PLoS ONE: Identifikation af en Annonaceous Acetogenin Mimetisk, AA005, som en AMPK Activator og Autophagy Inducer i Colon Cancer Cells

Abstrakt

Annonaceous acetogenins, en stor familie af naturligt forekommende polyketider isoleret fra forskellige arter af planten slægten

Annonaceae

, har vist sig at udvise signifikant cytotoksicitet mod en række forskellige cancerceller. Tidligere undersøgelser har vist, at disse forbindelser kunne virke på mitokondrierne kompleks-I og blokere den tilsvarende elektrontransportkæden og afslutte ATP-produktion. Men flere detaljer om de virkningsmekanismer forbliver tvetydige. I denne undersøgelse testede vi virkningerne af et sæt af mimetika af annonaceous acetogenin på nogle cancercellelinjer, og rapporterer, at blandt dem AA005 udviser den mest potente antitumoraktivitet. AA005 udtømmer ATP, aktiverer AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) og hæmmer mTOR kompleks en (mTORC1) signal vej, der fører til væksthæmning og autophagy af tyktarmskræft celler. AMPK-hæmmere sammensatte C og inosin undertrykke, mens AMPK aktivator AICAR forbedrer, AA005-forårsagede spredning undertrykkelse og efterfølgende autophagy af tyktarmskræft celler. AA005 øger ATP udtømning og AMPK-aktivering forårsaget af 2-deoxyglucose, en inhibitor af mitokondrie respiration og glykolyse. AA005 hæmmer også kemoterapeutisk middel cisplatin-udløst opregulering af mTOR og synergistisk med dette stof i suppression af proliferation og induktion af apoptose af colon cancerceller. Disse data indikerer, at AA005 er en ny metabolisk inhibitor, der udviser terapeutiske potentialer i tyktarmskræft

Henvisning:. Liu Y-Q, Cheng X, Guo L-X, Mao C, Chen Y-J, Liu H-X, et al. (2012) Identifikation af en Annonaceous Acetogenin Mimetisk, AA005, som AMPK Activator og Autophagy Inducer i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 7 (10): e47049. doi: 10,1371 /journal.pone.0047049

Redaktør: Xiaolin Zi, University of California Irvine, USA

Modtaget: 31 Jan 2012; Accepteret: September 11, 2012; Udgivet: 8. oktober, 2012 |

Copyright: © Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af National Key Program for Basic Research (2012CB910800, 2010CB833200 og 2009CB940900), National Natural Science Foundation (nr 81.071.930, 81.171.925, 20.972.160 og 21.172.220), den Særlige Fond præsident og Key Project of Knowledge Innovation Program af det kinesiske Academy of Sciences (KSCX1-YW-R-26 og KSCX2-YW-R-235), og National store videnskabelige og teknologiske Program for Drug Discovery (2009ZX09103-101). Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i tumorceller der er en øget glycolytiske pathway enzymer og glukosetransportører selv i nærværelse af en høj O

2-koncentration, i sidste ende fører til en forhøjet ATP produktionshastighed [1]. Klinisk dokumentation har linket celle metabolisme med kræft resultater, og omprogrammering energistofskifte er blevet godkendt til at være en spirende kendetegnende for kræft [2]. Disse observationer har rejst interesse i at målrette energistofskiftet for kræft terapi for både hypoxiske (glykolytisk) og oxidative tumorer [1], om end også vedrører, at disse behandlinger ville have uacceptable virkninger på normale celler. Interessant nok nogle af de første behandlinger mod kræft rettet mod specifikke metaboliske behov kræftceller forbliver effektive i klinikken i dag, re-inspirerende indsats for at målrette metaboliske afhængigheder af kræftceller som en selektiv anticancer-strategien [3].

