PLoS ONE: proteomiske profilering Exosomer Fører til identifikation af nye biomarkører for prostata Cancer

Abstrakt

Baggrund

Aktuelle markører for prostatakræft, såsom PSA mangler specificitet. Derfor er der behov hidtil ukendte biomarkører. Desværre, kompleksiteten af ​​kropsvæsker ofte hæmmer biomarkør opdagelse. Et attraktivt alternativ fremgangsmåde er isolering af små vesikler, dvs. exosomer, -100 nm, som indeholder proteiner, der er specifikke for det væv, hvorfra de er afledt, og derfor kan betragtes som skattekister for sygdomsspecifik biomarkør opdagelse.

Materialer og metoder

Exosomer blev isoleret fra 2 immortaliserede primære prostata epithelceller (PNT2C2 og RWPE-1) og 2 PCA cellelinier (PC346C og VCap) efter ultracentrifugering. Efter tryptisk fordøjelse, analyser proteomik udnyttet en nanoLC kombineret med en LTQ-Orbitrap drives i tandem MS (MS /MS) mode. Nøjagtig masse og Time (AMT) tag fremgangsmåde blev anvendt for peptid identifikation og kvantificering. Kandidat biomarkører blev valideret af Western blotting og Immunhistokemi.

Resultater

proteomiske karakterisering resulterede i identifikationen af ​​248, 233, 169 og 216 proteiner ved mindst 2 peptider i exosomer fra PNT2C2, RWPE -1, PC346C, og VCap hhv. Statistiske analyser afslørede 52 proteiner forskelligt rigelige mellem PCA og kontrol celler, hvoraf 9 var mere rigelige i PSA. Validering af Western blotting bekræftede en højere overflod af FASN, XPO1 og PDCD6IP (ALIX) i PCA exosomer.

Konklusioner

Identifikation af exosomal proteiner ved hjælp af højtydende LC-FTMS resulterede i opdagelsen af ​​PDCD6IP , FASN, XPO1 og ENO1 som ny kandidat biomarkører for prostatakræft

Henvisning:. Duijvesz D, Burnum-Johnson KE, Gritsenko MA, Hoogland AM, Vredenbregt-van den Berg MS, Willemsen R, et al. (2013) proteomiske profilering Exosomer Fører til identifikation af nye biomarkører for prostatakræft. PLoS ONE 8 (12): e82589. doi: 10,1371 /journal.pone.0082589

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østrig

Modtaget: 16. juli 2013; Accepteret: 25 oktober 2013; Udgivet: December 31, 2013

Copyright: © 2013 Duijvesz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostata Specifikt Antigen (PSA) er en klinisk anvendelig. protein biomarkør for diagnostik og opfølgning efter behandling for prostatakræft (PCA). Ikke desto mindre blev PSA-baserede screening vist at have en høj risiko for overdiagnostik og overbehandling fordi det mangler specificitet [1], [2]. For at skelne mere præcist mellem godartede prostata sygdomme og (forskellige former) af PCa, forhindre unødvendige prostata biopsier, og støtte urolog anbefale optimal behandling, er der et akut behov for nye molekylære biomarkører.

I de sidste par årtier , en enorm mængde af forskning er blevet udført for at finde nye og bedre biomarkører for PCa, ofte ved hjælp af state-of-the-art massespektrometri teknologier, men opdagelsen af ​​hidtil ukendte lav tæthed protein er generelt blevet hæmmet af kompleksiteten af ​​serum eller urin [3]. Isolering af exosomer fra kropsvæsker udgør en attraktiv tilgang til at omgå disse begrænsninger og muliggøre påvisning af kandidat (lav rigelige) biomarkører.

De seneste fund i søgningen efter nye biomarkører har afsløret, at små exosomer (50-150 nm) , er til stede i serum og urin [4]. Ved at isolere exosomer fra kropsvæsker bør det være muligt at overvinde det dynamiske område udfordring og lette karakteriseringen af ​​væv /cancer-afledte proteiner, der kan mere nøjagtigt repræsenterer cellulære betingelser. exosomer kunne derfor være nyttig til bestemmelse af individuelle tumor egenskaber [5], [6].

I denne undersøgelse var vores mål at bestemme tilstedeværelsen og betydningen af ​​exosomal proteiner som nye kandidat biomarkører for PCa ved at sammenligne exosomer fra ikke-kræft prostata cellelinjer til exosomer fra PCA-cellelinjer.

