PLoS ONE: Dickkopf-1 Er Onkogen og Involveret i invasiv vækst i ikke småcellet Cancer

Abstrakt

Dickkopf-1 (DKK1) er en inhibitor af Wnt /β-catenin signalvejen. Imidlertid er rollen af ​​DKK1 i progressionen af ​​ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) ikke fuldt forstået. I denne undersøgelse blev RT-PCR og Western blot anvendt til at undersøge ekspressionen af ​​DKK1 i et panel af ti humane NSCLC-cellelinier og NSCLC væv. DKK1 ekspression blev stærkt transaktiverede i langt de fleste af disse cancer linjer. Udtrykket af DKK1 blev opreguleret på både mRNA og protein niveauer i NSCLC væv sammenlignet med de tilstødende normale lungevæv. Immunhistokemi og immunofluorescens afslørede, at DKK1 primært var fordelt i cytoplasmaet i både carcinom væv og cellelinier. DKK1 proteinekspression blev også evalueret i paraffinsnit fra 102 patienter med NSCLC ved immunhistokemi, og 65 (63,73%) tumorer var DKK1 positive. Relativ analyse viste en signifikant sammenhæng mellem DKK1 positivt udtryk og lymfeknude metastaser (

P

0,05). Patienter med DKK1-positive tumorer havde dårligere DFS end dem med negativ ESCC (5-års DFS, 15,4% versus 27%, p = 0,007). For yderligere at udforske de biologiske virkninger af DKK1 i NSCLC celler, vi overudtrykt DKK1 i NSCLC 95C celle ved hjælp af eukaryote ekspressionsvektor pCMV-Tab-2b og udførte et knockdown af DKK1 i LTEP-a-2-celle ved hjælp af en kort hårnål RNA ekspressionsvektor pSilencer 5.1. DKK1 havde ikke nogen virkning på proliferation, men syntes at spille en rolle i migration og invasion kapacitet. Overekspression af DKK1 fremmer vandrende og invasiv aktivitet af 95C, mens DKK1 knockdown resulterede i undertrykkelse af migrations- og invasion potentialer LTEP-a-2 celle. Taget sammen indikerer disse resultater, at DKK1 kan være en afgørende regulator i progressionen af ​​NSCLC. DKK1 kunne være en potentiel terapeutisk mål i NSCLC

Henvisning:. Li S, Qin X, Guo X, Cui A, han Y, Wei S, et al. (2013) Dickkopf-1 Er Onkogen og Involveret i invasiv vækst i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 8 (12): e84944. doi: 10,1371 /journal.pone.0084944

Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: April 26, 2013; Accepteret: November 19, 2013; Udgivet: December 31, 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) er en af de mest almindelige ondartetheder og incidensen er stigende [1-4]. På trods af de fremskridt inden tidlig opsporing og forbedringer i behandlingen, overlevelse NSCLC langsigtet fortsat utilfredsstillende. Tumor tilbagefald og metastaser er de vigtigste påvirkningsfaktorer af prognosen. Biomarkører, der kan forudsige risikoen for recidiv og metastaser er yderst presserende. Derfor er det nødvendigt at identificere nye targets, der deltager i tumorprogression og design passende behandlingsstrategier for NSCLC patienter.

Dickkopf-1 (DKK1) er et udskilt protein involveret i Wnt signalvej, der fungerer som en inhibitor. I den konventionelle Wnt /β-catenin, Wnt-1-protein binder til frizzlede receptor (Fz) og low-density lipoprotein receptor-relateret protein-5/6 (LRP5 /6), udløser signaler for proliferation via β-catenin [ ,,,0],5,6]. DKK1 binder til LRP5 /6 og blokerer interaktion med Wnt-1, hvilket resulterer i β-catenin-nedbrydning og retardering af proliferation [7-10]. Ekspressionen og roller for DKK1 er forskellig i forskellige cancertyper, har aktuelle undersøgelser rapporteret, at overekspression af DKK1 findes i mange maligne tumorer, herunder brystcancer, lungecancer, esophageal carcinomer og hepatocellulært carcinom (HCC) [11-15], hvilket indikerer et potentiale onkogen funktion af DKK1 [16]. På trods af disse undersøgelser, har der lidt blevet rapporteret om betydningen af ​​DKK1 ekspression i NSCLC progression og prognose.