AMP- aktiveret protein kinase (AMPK), der eksisterer i celler som en heterotrimert kompleks sammensat af en katalytisk kinase subunit (α) og to regulatoriske underenheder (p og y), er en sensor af energi status som opretholder cellulær energi homeostase. Den aktiveres af et fald i ATP (samtidig med en stigning i ADP og AMP) eller stimuli, der øger den cellulære AMP /ATP-forhold, hvilket resulterer i aktiveringen af ​​kataboliske pathways og inhiberingen af ​​anabolske pathways [4], [5]. Afgørende for aktivering af AMPK er dens phosphorylering på Thr-172 ved en opstrøms AMPK kinaser (AMPKKs) [6] og tumor suppressor LKB1 [7], som er en serin /threonin kinase forbundet med gastrointestinal polypose og cancer [8] og lungecancer [ ,,,0],9]. AMPK phosphorylerer to hastighedsbegrænsende enzymer i fedtsyre og cholesterolsyntese: acetyl-CoA carboxylase (ACC) og HMG-CoA-reduktase, såvel som andre downstream mål, der kulminerede i inhiberingen af ​​anabolske veje og aktiveringen af ​​kataboliske pathways [5] . AMPK aktivering direkte begrænser translationel initiering og proteinsyntese [10], gennem hæmning af translation elongeringsfaktor 2 (EF2) [11], og indirekte gennem TSC2, hvilket fører til undertrykkelse af pattedyr mål for rapamycin (mTOR) [12], som kan phosphorylere og aktivere p70 S6 kinase og 4E-bindende protein (4EBP) [13].

AMPK aktivering med AMP-analog 5-aminoimidazol-4-carboxamid ribonukleotid (AICAR) akkumulerer cyclin afhængige kinaseinhibitorer p21 og p27 og ned-regulerer cyclin D1 i humane hepatocellulære carcinomceller, hvilket fører til standsning af cellecyklus ved G1-fasen [14]. Befolkningsstudier give et fingerpeg, at anvendelsen af ​​metformin, som er en AMPK aktivator, kan være forbundet med reduceret forekomst og forbedrede prognose for visse kræftformer [15], [16]. I brystkræft, metformin udøver hæmmende effekter via hæmning af mTOR-afhængige translationsinitiering [17], [18]. Metformin inhiberer proliferation, nedsætter levedygtigheden og blokerer celle cellecyklussen i G1-fasen i prostatacancerceller, og in vivo behandling med metformin fører til en signifikant reduktion af tumorvækst i mus med xenografter af prostatacancerceller [19]. Metformin og AICAR inducere apoptose og undertrykker tumorvækst for tyktarmskræft HCT116 p53 (- /-) xenotransplantater, og udløse autophagy af HCT116 p53 (+ /+) celler [20]. AICAR og proteinfoldning inhibitor 17-AAG, især når de kombineres, show effektivitet mod aneuploide humane cancercellelinier [21]. Disse resultater indikerer, at AMPK kunne være en rationel drug target og blyforbindelser bør identificeres eller udformes til udvikling af terapeutiske muligheder for kræft.

Annonaceous acetogenins repræsenterer en klasse af naturligt forekommende polyketider isoleret fra forskellige arter af planten slægten

Annonaceae

[22]. Disse forbindelser udviser forskellige bioaktiviteter, herunder lovende cytotoxicites og antiparasitære aktiviteter [23]. Selvom undersøgelser viser, at annonaceous acetogenins kan forstyrre mitokondrie funktion gennem blokerer mitokondrier kompleks I og ubiquinon-linked NADH oxidase [23], og binde den tredje matrix-side løkke af ND1 underenhed i mitokondrie NADH-ubiquinon oxidoreduktase [23], [24], de virkningsmekanismer af disse forbindelser i kampen mod kræft stort set ukendt. Kemien gruppe af vores team havde designet og syntetiseret en række annonaceous acetogenin mimetika [25] – [28]. I dette arbejde testede vi den biologiske aktivitet af nogle nye analoger og undersøgt mekanismerne bag annonaceous acetogenins ‘cytotoksiciteter, og rapporterede, at en mimetisk AA005 som viste kraftige og selektive inhiberende aktiviteter over for en række forskellige cancerceller, var i stand til at aktivere AMPK og inducere celle cyklus anholdelse efterfulgt af autophagy, demonstrere dets terapeutiske potentialer

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

Annonaceous acetogenin mimetika (tabel 1) blev opløst i DMSO og opbevares ved. – 20 ° C. 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev indkøbt fra Amresco Inc. (Solon, OH). Forbindelse C, rapamycin, rotenon, inosin, rhodamin 123, 2-DG og AICAR blev indkøbt fra Sigma. MitoTracker Deep Red FM blev købt fra Invitrogen. ATP Assay Kit blev købt fra Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Jiangsu, Kina)

Antistoffer

Antistofferne anvendt i denne undersøgelse var som følger:. Anti-β-actin ( Sigma); anti-p-AMPKa1, anti-p-ACC, anti-p-mTOR, anti-p-S6K, anti-AMPKa1, anti-ACC, anti-mTOR, anti-S6K, anti-PARP, gede-anti-kanin IgG HRP og gede-anti-muse-IgG-HRP-antistof (Cell Signaling Technology); anti-CyclinD1 (Abcam), anti-CDK4 (Santa Cruz Biotechnology), og anti-LC3 (Sigma).