Materialer og metoder

Cell kultur og isolation

To menneskelige udødeliggjort prostata epiteliale cellelinjer (PNT2C2 [7] og RWPE-1) og to PCA cellelinier (PC346C [8] og VCAP [9]) blev dyrket i 10 T175 (175 cm

2) dyrkningskolber (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Tyskland) op til 80- 100% sammenflydning. Den PNT2C2 og VCap cellelinien blev dyrket i RPMI 1640 (Lonza, Verviers, Belgien) og suppleret med 5% og 10% FCS, 500 U penicillin og 500 U streptomycin (Lonza, Verviers, Belgien). Den RWPE-1 cellelinje (ATCC-LGR, Wesel, Tyskland) blev dyrket i keratinocyt serumfrit medium (Invitrogen, CA, USA) og suppleret med 5 ml Pen-Strep og et kommercielt kit indeholdende ekstrakt fra bovin hypofyse (BPE, 0,05 mg /ml) og epidermal vækstfaktor (EGF, 5 ng /ml). Den PC346C cellelinjen blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium-Hams F-12-medium (Lonza), suppleret med flere additiver som beskrevet af Marques [10].

Efter at have nået 80-100% konfluens blev cellerne inkuberet med 25 ml serumfrit medium. Efter 48 timer blev supernatanten opsamlet og underkastet centrifugering trin på 400 ×

g Hotel (10 min), 3000 ×

g Hotel (20 min), og 10.000 ×

g

(30 min) for at fjerne cellerester. Exosomer blev derefter pelleteret ved 64.000

g Hotel (110 min), og ved 100.000

g

(saccharose gradient) i 1 time [11]. Mindst to separate exosomer isolationer fra hver af de fire cellelinier blev samlet. Samlede mængde og koncentration af exosomal proteiner af de poolede prøver blev målt med et BCA-assay (Pierce, Rockford, IL, USA).

Electron Microscopy (EM)

5 pi exosomer var plettet på Formvar-coatede gitre (200 mesh) og fikseret i 2% paraformaldehyd. Efter fiksering exosomerne blev negativt farvet under anvendelse af 4% uranylacetate. Gitre blev undersøgt af en Philips CM100 elektron mikroskop ved 80 kV.

Prøveforberedelse for massespektrometri

TFE (2,2,2-trifluorethanol) (Sigma-Aldrich) blev sat til prøverne til en slutkoncentration på 50%. Prøverne blev sonikeret i et is-vandbad (Branson 1510, Danbury, CT) i 2 minutter og derefter inkuberet ved 60 ° C i 2 timer under konstant omrystning (300 rpm). For protein disulfidbro (S-S) reduktion, DTT (dithiothreitol) (Sigma-Aldrich) blev tilsat ved en slutkoncentration på 2 mM, efterfulgt af lydbehandling i 2 min. Prøverne blev centrifugeret ned og inkuberet ved 37 ° C i 1 time under omrystning (300 rpm). Prøverne blev fortyndet, 5 gange med 50 mM ammoniumbicarbonat (pH 7,8) før tilsætning sekventeringskvalitet modificeret trypsin (Promega, Madison, WI) for protein fordøjelse (1:50 vægt /vægt trypsin-til-protein). Prøverne blev rystet (300 rpm) natten over (16 h). Hurtig nedfrysning af prøverne i flydende nitrogen slukkes fordøjelsen. Alle prøver blev koncentreret ned i Speed-Vac SC 250 Express (Thermo Savant, Holbrook, NY).

Massespektrometri

proteomiske målinger blev udført ved hjælp af en nanoLC-MS ved Environmental Molecular Science Laboratory (EMSL), Richland, WA, USA. Den analytiske platform bestod af en on-line konstant tryk (5000 psi) omvendt fase (C

18) væskekromatografi (RPLC) systemet [150 um id × 360 um OD × 65 cm kapillar (Polymicro Technologies Inc., Phoenix , AZ)] koblet til en LTQ-Orbitrap massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) via en elektrospray-ionisering (ESI) source fremstillet in-house [12]. Kort fortalt blev fuld MS erhvervet gennem

m

/

z

intervallet 400-2000 ved opløsning på 100.000, efterfulgt af data-afhængige LTQ MS /MS for de øverste seks hyppigst forekommende ioner i hver fuld MS scanning ved hjælp af en kollision energiindstilling på 35% og dynamisk udelukkelse på 60 s. En eksponentiel HPLC gradient af -100 minutter (fra 0-70% -gradient B) blev anvendt til hver analyse, med mobile faser bestående af 0,1% myresyre i vand (A) og 0,1% myresyre i ACN (B). Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer, med ca. 5 ug totalt peptid forbrugt (dvs. sat på søjlen) i hver analyse.