I denne undersøgelse har vi først analyseret udtryk for et panel af humane NSCLC cellelinjer og 102 resektion prøver af NSCLC, og udforskede sammenhængen mellem DKK1 udtryk og clinicapathological faktorer. Efterfølgende vi opdaget de biologiske virkninger af DKK1 om migration og invasion i dyrkede pancreas carcinomceller.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af de etiske udvalg Anden Hospital i Hebei Medical University og Tianjin Bryst Hospital.All deltagerne forudsat deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse.

Cell kulturperler og transfektion

lunge andenocarcinoma cellelinje A549 og lunge store cellelinie NCI-H460 blev indkøbt fra ATCC. Lungen andenocarcinoma cellelinier SPC-A-1, LTEP-a-2, GLC82 A2 og PC-9; lunge skællede cellelinjer YTMLC-9 og lunge store cellelinjer 95C, 95D er begavet fra Tianjin lungekræft institut [14]. Cellerne blev dyrket i RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, GIBCO), 100 IU /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin holdt ved 37 ° C i befugtet luft indeholdende 5% CO

2.

Cellerne blev dyrket til 80% konfluens og transficeret med rekombineret eukaryot vektor og tom vektor under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen, CA, USA) ifølge producentens anbefalinger.

Patientprøver

i denne undersøgelse blev 102 patienters formalinfikserede NSCLC vævsprøver anvendt til immunhistokemi farvning, som blev opnået fra Anden Hospital i Hebei Medical University. Ti patientens friske væv, herunder primære NSCLC og matches tilgrænsende normale væv blev opnået fra Tianjin Chest Hospital. Alle væv blev opbevaret i flydende nitrogen før anvendelse. Vævsprøver blev formalet i flydende nitrogen til isolering af totalt RNA og protein.

Plasmidkonstruktion

Den eukaryote ekspressionsvektor pCMV-Tag-2b (Invetrogen) blev ombygget til at udtrykke DKK1. 815 basepar lang DKK1 sekvens (NM: 012.242,2), herunder

EcoR I

og

BamHI

restriktionsenzymsteder blev amplificeret fra genomisk DNA. Primersekvenserne var: Fremad 5′-TGGATCCATGATGGCTCTGGGCGCAGCGGGAG-3 ‘, omvendt: 5′-CGAATTCTTAGTGTCTCTGACAAGTGTGAAGCCTAGAAG-3’. Det PCR amplificerede produkt blev subklonet ind pCMV-Tag-2b vektor. Den rekombinante vektor blev betegnet pCMV-Tag-2b-DKK1. Knockdown vektoren blev konstrueret ved anvendelse af en eukaryot ekspressionsvektor pSilencer 5,1 (Ambion). Målet sekvens af DKK1 gen var 5′-AATAAGTACCAGACCATTGAC-3 ‘, og den resulterende vektor blev betegnet som pSilencer-DKK1. Den negative kontrol sekvens var 5’-CTACCGTTGTTATAGGTG-3 ‘. Den negative kontrol siRNA plasmid (pSilencer-NC) koder for et siRNA, som ikke har nogen væsentlig sekvenslighed med humane gensekvenser. Alle konstruktion sekvenser blev udformet i henhold til Ambion online siRNA Target Finder. Sekvensanalyse blev udført for at verificere de resulterede vektorer.