Celledyrkning og transfektion

lungecancer-cellelinie A549, brystcancercelle MCF-7 blev cervikale cancercellelinie HeLa, kolon cancercellelinier LOVO, SW480, HCT116 og HT29, og humane embryonale nyre HEK-293T-celler opnået fra American Tissue Culture Collection (ATCC). Humane embryonale lunge fibroblast MRC-5, mavekræft cellelinje SGC7901, og hepatisk cancer cellelinje BEL7402 blev købt fra Cell Resource Center, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing). De normale humane bronchiale epithelceller (HBEpiC) blev indkøbt fra ScienCell (ScienCell Research Laboratories, San Diego, Californien). Den 293T, A549, BEL7402, HeLa, MCF-7, SGC7901 og humane normale bronchiale epitelceller BEAS-2B [29] celler blev dyrket i Dulbecco modificeret Eagle medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco /BRL , Grand Island, NY), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. LOVO, SW480, HCT116 og HT29-celler blev dyrket i DMEM /F12 suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. MRC-5-celler blev dyrket i MEM /EBSS medium suppleret med ikke-essentielle aminosyrer, 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. HBEpiC celler blev dyrket i et serumfrit bronchieepithelceller cellemedium (ScienCell Research Laboratories) indeholdende bronchieepithelceller cellevækst supplement (ScienCell Research Laboratories). De pQCXIP-GFP-LC3 og pQCXIP-GFP-plasmider [30] blev transficeret ind LoVo celler ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Qiagen) i henhold til den anbefalede protokol af producenten.

Cell Levedygtighed, Cell Proliferation og klonogene assays

Cancerceller (5 x 10

3) blev podet i hver brønd på 96-brønds vævskulturplader (Coaster, Charlotte, NC) og behandlet med annonaceous acetogenin mimetika i 48 timer ved 37 ° C i en 5% CO

2 atmosfære. MTT-assayet blev udført som beskrevet [31], og IC

50 værdier blev beregnet under anvendelse af CalcuSyn software (version 2.0, Biosoft, Cambridge, UK). Cellelevedygtighed blev beregnet ved trypanblåt-udelukkelse. Den potentielle synergistiske, additive eller antagonistiske effekt mellem AA005 og 2-DG eller cisplatin blev omhyggeligt vurderet ved hjælp af CalcuSyn Software (Biosoft, Cambridge, UK) som beskrevet [32]. De dosis-effekt kurver af enkelt eller kombineret lægemiddelbehandling blev analyseret af median-effekt-metoden [33], hvor kombinationen indekser (CI) er mindre end, lig med, og større end 1 indikerer synergistiske, additive og antagonistiske virkninger, henholdsvis .

For foci dannelse, HT29, LOVO eller HCT116 behandlet med AA005 blev podet i tre eksemplarer i 35 mm plader (200 celler pr plade). Efter 8 dages dyrkning blev cellerne farvet med Giemsa og kloner indeholdende mere end 50 celler blev talt [29].

Analyse af Cell Cycle og Apoptose

For at detektere fordelingen cellecyklus, colon cancerceller blev synkroniseret til G1 /S grænsen af ​​en dobbelt thymidin blok [31] og derefter udsat for AA005 ved angivne koncentrationer i 24 timer. Celler blev høstet, fikseret med 70% kold ethanol i 4 ° C natten over. Cellerne blev centrifugeret og vasket med PBS, efterfulgt af inkubation med RNase og propidiumiodid (PI) (Sigma-Aldrich). Cellecyklusfordeling blev analyseret ved flowcytometri (BD FACS Vantage Diva, USA). Celle apoptose blev målt ved anvendelse PE Annexin V /PI Apoptosis Detection kit (BD Biosciences, San Jose, CA) ifølge producentens instruktioner.