massespektrometri Dataanalyse

Den resulterende MS data blev analyseret ved anvendelse den PNNL udviklede Nøjagtig masse og Time (AMT) Tag rørledning [13]. SEQUEST software [14] blev brugt til at søge tandem massespektre mod UniProt menneskelige database (download den 5. april 2011). Trygt identificerede peptider (tabel S1 i filen S1) blev samlet i en exosomet-specifikke AMT tag database. For sammenlignende analyser blev LC-MS funktioner matchet mod AMT tags for identifikation og relative MS-peak intensiteter blev brugt til at udlede ændring i overflod. AMT tag tilgang lettet kvantificering af mange flere peptider end spektral tælling alene. Så længe en peptid blev identificeret i mindst én prøve /analyse (ved tandem MS), kan det kvantificeres i alle datasæt, hvor det blev påvist, selv om LC-MS funktion ikke var rigelige nok til at blive opsplittet i det pågældende analyse . Viper software [15] blev brugt til at korrelere AMT mærkeindgange (identificerede peptider) med LC-MS funktioner afhængige af høj masse målenøjagtighed (MMA 2 ppm) og normaliseret elueringstid nøjagtighed (NET~2.5%). Følgelig hver LC-MS funktionen matchede tilbage til et enkelt peptid (AMT tag) hvorved en topintensitet værdi (eller relativ forekomst) for at peptid. For redundante peptid identifikationer i tilfælde af et enkelt peptid matchende multiple proteiner (typisk proteinisoformer) en-repræsentant protein blev valgt; derfor, hver rapporterede peptid matcher tilbage til et enkelt protein. Intet peptid identifikationer blev foretaget på masse alene.

I de 263 identificerede proteiner, blev det humane protein reference Database (HPRD) og opfindsomhed Pathway Analysis (IPA) anvendes til at bestemme subcellulær placering og biologisk funktion [16].

Valg af potentielle protein biomarkører for prostatakræft blev udført ved hjælp af to uafhængige metoder. Først blev proteiner valgt, der var til stede i begge PCA cellelinie afledt exosomer og fraværende i både ikke-PCA exosomer. Med den anden metode, Dante software [17] blev brugt til at konvertere peptid peak intensitet værdier til en log2 omfang og vurdere dem på et protein niveau ved hjælp Rrollup (henvisning peptid baseret skalering) parametre, hvor peptider blev udelukket fra skalering, hvis de ikke blev set i mindst tre datasæt og ingen minimum peptid tilstedeværelse var påkrævet. Proteiner der præsenteres i dette manuskript blev identificeret ved mindst to peptider. ANOVA parvise sammenligninger mellem hver PCa og kontrol cellelinie blev også udført i Dante hvor det minimale antal datapunkter pr faktor blev fastsat til tre, så at for et protein for at vise statistisk signifikante ændringer det ville skulle identificeret i alt tre gentagelser. Signifikant forskel blev bestemt som en p-værdi og q-værdi lavere end 0,05. Dante genererer p-værdier og estimater deres q-værdier. Q-værdien af ​​en test måler andelen af ​​falske positive afholdt (kaldet falsk opdagelse sats) når den pågældende test kaldes signifikant. Kun de væsentligt forskellige proteiner blev udvalgt til opsyn hierarkisk klyngedannelse. Klynge og TreeView software blev brugt til at logge transformere, betyde center relative ekspressionsniveauer værdier, og efterfølgende hierarkiske klynge alle proteinerne baseret på deres ekspression [18]. For at vælge de mest lovende proteiner yderligere blev a≥1.5 log2 fold ændring cutoff anvendes sammen med et krav om, at hvert protein viste signifikant ændring i mindst to af de fire sammenligninger, der er anført i tabel 1. Tabel 1 angiver de resulterende 52 proteiner, 9 som viste øget (og 43 faldt) overflod i exosomer afledt PCA cellerne.

for at vælge de mest lovende proteiner fra de to tilgange yderligere blev proteiner skaleret baseret på prostata preferentiality. Fem forskellige humane genekspression atlas [19] – [23] baseret på mikroarray udtryk data blev kombineret i SRS [24], for at bestemme protein-tilsvarende gen-ekspression. Til sidst blev prostata preferentiality bestemt som 1,5 gange højere udtryk i prostata væv i forhold til nyre og blære væv ved hjælp af genekspression microarray data [25].