Western blotting

Western blot blev udført for at påvise ekspressionen af ​​DKK1 i operativt fjernede NSCLC prøver og NSCLC cellelinjer. Frosne NSCLC prøver blev slibes i flydende nitrogen; cellelinier blev dyrket til 80% konfluens og høstet. Vævsprøver og celler blev lyseret i RIPA lysebuffer (phosphatpufret saltvand indeholdende 1% Triton X-100 og 1 nM PMSF) ved 4 ° C i 30 minutter og centrifugeret ved 12.000 i 15 min. Proteinkoncentrationen blev kvantificeret under anvendelse af BCA-protein-assayet (Pierce, Rockford, IL). Lige mængder af protein blev påsat og elektroforese i en 10% SDS-PAGE-gel, som derefter blev overført til nitrocellulose (NC) membran. Membranen blev inkuberet i 60 minutter i PBS indeholdende 0,1% Tween-20 og 5% skummetmælk for at blokere enhver ikke-specifik binding; dette blev efterfulgt af inkubation ved 4 ° C med anti-humant DKK1 kanin polyklonalt antistof (LifeSpan, WA, USA, 1: 500 fortyndinger). Membranen blev vasket tre gange i 10 minutter i PBS med 0,1% Tween-20 og derefter inkuberet i 1 time med HRP-konjugeret bovint anti-kanin (1: 5000 fortyndinger) sekundært antistof (Boster Biotechnology, Wuhan, Kina) ved stuetemperatur temperatur. De immumoreactive proteiner blev derefter detekteret ved hjælp ECL substrat efter producentens anbefaling. β-actin blev anvendt som et endogent protein til normalisering. IPP billedanalyse software blev anvendt til kvantificering.

RT-PCR og real-time PCR

Til analyse af DKK1 udtryk i NSCLC celler, total RNA blev isoleret med Trizol. Lig mRNA fra hver prøve blev omvendt transkriberet til cDNA under anvendelse tilfældig primer. GAPDH blev anvendt som intern kontrol blev PCR-reaktioner udført ved anvendelse af følgende primere: DKK1, fremadrettet 5′-CAACGCTATCAAGAACCTGC-3 ‘, omvendt 5′-GATCTTGGACCAGAAGTGTC-3′; GAPDH, fremadrettet 5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3 ‘, omvendt 5′-TGGXGTGTGAACCACGAGAA-3’. PCR blev optimeret til antallet af cyklusser for at sikre produktets intensitet til at være inden for den lineære fase af amplifikation blev PCR-produkterne derefter analyseret ved elektroforese i 2% agarosegel.

Real-time PCR blev udført ved anvendelse SYBR

® Green (Code DRR041A, Takara) i et samlet volumen på 30 pi over en to-trins cykler under anvendelse af følgende temperaturprofil protokol: 10 sek ved 95 ° C efterfulgt af 42 cykler ved 95 ° C i 15 s og 55 ° C for 30’erne. Reaktionerne blev anbragt i en 96-brønds plade (ABI) under anvendelse af en forvarmet realtid instrument (ABI 7500HT). De relative niveauer af ekspression blev kvantificeret og analyseret ved hjælp af Bio-Rad iCycler iQ-software. Tre uafhængige forsøg blev udført for at analysere relative genekspressioner og hver prøve blev testet tredobbelt. Ct-værdier blev anvendt til beregning af ekspressionen af ​​mRNA-niveauer. Mængden af ​​target genekspression (2-Ct) blev normaliseret ved hjælp af den endogene GAPDH reference, blev mængden af ​​target-genet i kontrolprøven indstillet som kalibrator på 1,0. Primer sekvenser anvendt til real-time PCR blev noteret i tabel S1.