Analyse af celler med GFP-LC3 vesikler

Celler blev transficeret med pQCX-IP-GFP-LC3 og pQCX-IP-GFP-udtrykkende plasmider i 24 timer og derefter behandlet med forskellige koncentrationer af AA005 i yderligere 24 timer. Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd /PBS i 15 minutter ved stuetemperatur og analyseret ved anvendelse af konfokal mikroskopi ved 63 ganges forstørrelse. Procentdelen af ​​GFP-positive blærer celler blev vurderet [30].

Måling af mitokondrie transmembranpotentialeændring ATP indhold og NAD

+ /NADH Ratio

Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af annonaceous acetogenin mimetika i 24 timer. Den mitokondrielle transmembrane potentiale blev undersøgt som beskrevet [34], blev ATP indhold målt ved hjælp af en ATP bioluminscensassayet Kit (Beyotime Institute of Biotechnology), og NAD

+ /NADH-forholdet blev målt ved hjælp Amplite ™ Kolorimetrisk NAD /NADH Assay Kit ( AAT Bioquest, Inc., Sunnyvale, CA) ifølge producentens instruktioner.

konfokal mikroskopi Analyser

Celler blev dyrket på dækglas og fikseret i 4% paraformaldehyd. Efter en kort vask i PBS suppleret med 100 mM glycin blev objektglassene blokeret med 5% bovint serumalbumin (BSA; Sigma) og 0,3% Triton X-100 i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur, og farvet for fluorescensmikroskopi som beskrevet [ ,,,0],31]. Celler efter AA005-influenza blev undersøgt ved anvendelse af et Zeiss LSM 510 META mikroskop udstyret med et 63 x olieimmersionsobjektiv. Billedbehandling og analyse blev udført med Zeiss LSM 510 softwareversion 3.2, ImageJ Version 1.42 (National Institutes of Health), og Adobe Photoshop Version 7.0 (Adobe Systems).

Western blotting

Cell pellets blev lyseret i RIPA-buffer indeholdende 50 mM Tris-HCI pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% deoxycholat, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 5 mM NaF, 1 mM natriumvanadat, og proteasehæmmere cocktail ( Sigma). Celler blev lyseret på is i 30 minutter i RIPA-buffer, blev lysater centrifugeret, proteinekstrakter blev kvantificeret og sat på 10% til 15% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel, elektroforeret og overført til en nitrocellulosemembran (Whatman). Membranen blev inkuberet med primært antistof, vasket og inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof. Detektion blev udført ved anvendelse af et kemiluminescerende western detektion kit (Cell Signaling Technology) [35].

Statistical Analysis

Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange, og dataene er vist som middelværdi ± SD medmindre andet er angivet. Forskelle mellem datagrupper blev evalueret for signifikans ved hjælp af Student

t

-test af uparrede data eller envejs variansanalyse og Bonferroni post-test.

P

værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Struktur-aktivitet relationer (SAR) Analyse af Annonaceous Acetogenin Miketika

En seriel annonaceous acetogenin mimetika. var blevet syntetiseret ved erstatning af både tetrahydrofuran (THF) ringe af naturlig bullatacin med en simpel diethylenglycol ether enhed af kemien gruppe af vores team [25] – [28]. Ni hidtil ukendte analoger blev syntetiseret i dette arbejde, og vi fandt, at mimetika AA005 [25] og AA093, en forbindelse med indførelsen af ​​en 10-hydroxygruppe på AA005, repræsenterede de to forbindelser, som havde de laveste IC50-værdier i denne indstilling ( tabel 1). Den iagttagelse, at sammensatte AA090 og AA091 mangler den rigtige lacton enhed og venstre 11-carbon hale udstillet en 17 til 170 gange lavere cytotoksicitet i kræftceller foreslået, at disse grupper er afgørende for cytotoksicitet AA005. AA101 med en ekstra lacton enhed indlejret i den venstre carbonhydridkæde del udviste en 23 til 142 gange lavere cytotoksicitet i kræftceller, hvilket yderligere bekræfter betydningen af ​​den lange hydrofobe hale og den højre terminale lacton i mimicry. Tilføjelse af en midterste ether apparatet til mimetika (forbindelserne AA102-105) lidt forbedrede deres anti-proliferative aktivitet sammenlignet med AA101, hvilket antyder, at en diethylenglycol ether enhed er afgørende for anti-proliferative aktivitet. De forskellige biologiske aktivitet af disse mimetika tyder på, at de strukturelle analoger ikke kan være funktionelle analoger.

