PLoS ONE: fedtsyresyntase er et vigtigt target i flere Essential Tumor funktioner prostatakræft: Optagelse af radioaktivt mærket Acetat som Predictor af målrettet terapi Outcome

Abstrakt

fedtsyresyntase (FASN) udtryk er forhøjet i flere kræftformer, og dette over-ekspression er associeret med dårlig prognose. Inhibitorer af FASN, såsom orlistat, angiveligt viser antitumorvirkninger mod cancerformer, som overudtrykker FASN, hvilket gør FASN et lovende terapeutisk mål. Men store variationer i FASN ekspressionsniveauerne i de enkelte tumorer er blevet observeret, og metoder til at forudsige FASN målrettet terapi resultat før behandling er forpligtet til at undgå unødvendig behandling. Desuden hvordan FASN inhibering påvirker tumorprogression fortsat uklar. Her viste vi den metode til at forudsige FASN målrettet terapi udfald ved hjælp af radioaktivt mærket acetat optagelse og præsenteret mekanismer FASN hæmning med human prostata cancer cellelinjer, at give behandlingen strategi FASN målrettet terapi. Vi viste, at tumor optagelse af radioaktivt mærket acetat afspejlede de FASN ekspressionsniveauerne og følsomhed over for FASN målrettet terapi med orlistat

in vitro

in vivo

. FASN målrettet behandling var mærkbart effektiv mod tumorer med høj FASN udtryk, som er blevet identificeret af høj acetat optagelse. For at undersøge mekanismer, vi etableret FASN knockdown prostata kræftceller ved transduktion af korte hårnål RNA mod FASN og undersøgt karakteristika ved analyser af morfologi og celle adfærd og microarray-baserede genekspression profilering. FASN hæmning ikke kun undertrykt celledeling, men forhindrede pseudopodia dannelse og undertrykt celleadhæsion, migration og invasion. FASN inhibering også undertrykt gener involveret i produktion af intracellulære second messenger arachidonsyre og androgen hormoner, som begge fremmer tumorprogression. Kollektivt, vores data viste, at optagelse af radioaktivt mærket acetat er en nyttig indikator for FASN målrettet terapi resultat. Dette antyder, at [1-

11C] acetat positronemissionstomografi (PET) kunne være et effektivt redskab til at opnå personlig FASN målrettet terapi af ikke-invasiv visualisering af tumor acetat optagelse og udvælgelse af responsive tumorer. FASN målrettet terapi kunne være en effektiv behandling til at undertrykke flere trin relateret til tumor progression i prostatakræft udvalgt af [1-

11C] acetat PET

Henvisning:. Yoshii Y, Furukawa T, Oyama N, Hasegawa Y, Kiyono Y, Nishii R, et al. (2013) fedtsyresyntase er et vigtigt target i flere Essential Tumor funktioner prostatakræft: Optagelse af radioaktivt mærket Acetat som Predictor af målrettet terapi Outcome. PLoS ONE 8 (5): e64570. doi: 10,1371 /journal.pone.0064570

Redaktør: Juri G. Gelovani, Wayne State University, USA

Modtaget: Februar 3, 2013; Accepteret: April 15, 2013; Udgivet: 31. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Yoshii et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud-in-Aid for Unge Forskere (B) fra Japan Society for fremme af videnskab, Japan (JSP’er) (til YY). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

fedtsyresyntase (FASN) er et nøgleenzym i fedtsyresyntese fra acetyl-CoA, der udtrykkes i høje niveauer i lever og fedtvæv, men ved lave niveauer i andre væv hos mennesker [1]. FASN er overudtrykt i flere humane cancere, herunder prostata, bryst, lunge, æggestok, blære, mave, mundhulen og melanom, og overekspression er associeret med dårlig prognose [2], [3]. FASN har vist sig at spille en vigtig rolle i carcinogenese ved at beskytte celler fra apoptose [2].