Proliferationsassay

MTT-assay blev anvendt til at analysere celleproliferation. Efter 24 timers transfektion blev celler udsået i 96-brønds plade ved 5,0 × 10

3 celler /ml og dyrket i 24 timer, 48 timer, 72 timer og 96 timer hhv. På hvert tidspunkt blev 10 pi MTT-reagens (5 mg /ml, Sigma) tilsat til hver brønd og inkuberet i 4 timer ved 37 ° C. 200 pi DMSO (Invitrogen) blev tilsat for at opløse de formazankrystaller for 30 minutter efter bortkastning af supernatanten. Spektrometrisk absorbansen blev målt ved en bølgelængde på 490 nm på mikropladelæser (Spectra Max M5, MD, USA). At sikre resultaterne hver prøve blev testet i tre eksemplarer, og alle forsøg blev udført tre gange.

Sårheling assay

Migrationen evne blev bestemt ved anvendelse af sår-helende assay. Tilsvarende celler blev udpladet i 12-brønds plader uden antibiotika. Efter 24 timers transfektion blev cellerne såret med en steril plastik 100 pi mikropipettespids, og den flydende rester blev vasket med PBS og dyrket i serum-frit medium. Bredde af såret blev målt på forskellige tidspunkter. 3-4 forskellige steder blev visualiseret og fotograferet under en fase-kontrast omvendt mikroskop (40 × mål, TE2000-E, Nikon, Japan).

Boyden kammer assay

Boyden kammer assay blev anvendt at undersøge celleinvasion kapacitet. Celler blev transficeret med lipofectmine 2000. Efter 16 timer blev cellerne trypsiniseret og resuspenderet. 5,0 x 10

4-celler i 300 pi RPMI-1640 medium var anbragt i det øvre rum (porestørrelse 8 um; BD Biosciences). De nedre kamre blev fyldt med 500 pi komplet medium med 10% FBS. Efter inkubation i 48 timer ved 37 ° C blev cellerne på den øvre overflade af filteret fjernes med en vatpind. De migrerende celler på den nedre overflade af inserterne blev fikseret og farvet med 0,1% krystalviolet i 30 min ved 37 ° C og vasket to gange med PBS. De farvede celler blev derefter visualiseret under et mikroskop og celletallet blev talt i fem tilfældige felter (forstørrelser 100 ×). Boyden kammer blev udført i to eksemplarer på to separate forsøg.

Immunhistokemi og immunofluorescens

For at undersøge status for DKK1 proteinet i kliniske NSCLC prøver, som var blevet indlejret i paraffinblokke blev IHC-farvning udført ifølge den følgende procedure. Paraffinsnit blev afparaffiniseret med xylen og rehydratiseret i graduerede ethanolopløsninger. Aktivitet af endogen peroxidase blev blokeret med 3% H

2O

2 i 15 minutter ved stuetemperatur, og derefter blev snittene opvarmet med 0,01 M citrat (pH = 6,0) ved 95 ° C i 15 min i mikrobølgeovn i antigen-genvinding . Efter inkubation med anti-DKK1 polyklonalt kaninantistof (ab22827, Abcam Inc., Cambridge, MA, fortynding 1: 200) i 2 timer ved stuetemperatur, negative kontroller uden det primære antistof. Snittene blev inkuberet med HRP-mærket anti-kanin-IgG sekundært antistof. Intensiteten af ​​DKK1 farvning blev evalueret ved hjælp af følgende kriterier [12,14]: stærk positiv (2+), mørkebrun farvning 50% af tumorcellerne i cytoplasma; svagt positive (1+), helst mindre grad af brune farvning i tumorceller; fraværende (scoret som 0), immunreaktive til DKK1 10% eller mindre af tumorcellerne. Scorerne blev vurderet af to patologer uden at kende de klinisk-patologiske data.

TE13-celler blev dyrket på dækglas, der derefter blev fikseret med 4% paraformaldehyd og permeabiliseret med 0,2% Triton X-100 i PBS i 10 min ved stue temperatur. Celler blev efterfølgende blokeret med 3% BSA i 30 minutter ved stuetemperatur, og derefter inkuberet med primære antistoffer fortyndet i PBS indeholdende 3% BSA i 60 min ved stuetemperatur. Efter at være blevet vasket med PBS blev cellerne farvet med FITC-konjugeret sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology) i 30 minutter ved 37 ° C. Endelig blev dækglassene vasket med PBS og kerner blev monteret med DAPI og visualiseret med konfokal laser scanning mikroskop.