inhibitoriske virkninger af AA005 på cancerceller

Fordi AA005 var den mest potente cytotoksisk middel blandt disse mimetika, vi yderligere testet dens virkninger på 11 menneskelige kræftceller og 4 noncancerous cellelinjer (HBEpiC, MRC5, HLF og 293T), og fandt, at AA005 viste forskellige effekter på kræftceller i at det havde potent hæmmende virkning på kolon (HCT116, HT29, LOVO og SW480), gastrisk (SGC7901), hepatisk (BEL7402), lunge (A549) og bryst (MCF7) kræft linjer, og svag effekt på cervikal (HeLa) kræftceller (figur 1A). AA005 udviste inhiberende virkninger på HCT116 (figur 1B), HT29 (figur 1C) og LOVO (figur 1D) celler i en dosis- og tidsafhængig måde. Interessant nok viste AA005 en endnu svagere aktivitet mod noncancerous (HBEpiC, MRC5, HLF, BEAS-2B og 293T) celler (figur 1A og tabel 1). Disse resultater indikerer, at de relative selektive hæmmende effekt af AA005 på kræftceller garanterer yderligere undersøgelse.

(A) IC

50 værdier af AA005 (i 48 h) for forskellige menneskelige kræft og noncancerous cellelinjer. IC

50 værdier (gennemsnit ± SD, uM) blev beregnet ud fra 3 uafhængige eksperimenter. (B til D) MTT analyser af HCT116 (B), HT29 (C) og LOVO (D) celler efter AA005 ved angivne koncentration og tidspunkter.

AA005 Undertrykker Cell Proliferation og Colony Forming aktivitet Colon cancer Cells

Vi analyserede yderligere virkningerne af AA005 på tyktarmskræft celler. Ved anvendelse af trypanblåt-udelukkelse analyser viste vi, at behandling med AA005 på 50 til 200 nM i 24 til 48 timer markant inhiberede proliferation af HT29, LOVO og HCT116, men ikke HBEpiC eller BEAS-2B-celler (figur 2, A og B) . Foci dannelse assay viste AA005 er potente hæmmende på kolonidannende aktivitet tyktarmskræft celler (Figur 2C). Vi analyserede virkningerne af AA005 på cellecyklus og fandt, at AA005 forårsagede en væsentlig stigning i procentdelen af ​​tyktarmskræft celler i G1 fasen i en dosisafhængig måde (figur 2D).

(A, B) Indiceret celler blev behandlet med eller uden AA005 i 48 timer eller angivne tidspunkter og analyseret ved trypan blå-udelukkelse assay. (C) Kolonidannelse assay til klonogene aktivitet for tyktarmskræft celler behandlet med eller uden AA005. (D) coloncancer-celler blev behandlet med AA005 ved angivne koncentrationer i 24 timer. Cellecyklusfordeling blev bestemt ved flowcytometri.

AA005 Mål Mitokondrier, udtømmer ATP og aktiverer AMPK i Colon Cancer Cells

fluorescein-mærket AA005 (AA005-influenza, figur 3A) var held afsluttet af en vurdering-aided protokol biologisk aktivitet efter at have undersøgt en række potentielle afledte positioner parallelt [36]. AA005-influenza viste sig at udvise lignende celle selektivitet til sin forældrenes molekyle, og ophobes i mitokondrierne af hepatisk cancer, men ikke normale celler [36]. Ved at bruge immunofluorescens konfokal mikroskopi analyse, viste vi, at AA005-influenza kunne co-lokalisere med mitokondrier i HT29, HCT116 og LoVo celler (figur 3B). Imidlertid AA005-influenza signalet var meget svag i mitokondrier af HBEpiC eller 293T-celler (figur 3B). Mens AA005-influenza inhiberede proliferation af LOVO, HT29 og HCT116-celler på en dosis-afhængig måde, dets cytotoksiske virkning på HBEpiC var svag (figur 3C). Desuden er vi rapporterede, at AA005 kan øge rhodamin 123-negative fraktioner i HT29 og LOVO men ikke HBEpiC celler (Figur 3D). Disse resultater antyder, AA005 kan målrette mitokondrielle molekyler og dermed forstyrre energisk pathway af kræftceller.

