet af normaliserede pixelantal detekteret ved hver GFP levetid. C) Et histogram af det gennemsnitlige antal normaliserede pixelantal detekteret ved hver GFP levetid i celler, der udtrykker både GFP-rock1 donor og mRFP-LIMK2 acceptor i celler fra aflange eller blæredannelse morfologier blev konstrueret sammen med celler som kun udtrykker GFP-rock1 donor. 18 celler over tre uafhængige forsøg blev afbildet for hvert tidspunkt. D) et histogram over antallet af normaliserede pixelantal detekteret ved hver GFP levetid for celler, der udtrykker både GFP-ROCK-1 donor og mRFP-LIMK-2 acceptor i MDA-MB231-celler forbehandlet med Y27632. n = 9.

Diskussion

Tidligere undersøgelser havde ikke identificeret, om en ROCK: LIMK vej bidraget til induktion af membranblæredannelse. Vi leverer her for første gang tegn på en direkte og konkret samspil mellem rock1 og LIMK 2 i godt spredt mesenkymale celler, som er fraværende i afrundede blæredannelse celler. Brug af FRET mikroskopi fandt vi ingen interaktion mellem ROCK-1 og LIMK-2 i celler, som viste en membranblæredannelse fænotype, trods vores egen bevis for, at LIMK2 er det foretrukne ROCK substrat i disse celler. Vores resultater tyder på, at en rock1: LIMK2 interaktion ikke er involveret i blebbing /afrundede fænotype og ville ikke være behov for amoeboid migration. Faktisk overekspression af LIMK2 inducerer ikke membranblæredannelse i celler. De seneste rapporter tyder på, at cellulære begivenheder nedstrøms af ROCK aktivering faktisk separat koordineres selvom MLC og cofilin phosphorylering [32].

I modsætning vores FRET studier identificeret en direkte interaktion mellem rock1 og LIMK2 i koncentreret foci i cytoplasmaet i kræft celler med en mesenchymale morfologi. Phosphorylering af LIMK-2 ved ROCK-1 i cellen center vil øge niveauet af phosphoryleret cofilin og dermed mindske F-actin overskæring. Dette ville stabilisere actomyosin filamenter stede i celle legeme og fremme dannelsen af ​​den kontraktile kraft er nødvendig for hale tilbagetrækning og cellevandring [33]. Faktisk har det tidligere vist, at TGF-induceret actin stress fiber dannelse medieres af en ROCK-1 /LIMK-2 /cofilin pathway [26]. For nylig, en ROCK: blev LIMK1 pathway impliceret i koordineringen af ​​cofilin aktivitet på plasmamembranen af ​​invasive rotte brystcarcinomceller [34], [35]. Vores resultater peger på en særskilt funktion for LIMK1 og LIMK2 nedstrøms ROCK under brystkræft celle migration. Vi spekulere, at samspillet mellem rock1 og LIMK2 ikke spiller en væsentlig rolle i membranblæredannelse associeret celle migration eller i reguleringen af ​​cofilin fosforylering på cellens periferi. Snarere samspillet mellem rock1 og LIMK2 er begrænset til cellen kroppen af ​​polariseret velpraeparerede celler, hvor er bidrager til stabilisering af actomyosin filamenter og generering af kontraktile kraft gennem inaktivering af cofilin.