Statistical Analysis

Statistisk analyse blev udført med SPSS 10.0 softwaren. Data er præsenteret som middelværdi ± SD. T-test og envejs variansanalyse blev anvendt. Forholdet mellem grupperede variabler blev analyseret ved anvendelse chi-square test. Overlevelseskurver blev fremstillet ifølge fremgangsmåden beskrevet af Kaplan og Meier-metoden. Forskelle mellem kurver blev estimeret ved hjælp af log-rank test. P-værdier 0,05 blev anset for at være betydelig. Alle forsøg blev udført mindst tredobbelt [15].

Resultater

DKK1 udtryk i dyrkede humane NSCLC cellelinjer

udtryk for DKK1 blev kendetegnet ved en række menneske NSCLC cellelinier. DKK1 protein kunne påvises i alle cellelinierne (figur 1). Højere ekspression blev observeret i LTEP-A-2 og GLC-82 cellelinjer. Lavere ekspression blev observeret i A2 og 95 ° C cancercellelinjer. DKK1 mRNA-ekspression blev også undersøgt ved hjælp af RT-PCR, resultaterne var i overensstemmelse med resultaterne af Western-blot (figur 1. B). Den subcellulære lokalisering af DKK1 ekspression i NSCLC-cellelinien blev defineret ved immunfluorescensfarvning. Resultaterne viste, at DKK1 ekspression hovedsagelig blev fordelt i cytoplasmaet med et granulært udseende (figur 1. C).

(A) Ekspression af DKK1 på mRNA-niveau (RT-PCR: 28 cykler af amplifikation). GAPDH mRNA blev anvendt som intern kontrol. (B) Ekspression af DKK1 på proteinniveau. β-actin blev anvendt som intern kontrol. (C) subcellulære lokalisering af endogent DKK1 protein i NSCLC celle. DKK1, farvet med rhodamin B, var på cellens cytoplasma optræder finkornet materiale. Cellekerne optrådte som blå fluorescens farvet med DAPI (forstørrelse 100 x).

DKK1 Expression i NSCLC væv

For at undersøge ekspressionen af ​​DKK1 protein i NSCLC, blev 102 NSCLC patienter paraffinsnit vurderet af immunhistokemisk analyse. Af disse 46 (45,1%) viste stærk positiv DKK1 ekspression, hovedsageligt i cytoplasmaet af tumorceller, med mørk brun granulære fordeling. 19 (18,63%) prøver var svage positive udtryk med bleggule partikler. mens de resterende 37 (36,27%) var negative. Den samlede sats for positiv farvning var 63,73%. I modsætning hertil ingen af ​​de normalt epitel viste signifikant niveau af immunhistokemisk farvning (figur 2A). Vi analyseret yderligere sammenhængen mellem DKK1 udtryk og klinisk-patologiske parametre; Det er interessant at bemærke, at de positive udtryk for DKK1 hovedsageligt var ledsaget med lymfeknuder metastase (tabel 1). Den samlede 5-års sygdomsfri overlevelse (5-års DFS) på patienter med DKK1-negativ var 27%, mens patienter med DKK1-positive tumorer viste dårligere DFS end dem med negative tumorer (5-års DFS, 15,4% versus 27%, P = 0,007) (figur S1). Disse resultater indikerer, at DKK1 overekspression er en hyppig begivenhed i humane NSCLC, som kan have en potentiel forbindelse med metastasen af ​​NSCLC.