(A) Kemisk struktur af AA005-fluorescein. (B) Den intracellulære lokalisering af AA005. Cellerne blev co-inkuberet med AA005-influenza ved 100 nM i 12 timer, og analyseret ved konfokal mikroskopi ved hjælp af en mitotracker (rød) til at imødegå-pletten mitokondrier. (C) MTT-analyse af LOVO, HT29, HCT116 og HBEpiC celler efter AA005-influenza ved angivne koncentrationer i 48 timer. (D) AA005 nedsætter mitokondrielle transmembranpotentiale for tyktarmskræft celler afsløret af stigning i rhodamin 123-negative celler. Cellerne blev behandlet med AA005 ved angivne koncentration i 24 timer og analyseret ved rhodamin 123-farvning og flowcytometri. (E) Cellerne blev behandlet med eller uden AA005 ved angivne koncentration i 24 timer blev NAD

+ /NADH-forhold måles med et AmpliteTM Kolorimetrisk NAD /NADH Assay Kit. (F) Cellerne blev behandlet med eller uden AA005 ved angivne koncentration i 24 timer, og ATP indhold blev målt under anvendelse en ATP bioluminscensassayet Kit. (G) Cellerne blev behandlet med AA005 ved angivne koncentration og tidspunkter, lyseret, og Western blot-analyse blev udført under anvendelse viste antistoffer.

Mitokondrier målretning midler (mitocans) er tilbøjelige til at forstyrre oxidation phosphorylering pathway og reducere NAD

+ /NADH-forhold, hvilket resulterer i inhibering af ATP-produktion og aktivering af AMPK der reflekteres ved phosphorylering og inaktivering af acetyl-CoA-carboxylase (ACC) (Ser79), som er en indikator for AMPK aktivitet [37]. Vi testede virkningen af ​​AA005 på cellulær NAD

+ /NADH-forholdet og ATP indhold, og fandt, at i HT29 og LoVo celler, behandling med AA005 på 50 til 200 nM i 24 timer reducerede NAD

+ /NADH-forholdet ( Figur 3E) og forarmet ATP i en dosisafhængig måde (figur 3F), mens interessant, AA005 kunne ikke signifikant nedsætter NAD

+ /NADH-forholdet og ATP-indhold i HBEpiC celler (figur 3E og F). Endvidere AA005 markant opreguleret p-AMPK og p-ACC på en dosis- og tidsafhængig måde (Figur 3G). Imidlertid blev disse fænomener ikke observeret i HBEpiC celler (figur 3G).

Vi viste, at AA005 samt mitocans AICAR og rotenon forårsaget ATP depletion i HT29 og LoVo-celler, mens AMPK inhibitorer forbindelse C og inosin svækket denne effekt (figur 4A). AA005, AICAR og rotenon opreguleret p-AMPK og p-ACC, mens forbindelse C og inosin reduceret AA005-udløst opregulering af de to molekyler (figur 4B). Derudover mens AA005 inhiberede proliferation af HT29 og LoVo celler, forbindelse C og inosin reducerede denne virkning (figur 4C). Disse resultater antyder, at AMPK aktivering kræves for AA005-induceret cytotoksicitet til colon cancerceller.

(A) De angivne celler blev behandlet alene eller kombinatoriske med AA005 (100 nM), AICAR (AA, 1 mM), retenone (1 uM), forbindelse C (CC, 10 uM), eller inosin (20 mM) i 24 timer, og ATP indhold blev målt. (B) HT29 og LoVo-celler blev behandlet med angivne protokol, lyseret, og Western blotting blev udført under anvendelse viste antistoffer. (C) HT29 og LoVo-celler blev behandlet med forskellige behandlingsregimer i 48 timer, og cellelevedygtighed blev detekteret ved MTT-assayet.

AMPK Activation medierer AA005-induceret mTOR Complex 1 (mTORC1) Inhibering in vitro

Aktiveret AMPK phosphorylerer TSC2 ved Thr-1227 og Ser-1345 og øger aktiviteten af ​​TSC1-TSC2 kompleks til at inhibere mTOR [12]. Vi testede effekten af ​​AA005 på mTORC1, og rapporterede, at AA005 faldt p-mTOR og p-S6K (p85 og p70 S6K) i LOVO og HT29 men ikke HBEpiC celler (figur 3G). AICAR og rotenon også nedreguleret p-mTOR i HT29 og LoVo-celler (figur 4B). Imidlertid AA005-induceret p-mTOR nedregulering delvis kunne undertrykkes af inosin og forbindelse C (figur 4B). Forbindelse C og inosin også delvist svækket cyclin D1 nedregulering forårsaget af AA005 (figur 4B).