I de senere år inhibitorer af FASN sigende viser antitumoraktivitet [4]. Orlistat, en selektiv hæmmer af FASN, er en af ​​dem, klar til klinisk brug, især fordi orlistat allerede anvendes som en over-the-counter narkotika for fedme i USA og EU. Orlistat er rapporteret at udøve antitumoraktivitet ved at inducere apoptose i tumorceller [3], [5]. Således forventes FASN målrettet terapi til at være effektiv mod FASN-udtrykkende tumorer. Imidlertid har store variationer i FASN ekspressionsniveauer i individuelle tumorer blevet observeret af patologiske undersøgelser [2], [6]. Derfor, når overvejer anvendelse af FASN målrettet terapi, metoder til at forudsige terapeutisk resultat i individuelle tumorer før behandlingen er nødvendig for at reducere unødvendig behandling.

For at nærme sig dette krav, vi fokuseret på optagelse af radioaktivt mærket acetat i tumorceller. Vi har tidligere rapporteret optagelsesmekanisme af radioaktivt mærket acetat i tumorceller; cytosolisk acetyl-CoA-synthetase, som omdanner acetat til acetyl-CoA, er overudtrykt i tumorceller og spiller en rolle i inkorporering af radioaktivt mærket acetat og acetatet inkorporeret i tumorceller benyttes hovedsageligt til fedtsyresyntese stedet nedbrydes til CO

2 via tricarboxylsyre cyklus eller aminosyresyntese [7], [8]. Endvidere Yun et al. 2009 er også vist, at acetyl-CoA-synthetase er vigtig i [1-

11C] acetat optagelse og forbundet med acetat-afhængig fedtsyresyntese [9]. Disse beviser, at acetat optagelse medieres af acetyl-CoA-synthetase er forbundet med fedtsyresyntese i tumorer. Faktisk er det blevet rapporteret, at inhibitorer af FASN, herunder orlistat, kan reducere radioaktivt mærket acetat inkorporering i fedtsyrer i prostatacancerceller [5], [10]. Vāvere et al. har vist, at radioaktivt mærket acetat optagelsen er korreleret med FASN udtryk og [1-

11C] acetat positronemissionstomografi (PET), som kan non-invasivt visualisere optagelse af acetat, er et nyttigt værktøj til at undersøge FASN ekspressionsniveauer i xenograft af prostata cancercellelinier [10]. Disse undersøgelser indikerer, at radioaktivt mærket acetat optagelse er en god surrogatmarkør for FASN ekspression i tumorer. Derfor kan radioaktivt mærket acetat optagelse være en god indikator for FASN målrettet terapi resultat; dog er det fortsat uklart, om resultatet af FASN målrettet terapi kan forudsiges ved optagelse af radioaktivt mærket acetat. I denne undersøgelse, vi undersøgt, om radioaktivt mærket acetat optagelse kan forudsige terapeutisk resultat af FASN målrettet behandling med humane prostata cancer cellelinjer at demonstrere anvendeligheden af ​​[1-

11C] acetat PET som en indikator for FASN målrettet terapi resultat. Hidtil i kliniske undersøgelser, [1-

11C] acetat PET er blevet anvendt til evaluering af forskellige typer af ondartet svulst [11] – [14]; dermed hvis forholdet mellem radioaktivt mærket acetat optagelse og FASN målrettet terapi resultat er bevist, [1-

11C] acetat PET kunne straks anvendes til at forudsige FASN målrettet terapi resultat.

Derudover de mekanismer, hvordan FASN hæmning påvirker tumorprogression er endnu ikke tilstrækkeligt behandlet og dermed belysning af mekanismerne er forpligtet til at forstå betydningen af ​​FASN hæmning og tilskynde udnyttelse af FASN målrettet terapi. I denne undersøgelse at undersøge mekanismerne, vi etableret FASN knockdown prostatacancerceller ved transduktion af korte hårnål RNA (shRNA) mod FASN, som kan inducere genspecifik nedregulering, og undersøgte egenskaberne ved analyser på morfologi og celle adfærd og microarray- baseret genekspressionsprofilering. Gennem disse studier, diskuterede vi den nye behandlingsstrategi af FASN målrettet terapi i prostatakræft.