(A) Ekspression af immunhistokemisk farvning. DKK1 stærk positiv ekspression i lungekræft viser farvning hovedsagelig i cytoplasmaet af tumorceller (forstørrelse 100 x). Repræsentant DKK1 svagt positiv lungekræft med bleggule partikler i tumorceller (forstørrelse 100 ×). DKK1 negativ lungekræft celle viser næsten ingen mærkbar farvning af tumorceller (forstørrelse 100 x). Normal lungevæv uden farvning. (B) Ekspression af DKK1 mRNA i NSCLC væv og matchede normale lungevæv. (C) Ekspression af DKK1 protein i NSCLC væv og matchede normale lungevæv. N, normalt væv; T, tumor væv. Positive udtryk for DKK1 hovedsagelig ledsaget med lymfeknuder metastaser.

Parametre

n

DKK1 udtryk

χ

2

P

value

Positive(%)

Negative(%)

Age(years) 606439(60.9%)25(39.1%)0.5780.2940 ≥603826 (68,4%) 12 (31,6%) GenderMale8151 (63,0%) 30 (37,0%) 0.0990.4820 Female2114 (66,7%) 7 (33,3%) DifferentiationWell3221 (65,6%) 11 (34,4%) 0.0640.8003

*

Moderate4327 (62,8%) 16 (37,2%) Poor2717 (63,0%) 10 (37,0%) TT1117 (63,6%) 4 (36,4%) 0.12130.7276

**

T23623(63.9%)13(36.1%)T31824(66.7%)12(33.3%)T41911(57.9%)8(42.1%)N(Metastasis)Positive(N1+N2)5447(87.0%)7(13.0%)26.9760.0000 Negativ (n0) 4818 (37,5%) 30 (62,5%) Tabel 1. Sammenhæng mellem DKK1 og diverse klinisk-patologiske parametre

*

Well gruppen versus moderat;

**

T3 vs. T4.

CSV Hent CSV

Vi næste observerede udtryk for DKK1 i kirurgisk resektion NSCLC væv og matchede normale væv. Blandt 10 tilfælde af NSCLC, 7 viste signifikant opreguleret ekspression af DKK1 mRNA i cancervæv sammenlignet med tilsvarende normale væv (figur 2B). Western blot Resultaterne viste den samme tendens på DKK1 proteinniveau (figur 2C).

Effekt af DKK1 overekspression om migration og invasion i 95C

For at teste biologiske rolle DKK1 i NSCLC celle, vi undersøgt konsekvensen af ​​overekspression af DKK1 på celle migration og invasion kapacitet i 95C cellelinje, som rent faktisk har et meget lavt niveau af endogen DKK1. Eukaryote ekspressionsvektor pCMV-Tag-2b-DKK1 blev konstrueret til at overudtrykke genet DKK1. En betydelig stigning i niveauerne af både DKK1 protein og mRNA blev observeret i 95C-cellelinje transficeret med pCMV-Tag-2b-DKK1 sammenlignet med blank kontrol og negativ kontrol (Figur 3. A). Efterfølgende viste MTT-assay at overekspression af DKK1 ikke ændrede celleproliferation evne (data ikke vist). Imidlertid blev migration evne fremmes i sårheling assayet (figur 3. B, C). Boyden kammer blev anvendt til at teste invasivitet, blev 95C-celle transficeret med enten pCMV-Tag-2b-DKK1 eller pCMV-Tag-2b, og blank kontrolgruppe blev tilsat transfektionsreagens uden plasmid. Efter 18 timer transfektion blev cellerne podet på toppen af ​​indsatsen. Celler, som invaderede gennem barrieren og nåede den anden side af kammeret insertet blev registreret efter 48 inkubering. Boydenkammer Resultaterne viste, at celler, der passerede gennem membranen i pCMV-Tag-2b-DKK1 gruppe var større end de to andre grupper (figur 3. D). Disse observationer indikerede, at overekspression af DKK1 markant kan fremme invasion evne 95 ° C-celler (Figur 3. E).