AMPK /mTOR signalering er involveret i AA005 induceret Autophagy in vitro

AMPK aktivering kan fremkalde autofagi via inhibering af mTOR (49). Vi testede, om AA005 kunne fremkalde autofagi i kolon kræftceller eller ikke ved at detektere ændringerne i cytosoliske formular (LC3-I) og lipideret formular (LC3-II) i autophagy markør LC3. Interessant fandt vi, at AA005 induceret akkumulering af LC3-II i LoVo-celler på en tids- og dosisafhængig måde (figur 5A). Den pQCXIP-GFP-LC3 plasmid blev transficeret i LoVo-celler, som derefter blev behandlet med AA005 ved 100 nM i 24 timer, efterfulgt af konfokal mikroskopi vurdering. Vi viste, at mens kontrolceller udviste en diffus farvning, LoVo celler efter AA005 eller mTOR inhibitor rapamycin (100 nM) udviste en plettet fluorescerende farvningsmønster, der angiver omfordeling af LC3 til autophagosomes (figur 5B). Interessant, inosin svækket AA005-forårsagede dannelse af LC3 autophagosomes (figur 5B) og akkumulering af LC3-II (figur 5C). Disse resultater indikerer, at AA005 inducerer autophagy af colon cancerceller via AMPK /mTOR-signalvejen. Men behandling med AA005 på 50-200 nM i 24 timer eller 100 nM for 12-48 timer ikke resultere i udtalt apoptose af LoVo-celler, hvilket afspejles i Annexin V /PI-farvning og flowcytometri vurdering (figur 5D) eller Western blot-analyse for spaltning af PARP, et substrat af aktiveret casp-3 (figur 5E).

(a) Immunoblotanalyse af LC3-i og LC3-II niveauerne i LoVo celler behandlet med AA005. (B) LoVo celler transficeret med pQCXIP-GFP eller pQCXIP-GFP-LC3 plasmid blev behandlet i 24 timer med AA005 (100 nM) og /eller inosin (20 mM), og rapamycin (100 nM), og vurderet ved immunofluorescens-analyser. (C) LoVo-celler blev behandlet med angivne protokoller, lyseret, og Western blot-assay blev udført under anvendelse viste antistoffer. (D) LoVo-celler blev behandlet med AA005 eller cisplatin (20 uM) i 24 timer, eller AA005 ved 100 nM for angivne tidspunkter. Cellerne blev derefter analyseret ved Annexin V /PI-farvning og flowcytometri. (E) Western blot analyser af lysater af LoVo celler behandlet med AA005 eller cisplatin (20 pM til 24 timer).

AA005 synergistisk med 2-deoxyglucose og cisplatin hæmme Colon Cancer Cell Proliferation af Ændring af AMPK og mTOR

2-deoxyglucose (2-DG) er en syntetisk glukose analog stand til at hæmme glykolyse og ATP produktion [38]. Vi testede den kombinerede effekt af AA005 og 2-DG i LoVo celler, og fandt, at kombineret anvendelse af de to midler, der udøves synergisme i inhibering af celleproliferation (figur 6A og B) og undertrykkelse af ATP generation (figur 6C). AA005 i kombination med 2-DG førte til øget opregulering af p-AMPK og p-ACC og nedregulering af p-mTOR og CDK4 (fig 6D). Salg

(a, b) LoVo-celler blev behandlet indiceret protokoller i 48 timer, analyseret ved MTT-assay (A), og de kombinerede virkninger blev evalueret af Chou-Talay fremgangsmåde og CalcuSyn software (B). Kombinationspartnerne indekser (CI) mindre end, lig med og større end 1 indikerer synergistiske, additive, og antagonistiske virkninger, hhv. (C) LoVo celler blev behandlet med 50 nM AA005 eller /og 5 mM 2-DG i 24 timer, og ATP indhold blev vurderet som beskrevet ovenfor. (D) Western blot-analyser af lysater af LoVo celler behandlet med AA005 eller /og 2-DG ved hjælp viste antistoffer. (E, F) LoVo-celler blev behandlet anførte protokoller i 48 timer, analyseret ved MTT-assay (E), og de kombinerede virkninger blev evalueret af Chou-Talay fremgangsmåde og CalcuSyn software (F). (G) Western blot-analyser af lysater af LoVo celler behandlet med AA005 eller /og cisplatin hjælp viste antistoffer. (H) LoVo-celler blev behandlet med AA005 og /eller cisplatin, og analyseret ved Annexin V /PI-farvning og flowcytometri. (I) Cellerne blev behandlet med AA005 og /eller cisplatin i 24 timer, og ATP indhold blev målt under anvendelse en ATP bioluminscensassayet Kit. (J) LoVo-celler blev behandlet med AA005 og /eller cisplatin i 24 timer, og cellecyklus blev bestemt ved flowcytometri.