Western blotting

Fra alle exosome prøve 5 pg protein blev blandet med Laemmli-prøvebuffer (01:01), opvarmet til 95 ° C i to minutter og fyldt på 10% endimensionale SDS-PAGE-geler. Efterfølgende blev proteiner overført på Protran nitrocellulosemembraner (Whatman s Hertogenbosch, Holland) og blokeret (1 h) ved stuetemperatur med 5% fedtfri tørmælk i Tris-saltvand med 0,1% Tween-20. Derefter blev gelerne inkuberet natten over ved 4 ° C med antistoffer mod: PDCD6IP (1:500 fortynding, Sigma-Aldrich), FASN (1:500 fortynding, Sigma-Aldrich), XPO1 (1:200 fortynding, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland), ENO1 (Clone H300, 1:1000 fortynding, Santa Cruz Biotechnology), GAPDH (Clone 7B, 1:500 fortynding, Santa Cruz Biotechnology), CD9 (Klon 209.306, 1:500 fortynding, R 0,05).

Udvælgelse af potentielle biomarkører

For at vælge proteiner, der viser signifikant ændring i overflod mellem PCA exosomer og ikke -PCa exosomer vi bruges ANOVA parvise sammenligninger (dvs. p-værdi og q-værdi 0,05, tilstedeværelse i alle analyser, ≥2 peptider) [17]. Tabel S4-8 i filen S1 indeholder resultater opnået for PC346C (PCA) vs. PNT2C2 (kontrol), PC346C (PCA) vs. RWPE-1 (kontrol), VCAP (PCA) vs. PNT2C2 (kontrol), og VCap ( PCA) vs. RWPE-1 (kontrol). For yderligere at forbedre tilliden, vi kræves, at hvert protein blev bestemt til at være signifikant forandring i overflod i mindst 2 sammenligninger; dette yderligere reduceret vores liste til 52 proteiner (tabel 1 og tabel S9 i filen S1).

Vores proteomisk analyse viste PDCD6IP, FASN, CD9, og ENO1 at have væsentlig ændring i overflod mellem to betingelser, mens XPO1 gjorde ikke passere vores strenge filtreringskriterier og blev derfor anset uændret i overflod i VCAP vs RWPE-1 sammenligning (tabel S8 i filen S1). Alligevel valgte vi at validere XPO1 grund af dens højere overflod i VCAP exosomer sammenlignet med RWPE-1 kontrol og tilgængeligheden af ​​en høj kvalitet antistof egnet til Western blotting og immunhistokemi.

Udforskning af nye kandidat biomarkører

i FASN og XPO1, observeredes stærke signaler i helcellelysater sammenlignet med exosomer, og der synes at være relativt højere overflod i VCap exosom prøve (figur 4). Proteinet PDCD6IP er beriget i exosomer og viser højere forekomst i begge PCa-afledte exosom prøver som afbildet i figur 4 og tabel 1. Baseret på MS-analyser, FASN er betydeligt højere i de PC346C exosomer sammenlignet med både kontroller og i VCap exosomer sammenlignet at RWPE-1 kontrol. Denne højere overflod af FASN i PC346C bekræftes af Western blot. CD9 er stærkt beriget i exosomer og viser relativt høj overflod i de PC346C exosomer. XPO1 udstillet højere overflod i de VCAP exosomer sammenlignet med kontroller. MS-data karakteriseret ENO1 at være faldet betydeligt i overflod i PC346C forhold til både kontroller og i VCAP sammenlignet med PNT2C2 kontrol. Western blotting af ENO1 afslørede et yderligere bånd (ca. 30 kDa) inden for de to PCa-afledte exosom prøver. Som forventet, baseret på forskellen i PSA-sekretion og exosom dannelse, PSA er overvejende til stede i de to cancer celleprøver og fraværende i exosomer. Supernatanter, der blev opsamlet efter exosomer blev pelleteret under ultracentrifugering, ikke indeholder nogen af ​​de exosomal proteiner, undtagen ENO1 og GAPDH unikt i VCap medium.