Materialer og Metoder

Cell Dyrkning

Humane prostatakræft-cellelinier, LNCaP ( CRL-1740), PC3 (CRL-1435), 22Rv1 (CRL-2505), og DU145 (HTB-81) blev opnået fra American Type Culture Collection. Celler blev inkuberet i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 i luft ved 37 ° C. RPMI 1640-medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum og antibiotika blev anvendt til vækstmediet. Eksponentielt voksende celler blev anvendt til eksperimenter. Celler blev trypsinbehandlet, og antallet af levedygtige celler blev talt under anvendelse af trypanblåt metode farvestof-udelukkelse.

celleoptagelse Undersøgelse af [1-

14C] acetat

In Vitro

Cell optagelse af [1-

14C] acetat i LNCaP, PC3, 22Rv1, og DU145 celler blev undersøgt. Celler blev podet ved 1 x 10

5 i 1 ml vækstmedium per brønd i 24-brønds plader og præinkuberet i 24 timer før optagelse undersøgelse. Efter præinkubation blev mediet fjernet og 500 pi vækstmedium indeholdende 37 kBq af [1-

14C] acetat (2,07 GBq /mmol) (GE Healthcare, Pollards, UK) blev tilsat til hver brønd, og cellerne blev inkuberet i 1 time ved 37 ° C. Medium blev derefter fjernet, og cellerne blev vasket to gange med iskold PBS. De resulterende celler blev lyseret med 500 pi 0,2 N NaOH i 2 timer ved stuetemperatur, og radioaktiviteten af ​​lysatet og væskescintillator (ACSII; GE Healthcare) blanding blev målt med et Tri-Carb væskescintillationstæller (PerkinElmer, Wallac, Turku, Finland). Celler behandlet på samme måde før cellelyse blev talt under anvendelse af trypanblåt metode farvestof-udelukkelse.

Western blot-analyse

FASN ekspressionsniveauer blev undersøgt ved western blot-analyse. Prøver blev lyseret med lysepuffer indeholdende protease inhibitor cocktail (Sigma, St. Louis, MO, USA) og proteinkoncentrationer blev bestemt ved Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). SDS-polyacrylamidgelelektroforese blev udført med 20 ug protein i hver prøve under anvendelse af 4% -15% mini-Protean TGX færdigstøbte geler (Bio-Rad). Kanin-anti-FASN primære antistof (sc-20140; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), kanin-anti-β-actin primært antistof (IMG-5142A; IMGENEX, San Diego, CA, USA), og gede-anti- kanin-IgG sekundært antistof (G21234; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) blev anvendt. Bånd blev påvist med ECL Plus vestlige Blotting Detection System (GE Healthcare) og intensitet blev beregnet ved densitometri hjælp Billede J software (National Institutes of Health).

Cell levedygtighed efter Orlistat Behandling

Effect af orlistat behandling

in vitro

blev undersøgt med LNCaP, PC3, 22Rv1, og DU145 celler. Celler blev podet ved 1 x 10

4 i 100 pi vækstmedium per brønd i 96-brønds plader. Efter præinkubation i 24 timer blev mediet erstattet med vækstmedium indeholdende 0 pM, 12,5 pM, 25 pM, 50 pM, 250 pM eller 500 uM orlistat (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). Koncentrationen af ​​orlistat blev besluttet baseret på de tidligere undersøgelser [3], [5]. Orlistat blev opløst i ethanol og sat i vækstmediet at indeholde mindre end 0,02% ethanol ved endelig. Efter 48 h inkubation med medium indeholdende orlistat blev cellelevedygtigheden analyseret ved CellTiter-Glo levedygtighed luminescerende celleassay (Promega, Fitchburg, WI, USA) ifølge producentens protokol. CellTiter-Glo-reagens blev tilsat direkte til dyrkningsbrønde, og inkuberet i 10 minutter med omrystning. Luminescens blev optaget med en plade-læser (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Under 48-timers inkubation med orlistat, blev mediet genopfrisket ved 24 timer efter start af behandlingen.