kemoterapeutisk middel cisplatin kan opregulere mTOR overlevelse pathway som giver drug-resistens til kræft celler [39]. Vi viste, at mens AA005 og cisplatin forårsagede synergistisk hæmmende virkning på LOVO celleproliferation (figur 6E og F), nedsat AA005 cisplatin-udløst opregulering af mTOR og S6K (figur 6G). Kombineret anvendelse af AA005 og cisplatin førte til forøget apoptotisk virkning på LoVo-celler, der reflekteres af Annexin V /PI-farvning og flowcytometri vurdering (figur 6H) eller Western blot-analyse af spaltning af PARP (Figur 6G). Men kombinationen af ​​disse to midler ikke forårsage synergi i depletering af ATP-indhold (fig 6I), cellecyklusstop (fig 6J) eller autofagi (reflekteret af udtrykket LC3-II, fig 6G) i LoVo celler.

diskussion

Annonaceous acetogenins repræsenterer en serie af C-35 /C-37 naturlige produkter med hydroxyleret THF og γ-lacton ringe strukturer [25], [26], [28]. Mange medlemmer af denne familie display cytotoksiske aktivitet efter perturbation af terminalen elektronoverførsel trin i kompleks I i mitochondrier [40]. AA005 er et mimetikum af annonaceous acetogenin hvor både THF ringene er erstattet med et ethylenglycol ether enhed. AA005 bevarer de væsentlige funktioner i de naturlige acetogenins og viser mere kraftig biologisk aktivitet [41]. I denne undersøgelse rapporterer vi, at AA005 er i stand til at aktivere AMPK og inhiberer mTOR, standser derfor cellecyklussen på G1-fasen og inducerer autophagy af colon cancerceller. AA005 synergier med glykolyse inhibitor 2-DG for markant ATP generation blokade, og antagoniserer cisplatin-induceret opregulering af p-mTOR, hvilket fører til øget spredning hæmning og apoptose induktion i tyktarmen kræftceller. Disse resultater indikerer, at AA005 bærer terapeutiske potentialer i det mindste i denne form for ondartet svulst

Målretning kræft cellens stofskifte, især glykolyse hæmning, har vist sig som en ny lovende strategi for bekæmpelse af kræft [42] -. [44]. Mitokondrier ikke kun administrere energiproduktion via citronsyre cyklus (tricarboxylsyre cyklus, TCA cyklus), men også spille en central rolle i apoptose regulering gennem frigivelse af cytochrom C. Selv om der har meget debat om, hvorvidt mitokondrier har defekter i oxidativ fosforylering vej, det kunne være et potentielt mål for cancerterapi [42], [45]. Nogle mitocans såsom metaformin og vitamin E analoger, som inhiberer kompleks I og II viser effektiv og selektiv anticanceraktivitet. Disse midler inducerer celledød gennem generering af superoxid og mitokondriel destabilisering [46]. ATP kunne også være udtømt i nogen grad af behandling af mitocans [42], [45]. Mitokondrier komplekse Jeg har vist sig at være rettet mod annonaceous acetogenin [40]. Vi rapporterer, at AA005 kan co-lokalisere med mitokondrier i tyktarmskræft, men ikke HBEpiC eller 293T-celler (figur 3A), hvilket tyder på, at AA005 kan reducere NAD

+ /NADH-forholdet og ATP produktion i kræftceller. Denne mulighed bekræftes i LOVO, HT29 og HCT116 celler (figur 3C). Men hvorfor mitokondrier i kræftceller er mere tilbøjelige til at blive ramt af AA005 er et åbent spørgsmål. Inhibering af mitokondrier ved metaformin og rotenon kan føre til aktivering af AMPK [42]. Vi viser, at AA005 også kan undertrykke mitokondrier og aktivere AMPK (figur 3).