Alle fire exosom prøver og deres tilsvarende cellelinier blev anvendt til validering. Endvidere blev supernatant fra de pelleterede exosomer anvendt som kontrol. De udvalgte proteiner FASN, XPO1, CD9 og PDCD6IP, blev testet med ENO1 og GAPDH som kontroller. PSA blev testet for at bekræfte det udskilles gennem alternativ sekretion vej og derfor ikke er til stede inden for exosomer. Den nærmeste protein markør (kDa) er angivet for hvert blot.

Verifikation af udtryk i kliniske prøver

PDCD6IP viste stærk luminale og basal epitelial cytoplasmatisk farvning i normal tilstødende prostata (NAP) , men ingen ændringer i proteinekspression i PCa væv med forskellige Gleason scorer (Figur 5). I NAP, FASN er moderat til meget rigelige i epitelceller. Men når Gleason scorer stiger, farvning bliver stærkere. Vedrørende XPO1, der er en stærk nuklear overflod i NAP og en svag cytoplasmatisk farvning. Inden PCA celler, den cytoplasmatiske overflod stiger med Gleason score. Nuklear farvning forbliver lige blandt alle PCA væv.

Repræsentative billeder af farvningen fra 2 uafhængige prøver pr gruppe.

Diskussion

Sammenligning af exosomer afledt af kræftcellen linjer og udødeliggjort prostata epitelceller, giver et kraftfuldt værktøj til at overvinde det dynamiske område udfordring og identificere nye lave rigelige cancer-afledte biomarkører. Denne unikke tilgang inden exosomal protein forskning, kombineret med state-of-the-art LC-MS analyser lettet identifikation af nye kandidat biomarkører for PSA. Denne undersøgelse beskriver exosomal proteinekspression fra flere PCA-cellelinjer, men også undersøger exosome indhold fra flere udødeliggjort normal prostata epitelceller. I forhold til tidligere undersøgelser, dette gør os i stand til mere pålideligt identificere PCa-specifikke kandidat biomarkører og fælles exosomal proteiner. Brug Western blotting og IHC, vi kontrollere forskellen udtryk og vise, at kandidatlandene markører udtrykkes af prostata kræftceller i patientprøver.

Det samlede antal unikke proteiner vi identificeret i denne undersøgelse (496 ved ≥1 peptid, 263 af ≥ 2 peptider), er sammenlignelige med tidligere publicerede exosom proteom rapporter. [26] – [30]. Tildeling af en subcellulær lokalisering afslørede, at en stor del af exosomal proteiner normalt finde i cytoplasmaet eller cellekernen af ​​celler. Efter sammenligne dette til en database, der indeholder et stort flertal af alle proteiner (~20,000), bemærkede vi, at exosomer har en relativt sammenlignelig overflod af nukleare proteiner, højere overflod af cytoplasmatiske proteiner og en væsentligt lavere overflod af ekstracellulære proteiner. Dette passer den nuværende teori om exosome dannelse [4]. Exosomer vise en overrepræsentation af transmembrane og cytoplasmatiske proteiner, såsom CD9 og PDCD6IP, som det fremgår af Western blotting. Dette fund er enig med den teori, at biogenese og udvælgelse af exosomal indhold er ikke en tilfældig procedure, men i det mindste delvis resultatet af en selektiv sortering proces [4].

To nylige proteom undersøgelser viste exosomal proteiner relateret til prostata kræft [30], [31]; Sandvig

et al.

Udført LC-MS-analyse på en enkelt prostata (kræft) cellelinie, var Hosseini-Beheshti

et al.

Undersøgt fem PCA cellelinjer og én ikke-maligne prostata epitelial cellelinie. De begge rapporterede 266 og 220-proteinerne, som er magen til det antal vi afsløret. Interessant, Sandvig

et al.

Rapporteret et andet protein subcellulær distribution og korrelation med biologiske processer i forhold til vores data. Sandvig

et al.

Foreslået CDCP1 og CD151 som kandidat markører, var Hosseini-Beheshti foreslog ANXA2, CLSTN1, FLNC, FOLH1 og GDF15. Hosseini-Beheshti

et al.