Implantation af Xenografter i mus

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i guide for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af det nationale institut for radiologiske videnskaber (Japan). Protokollen blev godkendt af Animal Ethics Committee for National Institute of radiologiske videnskaber (Japan) (Tilladelse nummer: M40-01). NOD.CB17-Prkdc scid /J-hanmus (4 uger gamle) blev opnået fra Charles River Laboratories (Yokohama, Japan). Før forsøgene blev musene holdt uforstyrret i mindst 1 uge. For

in vivo

studier, vi brugte tre repræsentative cellelinier i form af FASN udtryk; LNCaP (høj FASN ekspression), PC3 (lav FASN ekspression), eller DU145 (meget lav FASN ekspression). Til opnåelse xenograftmodeller, tumorceller på 3 × 10

7 for LNCaP og 1 x 10

7 for PC3 og DU145 blev subkutant injiceret i mus højre skulder med matrigel (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA).

In Vivo

biodistribution

for biofordeling undersøgelse blev mus med xenotransplantattumorer intravenøst ​​injiceret med 37 kBq [1-

14C] acetat i 100 ul saltvand ind halevenen og blev aflivet ved 10 min eller 30 min efter injektion (4 mus pr gruppe). Organer af interesse (tumor, muskel, lunge, lever, milt, pancreas, nyre og prostata) og blod blev opsamlet, og vægten af ​​hvert organ blev målt. Organer blev fordøjet i 1 ml Soluene 350 (PerkinElmer) ved 50 ° C i 2 timer. Portioner af hydrogenperoxid (30% vægt /volumen), 2 x 100 pi, blev tilsat sekventielt til prøverne at blege. Scintillation medium (Hionic-Fluor, PerkinElmer) blev tilsat før tælling af radioaktiviteten i en Tri-Carb væskescintillationstæller (PerkinElmer). Biofordeling data blev beregnet som% ID /g (middel ± SD).

Små-Animal PET Imaging med [1-

11C] acetat

For at bekræfte biodistributionen af ​​optagelsen af ​​radioaktivt mærket acetat i xenograftmodeller, blev små-dyr PET billeddannelse med [1-

11C] acetat udføres. [1-

11C] acetat blev syntetiseret som tidligere beskrevet [15]. Radiokemiske renhed var 99%. Dynamiske PET scanninger af 60-min varighed (12 × 5 min) blev udført under anvendelse af et lille dyr PET-system (Inveon, Siemens Medical Solutions, Malvern, PA, USA). Hver mus blev intravenøst ​​injiceret med ca. 18,5 MBq [1-

11C] acetat via halevenen under 1,5% isofluran anæstesi. Kropstemperaturen blev opretholdt ved en lampe og varmepumpe under scanningen. Billederne blev rekonstrueret ved hjælp af en 3D-maksimum efterfølgende hjælp Inveon Acquisition Arbejdsplads software (Siemens Medical Solutions).

In vivo

Orlistat Behandling

Terapeutiske virkninger af orlistat blev også undersøgt med tumor xenograft-mus. Mus med veletablerede tumorer (0,6-0,9 cm længste diameter) blev randomiseret til orlistat behandlings- og kontrolgrupper (5 dyr /gruppe). Orlistat (240 mg /kg /dag) injiceret i.p. dagligt i 2 uger. Dosis behandling blev bestemt baseret på tidligere undersøgelser [3], [5]. Orlistat blev opløst i 33 pi ethanol og fortyndet med 66 pi saltvand lige før injektion. Som kontrol blev den tilsvarende mængde køretøj indsprøjtet på samme måde. Mus blev vejet, og tumorstørrelser blev målt under anvendelse Præcisionsskydelærer 3 gange ugentligt. Tumor volumen blev beregnet ved hjælp af ligningen: tumor volumen = længde × bredde

2 × π /6

RNA-interferens (RNAi) Eksperimenter

I denne undersøgelse at undersøge nøjagtige mekanismer hvordan. FASN hæmning påvirker tumorprogression vedtog vi FASN knockdown LNCaP celler oprettet ved transduktion af shRNA mod FASN, som kan bringe en stabil langsigtet gen-specifikke lyddæmpning [16]. FASN knockdown LNCaP celler blev oprettet ved transduktion af Mission lentiviral transduktion partikler (SHCLNV-NM 00410, Sigma) bærer ekspressionskassetter koder shRNAs der genererer små-forstyrrende RNA, mod FASN ifølge producentens protokol. Fem kloner af shRNAs mod FASN (TRCN3125, 3126, 3127, 3128, og 3129) blev anvendt og cellelinjer transficeret med hver shRNA blev etableret (betegnet FASN-RNAi 3125, 3126, 3127, 3128. og 3129 celler, henholdsvis). Ikke-targeting shRNA (SHC002V, Sigma) blev anvendt som negativ kontrol (kontrol-RNAi celler). Celler (1 x 10