(A) RT-PCR og Western blot-analyse af DKK1 ekspression. DKK1 niveau i 95C celle transficeret med pCMV-Tag-2b-DKK1 er signifikant højere end i pCMV-Tag-2b og blank kontrolgruppe. (B) De sårede og helende 95 ° C celler. (C) Måling af migration afstand (*

P

0,05). (D) Invasionen evne 95C transficeret med pCMV-Tag-2b-DKK1 blev væsentligt forbedret. (E) Antallet af celler migrerer gennem Matrigelcoatede filtre blev analyseret statistik. Analyser blev udført i tre brønde (*

P

0,01).

Knockdown af endogen DKK1 af siRNA faldt migration og invasion i LTEP-a-2

Vi analyserede virkningerne af DKK1 knockdown om migration og invasion i LTEP-a-2-cellelinje . For at bestemme knockdown effekten af ​​shRNA, det DKK1expression niveau i LTEP-a-2-cellelinier blev undersøgt ved både RT-PCR og Western blot. Den specifikke siRNA effektivt reducerede den endogene ekspression af DKK1 i cellerne, som blev transfekteret med pSilencer-DKK1 sammenlignet med de celler, der var transficeret med pSilencer-NC-vektoren (Figur 4. A).

(A) RT- PCR og Western blot-analyse af DKK1 ekspression. DKK1 niveau i LTEP-a-2-celle transficeret med pSilencer-DKK1 er væsentligt lavere end i pSilencer-NC og blank kontrolgruppe. (B) De sårede og helende LTEP-en-2-celler. (C) Måling af migration afstand (*

P

0,05). (D) Invasionen evne LTEP-a-2 transficeret med pSilencer-DKK1 var signifikant undertrykt. (E) Antallet af celler migrerer gennem Matrigelcoatede filtre blev analyseret statistik. Analyser blev udført i tre brønde (*

P

0,01).

Knockdown af endogen DKK1 af siRNA påvirkede ikke LTEP-a-2 spredning (data ikke vist), men betydeligt undertrykt migration evne i sårheling assay. Vandringshastigheden af ​​pSilencer-DKK1 celler i sårheling signifikant lavere efter 48 transfektion end pSilencer-NC og blank kontrolgruppe (Figur 4. B, C). Når dyrkes i Boyden kammer, blev antallet af celler, der migrerede gennem Matrigelcoatede porøse filtre væsentligt reduceret i DKK1 Knockdown pSilencer-DKK1 celler sammenlignet med pSilencer-NC og blank kontrolgruppe (Figur 4. D, E).

overekspression af DKK1 ændret associerede gener udtryk

for at udforske den mekanisme af DKK1 i lungekræft progression, blev real-time PCR udført for at påvise effekten af ​​DKK1 overekspression på ekspressionen af ​​relative gener involveret i carcinogenese. Overekspression af DKK1 ændrede ikke ekspressionen af ​​cellecyklus relateret protein cyclinD1 og apoptose beslægtede proteiner Bcl-2 og Box. Akt-1 forbundet med signalvejen blev minimalt opreguleret i 95C celle transficeret med pCMV-Tag2b-DKK1. Udtrykket af MMP2 og VEGFC i 95C celle transficeret med pCMV-Tag2b-DKK1 blev øget 7,78 gange og 2,13 gange sammenlignet med kontrol 95 ° C celler (Tabel S2).