Viste også FASN at være en exosomer-afledt kandidat biomarkør (efter aftale med vores resultater). Når vi sammenligner deres identificerede proteiner (af 2 peptider) bemærkede vi et overlap på kun 9 proteiner, henholdsvis CD9, ANXA1. ACTB, PGK1, RAN, EPCAM, HSPB1, PDCD6IP og PRDX1 (figur 6). Disse proteiner er tidligere blevet offentliggjort i flere artikler og anses for at være til stede i næsten alle exosomer. PDCD6IP er også blevet identificeret af både forskere, men har ikke vist sig at være mere rigelige i PCa-afledte exosomer. I alt 199 proteiner er entydigt blevet fundet i vores undersøgelse, herunder kandidat biomarkør XPO1. Overlappet mellem studierne er ret begrænset. Især forventes ikke et overlap på kun 42 proteiner mellem vores undersøgelse og Hosseini-Beheshti

et al.

Siden partiets de samme cellelinjer blev udnyttet (VCAP og RWPE-1). Denne smalle overlap kunne være resultatet af forskellige oprensningsmetoder, MS-MS teknologier og databehandling rørledninger anvendes. Desuden, hvis exosomer indeholder en stor samling af forskellige proteiner, overlapning mellem databaser kan være begrænset, hvis kun en brøkdel af alle proteiner identificeres i hver undersøgelse. En nylig rapport fra Principe

et al.

Viste den første identifikation af mere end 900 proteiner i exosomer fra humant prostata væske fra patienter med lav kvalitet PCa og raske mænd [32]. Når vi sammenlignet deres unikke proteinekspression (tilstedeværelse af 2 peptider), kun 31 proteiner overlapper hinanden, herunder flere annexiner (ANXA1-7), peroxiredoxins (PRDX1-6), PDCD6IP og generel transmembrane proteiner (CD9 /CD242 /CD44). Alle disse proteiner menes at være til stede i næsten alle exosomer. I hvilket omfang den begrænsede overlapning skyldes faktiske forskelle mellem cellelinie-afledte exosomer og vesikler fra kliniske prøver, mangler stadig at blive etableret.

Antallet af proteiner identificeret i hvert studie er en samling af kræft- afledte exosomal proteiner identificeret ved MS-MS.

Vi identificerede PDCD6IP som værende beriget i exosomer, især i PCA exosomer. PDCD6IP, også kendt som ALIX, er et cytoplasmatisk protein, der er kendt for sin rolle i apoptose og er vist at være involveret i reaktionsvejen for udvalgte sortering efter ESCRT-komplekser [33]. PDCD6IP er blevet anvendt som en generel markør for at bevise tilstedeværelsen af ​​exosomer [34]. Der blev imidlertid ikke association lavet med en højere overflod i kræft-afledte exosomer. En mulig forklaring på høj PDCD6IP overflod i PCa-afledte exosomer kunne være, at PCA celler har en ændret produktion af exosomer, hvor de ikke er i stand til at regulere sortering af exosomal indhold korrekt længere. Det er også muligt, at kræftceller forsøge at fjerne PDCD6IP proteinet ved exosome sekretion til (delvis) undertrykke apoptose. Som supplement til dette teori, har andre ikke-PCa relaterede undersøgelser vist, at overekspression af PDCD6IP korrelerer med celledød [35]. Ved hjælp af IHC, vi fandt ikke nogen forskel i PDCD6IP overflod mellem normal prostata epitel og PCa væv.

Både FASN og XPO1 har en højere overflod i PCA exosomer afledt VCap celler. FASN katalyserer dannelsen af ​​langkædede syrer fra acetyl-CoA, malonyl-CoA og NADPH og er allerede blevet foreslået som en markør for PCa [36], [37]. Nylige undersøgelser viste, at FASN primært udtrykkes i hormon-følsomme celler, fremme celleproliferation og at inhibering af FASN effektivt og selektivt dræber cancerceller [36]. Imidlertid blev disse undersøgelser alle udført

in vitro

. Den VCap cellelinie anvendt her er hormon-følsomme, hvilket kunne forklare den højere overflod af FASN i VCap-afledte exosomer. Kræftceller producere mere FASN, sandsynligvis fordi det fremmer celledeling, hvilket kan føre til højere inkorporering i exosomer. I overensstemmelse med tidligere resultater [38], vi også observeret en øget overflod i PCa i forhold til NAP.