4) blev udpladet i 100 pi vækstmedium per brønd på plader med 96 brønde og inkuberet natten over. Mediet blev derefter ændret til vækstmedium indeholdende hexadimethrinbromid (Sigma) i en endelig koncentration på 8 pg /ml, der kan forbedre transduktionseffektivitet. Lentivirale partikler (5-50 pi, 0,5-5 infektionsmultiplicitet) blev tilsat, og pladerne blev inkuberet natten over. Derefter valgte vi stabile transduktanter udtrykker shRNAs med puromycin. Ekspressionsniveauer af FASN mRNA blev undersøgt ved QRT-PCR for at kontrollere effektiviteten af ​​knockdown. For QRT-PCR, cellelyse, RNA-isolering, revers transkription, og real-time PCR blev udført under anvendelse af TaqMan Gene Expression Celler-til-CT kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i overensstemmelse med producentens protokol. Genekspression blev analyseret under anvendelse TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) for β-actin (Hs99999903) og FASN (Hs00188012) med StepOne realtids-PCR Systems (Applied Biosystems). FASN mRNA blev kvantificeret ved den sammenlignende

metode C T hjælp β-actin udtryk som en endogen kontrol [17].

Cell Proliferation, morfologi, migration og invasion

Cell adfærd var undersøgt med FASN-RNAi 3128 og 3129 og kontrol-RNAi LNCaP celler. For celleproliferationsassay blev celler podet på plader med 96 brønde ved 5 x 10

3 celler /100 pi vækstmedium. Efter tidsforløbet inkubering blev celleproliferation bestemt ved CellTiter-Glo luminescerende assays. Cellemorfologi blev observeret under anvendelse af et omvendt mikroskop (MDI 4000B, Leica, Solms, Tyskland). Time-lapse billeder blev erhvervet hver 2 timer ved 10 × forstørrelse i 5 dage ved hjælp af et motoriseret omvendt mikroskop (IX 81; Olympus, Tokyo, Japan) udstyret med en scene top inkubator (Tokai Hit, Fujinomiya, Japan) og data blev analyseret med FluoView software (Olympus). For migration og invasion assays, CytoSelect 96 brønde cellemigration og invasion-assays (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA) blev anvendt ifølge producentens protokol. Celler ved 4 × 10

4 celler /100 pi i serumfrie medier blev anbragt i den øverste brønd og 150 pi medium indeholdende 10% føtalt bovint serum blev anbragt i bunden godt, og cellerne fik lov til at migrere eller invadere i 24 timer inden analyse. Top (ikke-migrerende eller ikke-invaderende celler) blev fjernet, bunden (flytter eller invaderende) celler blev farvet med farveopløsning og fluorescens blev registreret ved anvendelse af en pladelæser ved 480 nm /520 nm.

DNA microarray analyse

Genekspression profilering blev undersøgt ved DNA microarray analyse med FASN-RNAi 3128 og kontrol-RNAi LNCaP celler. Totale RNA’er blev isoleret fra celler med en Micro-til-Midi total RNA rensning system (Invitrogen). Integriteten af ​​totale RNA’er blev evalueret under anvendelse af en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Lavt input Quick Amp Labeling Kit, ensfarvet (Agilent Technologies) blev anvendt til fremstilling Cy3-mærkede mål cRNA ifølge producentens anvisninger. Mærkede cRNA’er blev hybridiseret med en SurePrint G3 human GE 8 × 60K Microarrays (Agilent Technologies). To separate hybridiseringer blev udført for hver prøve. Array billeder blev taget med et mikromatrice Scanner (Agilent Technologies), og data blev analyseret ved hjælp af Feature Extraction Software (Agilent Technologies) for at opnå baggrund korrigeret signalintensiteter. Data blev yderligere analyseret med GeneSpring GX Software (Version 11.0, Agilent Technologies). Efter filtrering af data, mRNA’er differentielt udtrykt i målceller i forhold til kontroller blev bedømt ved Fishers eksakte test, efterfulgt af flere korrektioner ved hjælp af den falske opdagelse sats (FDR) -metoden Benjamini og Hochberg. Gene sæt med en FDR

q

-værdi 0,05 blev anset for at være betydelig. DNA microarray data findes i Gene Expression Omnibus database under accession nummer (GSE39183).