Diskussion

familien af ​​humane proteiner DKK er sammensat af DKK1, DKK-2, DKK-3, DKK-4 og en unik DKK3-relateret protein, kaldet Soggy [17]. DKK1, der koder for et secerneret protein, er en antagonist af Wnt /β-catenin signalering, der er involveret i tumorudvikling [13,18-22]. DKK1 udtrykkes i talrige humane cancere; det kan spille forskellige biologiske roller i tumorceller afhængigt af den celletype involveret. DKK1 opreguleres i nogle former for humane tumorer, herunder NSCLC, hepatocellulært carcinom, pancreascancer [12,14,19,23]. Det syntes at DKK1 kunne spille afgørende roller i udviklingen af ​​disse typer tumorer, men de biologiske virkninger af DKK1 i NSCLC er ikke blevet klarlagt. I denne undersøgelse har vi bekræftet, at DKK1 udtrykkes i et panel af NSCLC-cellelinier. Immunoflouresence viste, at DKK1 subcellulære placering udtryk meste var fordelt i cytoplasmaet i NSCLC celler. Den IHC undersøgelse af DKK1 udtryk i 102 NSCLC prøver sektioner viste, at positivt udtryk for DKK1 er korreleret med lymfeknuder metastase; det kan være en indikator for cancer metastaser. Med hensyn til prognose, positivt udtryk for DKK1 protein korreleret med en trist 5-års overlevelse. DKK1 opreguleres i NSCLC væv sammenlignet med matchede normale væv. Så det er muligt at DKK1 er involveret i progressionen af ​​NSCLC.

DKK1 er et udskilt protein, der indeholder en signalpeptidsekvens og to cysteinrige domæner og fungerer som en negativ regulator af Wnt signalering [6, 7]. Desuden blev DKK1 rapporteret at være en nedstrøms mål for β-catenin /T-celle-faktor og deltager i en negativ feedback loop i Wnt-signalering i colon cancerceller [24,25]. Undersøgelser har vist, at overekspression af DKK1 var forbundet med dårlig prognose [14,19,21], mens lidt om funktionen af ​​DKK1 i NSCLC. For yderligere at undersøge de biologiske virkninger af DKK1 i ivtro det første, vi bekræftet, at overekspression af DKK1 fremmer migration og invasion i human NSCLC cellelinje 95C. I mellemtiden, overekspression af DKK1 opreguleres udtryk for metastase relaterede proteiner, men den detaljerede mekanisme skal være yderligere undersøgelse. Desuden bruger eukaryot udtryk for DKK1 shRNA, viste vi, at knockdown af DKK1 undertrykker migration og invasion af NSCLC cellelinje LTEP-a-2.Den resultater indikerer, at DKK1 kan have en positiv rolle i udviklingen af ​​NSCLC, men mekanismen er involveret i invasionen behov yderligere at studere.

Imidlertid har nogle undersøgelser rapporteret, at DKK1 undertrykker cellevækst og migration [16,26], som antyder, at der kan være andre roller DKK1 i Wnt /β-catenin signalering. DKK1 kunne spille forskellige biologiske roller i forskellige typer af cancerceller. En retrospektiv analyse af DKK1 udtryk viste, at DKK1 blev ændret under PCa progression [27]. Hidtil har der kun været få undersøgelser vedrørende roller DKK1 i NSCLC, som hovedsageligt fokuserer diagnose og prognose værdier [12,21,28-30]. Rolle DKK1 i NSCLC, dens mekanisme af funktion og kliniske aspekter har brug for yderligere undersøgelser.

Sammenfattende, selvom den detaljerede funktion DKK1 i NSCLC progression ikke er godt afklaret, vores resultater tyder de potentielle roller DKK1 i fremme af migration og invasive vækst i NSCLC cellelinjer, og at det kunne tjene som en roman terapeutisk mål for NSCLC.

Støtte Information

figur S1.

sygdomsfri overlevelse kurve klassificeret i henhold til DKK1 udtryk for alle patienter plottede af Kaplan-Meier-metoder.

doi: 10,1371 /journal.pone.0084944.s001

(TIF)

tabel S1.

Primere sekvens bruges til real-time PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0084944.s002

(DOC)

tabel S2.

differencial ekspression af gener i 95C transficeret med pCMV-Tag2b-DKK1 forhold til 95C transficeret med pCMV-Tag2b.

doi: 10,1371 /journal.pone.0084944.s003

(DOC)