XPO1 er blevet foreslået som en prognostisk markør for andre typer af kræft [39]. XPO1 er en nuklear protein kendt for at være involveret i nuklear-cytoplasmatisk eksport af signal-bærende (NES) proteiner, som spiller en rolle i relevante tumor signalveje, såsom P53, Akt1, HDAC5, androgen receptor (AR) og EGFR [40] – [42]. Vores resultater viser, at XPO1 kunne være en potentiel biomarkør for PSA. Når dette protein er valideret på hele afsnit PCA prøver med IHC, vi observere en stærk nuklear udtryk og en meget svag cytoplasmatisk udtryk. Interessant, inden kræftceller, dette protein synes at translokere ind i cytoplasmaet. Med stigende Gleason score, cytoplasmatisk XPO1 ekspression bliver mere intens. Hvorfor denne proces sker stadig uklar. I en normal celle, XPO1 skal transporteres fra cytoplasmaet tilbage i kernen for at fungere som en chaperone protein. Hvis denne udflytning proces hæmmes i kræft, vil cytoplasmatisk XPO1 akkumulere og mere XPO1 kan få indarbejdet i exosomer.

Som tidligere offentliggjort, vises en ekstra protein bånd (ca. 30 kDa) med Western blotting ved brug af et antistof rettet mod ENO1 i PC346C cellelinjen [43]. Her viser vi, at dette band er også til stede i VCAP exosomer og fraværende i exosomer fra to ikke-PCA cellelinjer. Oprindelsen af ​​det yderligere bånd kunne være et ikke-specifikt antistof krydsreaktion til et andet protein, en alternativ splejset ENO1, et oversat fragment eller et nedbrydningsprodukt fra det oprindelige protein. En kendt protein isoform kaldet MBP-1 (c-myc-promotor-bindende protein-1) produceres form ENO1 genet [44]. MBP-1 er identisk i sekvens med ENO1 men mangler de første 93 eller 96 aminosyrer. Med en beregnet molekylmasse på 36 kDa, MBP-1 er usandsynligt den estimerede 30 kDa ekstra bånd. Den iagttagelse, at denne ekstra bånd kun forekommer i både kræft prøver kunne indikere, at det kan have en relation til PSA.

De nye markører, vi identificerede kom fra cellelinje-afledte exosomer. Selvom exosomal tilstedeværelse og kræftvæv udtryk for et udvalgt sæt af kandidat biomarkører blev bekræftet ved hjælp af Western blotting og IHC, er uafhængig validering af kandidatlandene markører stadig behov på en stor samling af prøver, såsom patientens urin exosomer eller vævsprøver. Dette vil belyse deres rolle som biomarkør for PSA.

For at teste tilstedeværelsen af ​​exosomal proteiner i store grupper af patientprøver, kan man ty til standard IHC af kandidat markører på væv microarrays og prostata biopsier. Alternativt kan intakte exosomer isoleres fra urin eller plasma under anvendelse af udfældning, filtrering eller immunocapture protokoller hvorefter indholdet af exosomer kan måles ved ELISA’er, specifikke for proteinerne af interesse. ELISA er i øjeblikket ved at blive udviklet til påvisning af intakte prostata-afledte exosomer bruger capture eller afsløring antistoffer rettet mod kendte prostata-specifikke transmembrane proteiner. Et sådant assay gør det muligt at identificere ekspression af transmembrane proteiner, men også estimere antallet af exosomer.

Konklusion

Prostata (kræft) celler udskiller exosomer der kan anvendes til at identificere hidtil ukendte kandidat biomarkører til PCA . Identifikation af exosomal proteiner ved højtydende LC-FTMS resulterede i opdagelsen af ​​PDCD6IP, FASN, XPO1 og ENO1 som ny kandidat biomarkører for PSA. I den næste fase vil alle foreslåede kandidat biomarkører blive vurderet på patientprøver (væv, serum eller urin) til fuldt ud at belyse deres potentielle kliniske værdi.

Støtte Information

File S1.

Støtte oplysninger, der indeholder 9 understøtter informationsfiler. Tabel S1 i filen S1: trygt identificerede peptider (n = 1494) blev samlet i en exosomet-specifikke AMT tag database. Tabel S2 i fil S1: 1494 ikke-redundante peptider svarer til 496-proteiner med mindst 1 peptid.