Statistical Analysis

Data er udtrykt som middelværdi ± SD.

P

værdier blev beregnet ved variansanalyse (ANOVA) til sammenligning mellem flere behandlingsgrupper. Statistisk analyse af tumorvolumener blev udført ved gentagne ANOVA efterfulgt af post-hoc Tukey test.

P

værdier. 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

In Vitro

Studies

Vi undersøgte relationer mellem optagelse af radioaktivt mærket acetat, FASN udtryk, og følsomhed over for orlistat behandling

in vitro

med LNCaP, PC3, 22Rv1, og DU145 cellelinjer (fig. 1). [1-

14C] acetat optagelse efter 1 time er vist i fig. 1A, øvre. Høj optagelse af [1-

14C] acetat blev observeret i LNCaP-celler, mens der i PC3 og 22Rv1 var lavere, og at der i DU145 var meget lav (

P

0,05). FASN ekspression viste en tendens supplere den observeret i optagelse af [1-

14C] acetat (figur 1A, lavere.): Viste LNCaP-celler højere FASN ekspression sammenlignet med de andre cellelinier (

P

0,05) (fig. 1C, øvre).

(A) Optagelse af [1-

14C] acetat (øvre) og niveauerne af FASN udtryk (lavere) i LNCaP, PC3, 22Rv1, og DU145 celler. De grupper med forskellige alfabeter er signifikant forskellige (

P

0,05). (B) Procent cellelevedygtighed efter orlistat behandling i LNCaP, PC3, 22Rv1, og DU145 celler. Cellelevedygtighed angivet som en procentdel af det med 0 pM orlistat behandling. Stjerner angiver statistisk signifikans versus behandling med 0 pM for hver cellelinje (*

P

0,05). (C) Forholdet mellem optagelse af [1-

14C] acetat og FASN udtryk (øvre), forholdet mellem% cellelevedygtighed efter orlistat behandling på 12,5 uM og optagelse af [1-

14C] acetat (midten), og forholdet mellem levedygtighed% celle efter orlistat behandling på 12,5 uM og FASN udtryk (lavere). Værdier fra seks uafhængige forsøg er vist. Data er udtrykt som middelværdi ± SD.

Fig. 1B viser levedygtigheden% celle efter orlistat behandling

in vitro

. Under lav dosis af orlistat behandling på 12,5 uM, LNCaP celler, som havde vist den højeste optagelse af [1-

14C] acetat og FASN udtryk, viste et signifikant fald i% cellelevedygtighed (

P

0,05;

R

2

= 0,97,

P

0,05), under lav-dosis orlistat behandling på 12,5 pM (fig 1C, midterste og nederste).. Betragtninger, var der ingen signifikant korrelation mellem% cellelevedygtighed, og optagelse af [1-

14C] acetat og FASN udtryk, henholdsvis under højdosis orlistat behandling. Disse data viste højere følsomhed over for orlistat behandling i cellerne med højere FASN udtryk og optagelse af acetat.

Biodistribution og [1-

11C] Acetat PET Undersøgelse med Tumor-bærende mus

For

in vivo

studier, vi brugte mus med LNCaP (høj FASN udtryk), PC3 (lav FASN udtryk), eller DU145 (meget lav FASN udtryk) tumorer. Niveauer af FASN ekspression af hver tumor xenograft blev bekræftet før forsøget, hvilket viste lignende tendens til

in vitro

studie (fig. S1). For det første at undersøge absolutte optagelse af radioaktivt mærket acetat i disse xenotransplantattumorer, udførte vi biodistribution undersøgelse. Biodistributionsdata blev opnået ved 10 min og 30 min efter injektion af [1-

14C] acetat (fig. 2A). Tidspunkter for prøveudtagning blev besluttet på grundlag af en tidligere undersøgelse [10]. Biodistribution i blodet og normale organer viste et lignende mønster som i tidligere rapporter [18]. [1-

14C] acetat fra blodet ved 30 minutter, sammenlignet med 10 min (fig. 2A, til venstre). Ved 30 min, LNCaP tumorer (0,27 ± 0,05% ID /g) viste 2,2 gange højere optag af [1-

14C] acetat end PC3 tumorer (0,13 ± 0,01% ID /g;

P

0,01) og 5,5 gange højere optagelse end DU145 tumorer (0,06 ± 0,01% ID /g;

P

. 0,001) (figur 2A, højre). Tumor-til-blod og tumor-til-muskel-forhold på 30 min var også højere i LNCaP-tumorer sammenlignet med de PC3 og DU145-tumorer (fig. S2). Dernæst lille dyr PET med [1-

11C] acetat blev udført for at bekræfte og supplere resultaterne af biodistribution undersøgelse. Som billeder demonstreret, viste [1-

11C] acetat klar tumor akkumulering i LNCaP xenograft model, mens der blev observeret moderat eller lav akkumulering af [1-

11C] acetat i PC3 og DU145 xenograft model (fig. 2B ). Derfor biodistribution og [1-

11C] acetat PET studier viste, at optagelsen af ​​radioaktivt mærket acetat afspejler FASN ekspressionsniveauerne og kan skelne tumorer med høj FASN udtryk fra tumorer med lav FASN udtryk.

(A) Biofordeling ved 10 min og 30 min i organer (venstre) og hver tumor (til højre). Data repræsenterer% ID /g, udtrykt som middelværdi ± SD. De grupper med forskellige alfabeter er signifikant forskellige (

P

0,05). (B) Små dyr PET billeder af [1-

11C] acetat ved 30 min efter injektion. Gule pile indikerer tumorer. S = mave; L = leveren.

FASN-Målrettet terapi

In Vivo

Vi undersøgte yderligere følsomhed FASN målrettet behandling med orlistat i hver tumor xenograft

i vivo

(fig. 3). Fig. 3A viser tumorvolumen måling. På dag 14 havde tumorvolumen i LNCaP-tumorer behandlet med orlistat faldet markant; 22,0 ± 6,2% af oprindelige tumorvolumen. I modsætning hertil PC3 og DU145 tumorer behandlet med orlistat viste progressive stigninger i tumor volumen; 238,8 ± 46,6% og 367,1 ± 99,5% af initial tumorvolumen, hhv. Fig. 3B viser tumor volumen i LNCaP, PC3, og DU145 tumorer behandlet med orlistat, der vises i form af relativ tumor volumen versus indledende tumorstørrelse normaliseret mod hver ubehandlet tumor på samme tidspunkt; Der var betydelige forskelle i tumorvækst mellem LNCaP, PC3 og DU145 tumorer (

P

0,05). Virkningerne af orlistat behandling på kropsvægt er vist i fig. 3C. Kropsvægttab var mindre end 5% på dag 14. Der var ingen påviselige ændringer i fysiske tilstand (med intet tegn på scruffy frakke eller diarré) over forsøgsperioden. Disse data viste, at optagelsen af ​​radioaktivt mærket acetat afspejler følsomheden af ​​FASN målrettet behandling med orlistat

in vivo

FASN målrettet behandling med orlistat er yderst effektiv mod tumorer med høj FASN udtryk angivet med høj optagelse af radioaktivt mærket acetat.

(A) vækst af tumorer behandlet med orlistat (240 mg /kg /dag) eller vehikel alene dagligt i 2 uger (venstre) i tumor- xenograft-bærende mus. Data repræsenterer tumorvolumen (mm

3). Repræsentative billeder af behandlede tumorer på dag 14 (til højre). (B) Relativ tumorvolumen versus indledende tumorstørrelse normaliseret mod hver ubehandlede tumor på samme tidspunkt. De grupper med forskellige alfabeter er signifikant forskellige (

P

0,05). (C) Virkninger af orlistat behandling på kropsvægt.

FASN Hæmning af RNAi

Dernæst at undersøge de mekanismer, hvordan FASN hæmning påvirker tumorprogression, vi vedtaget FASN knockdown LNCaP celler opnået ved shRNA transduktion. I denne undersøgelse har vi etableret fem FASN-RNAi-cellelinier, FASN-RNAi 3125, 3126, 3127, 3128, og 3129 celler, og QRT-PCR viste et markant fald i FASN mRNA-ekspression i FASN-RNAi 3128 celler og en moderat fald i FASN-RNAi 3129 celler i forhold til kontrol-RNAi celler (fig. S3). Western blot analyse viste den samme tendens i FASN-RNAi 3128 og 3129 celler i FASN udtryk, henholdsvis (fig. 4A, venstre). Knockdown af FASN af RNAi i LNCaP celler førte til en tilsvarende reduktion i acetat inkorporering (fig. 4A, højre).

FASN-RNAi 3128 og 3129 celler og kontrol-RNAi celler blev anvendt. (A) Relativ udtryk for FASN, analyseret ved Western blot analyse (til venstre) og optagelse af [1-

14C] acetat (til højre). (B) Celleproliferation over 7 dage (øvre, venstre). Lys mikroskopi billeder (øverst til højre). Relativ migration og invasion potentiale i FASN-RNAi celler i forhold til kontrol-RNAi celler (lavere, venstre og højre, henholdsvis). Værdier fra seks uafhængige forsøg er vist. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. De grupper med forskellige alfabeter er signifikant forskellige (

P

0,05)..

Interessant, knockdown af FASN inducerer observerbare ændringer i biologiske karakteristika LNCaP celler (Fig 4B ). Knockdown af FASN inhiberede cellulær proliferation svarende til et fald i FASN ekspression (fig 4B, øverst til venstre.); Der var signifikante forskelle i celleproliferation i FASN-RNAi 3128 og 3129 celler, sammenlignet med kontrol-RNAi-celler (

P

0,05). Desuden viste mikroskopisk undersøgelse, at kontrol-RNAi celler spindel-formet med pseudopodia på dyrkningsplader, mens FASN-RNAi 3128 celler rundt med mangelfuld dannelse af pseudopodia og FASN-RNAi 3129 celler viste mellemliggende morfologi (fig. 4B, øverst til højre) . Bevægelsen af ​​cellerne på dyrkningsplader blev yderligere observeret ved anvendelse af time-lapse mikroskopi (fig. 5, Video S1, Video S2). De kontrol-RNAi celler knyttet til pladen bund dannede pseudopodia, blev spindel-formet, og aktivt migreret med celledeling og forlængelse af deres pseudopodia. Mens viste FASN-RNAi 3128 celler mangelfuld pseudopodia dannelse, blev rund, og cellerne delt, men viste mindre migration i forhold til kontrol-RNAi celler. FASN-RNAi 3129 celler viste intermediære adfærd (data ikke vist).

Data indikerer billeder i kontrol-RNAi celler (A) og FASN-RNAi 3128 celler (B). Billeder blev taget hver 6 timer i 5 dage. Hvide pilespidser angiver et eksempel på dannelsen af ​​pseudopodia, spindel-formet morfologi, og aktive celle migration i kontrol-RNAi celler. Sorte pilespidser angiver et eksempel på den mangelfulde dannelse af pseudopodia, rund morfologi, og lav aktivitet af celle migration i FASN-RNAi 3128 celler.

Baseret på disse observationer, vi hypotesen, at FASN hæmning påvirker migration og invasion af celler. For at teste dette, vi udførte celle migration og invasion assays med FASN-RNAi og kontrol-RNAi LNCaP celler. Vi fandt, at FASN-RNAi celler viste mindre migration og invasion svarende til fald i ekspressionen af ​​FASN (fig. 4B, nedre venstre og højre). Disse observationer indikerer, at FASN hæmning ikke kun undertrykt cellulær proliferation, men også forringet cellulær vedhæftning, migration og invasion.

Gene Expression Profil i FASN Knockdown Celler

For yderligere at forstå virkningerne af FASN hæmning,