PLoS ONE: Den Gangliosid GM3 er forbundet med cisplatin-induceret apoptose i Human Colon Cancer Cells

Abstrakt

Cisplatin (

cis

-diamminedichloroplatinum, CDDP) er et velkendt kemoterapeutisk middel til behandling af flere kræftformer. Den præcise mekanisme underliggende apoptose af cancerceller induceret af CDDP stadig uklar. I denne undersøgelse viser vi mekanistisk at CDDP inducerer GM3-medieret apoptose af HCT116-celler ved at hæmme celleproliferation, og stigende DNA-fragmentering og mitokondrier-afhængig apoptose signaler. CDDP-induceret apoptose i celler ved produktion af reaktive oxygenarter (ROS), reguleret ROS-medieret ekspression af Bax, Bcl-2 og p53, og induceret nedbrydning af poly (ADP-ribosyl) polymerase (PARP). Vi kontrollerede også ekspressionsniveauer af forskellige gangliosider i HCT116-celler i nærvær eller fravær af CDDP. Interessant, blandt gangliosiderne, CDDP augmented ekspressionen af ​​kun GM3 syntase og dets produkt GM3. Nedsættelse af GM3 syntase plan gennem ektopisk ekspression af GM3 lille interfererende RNA (siRNA) reddet HCT116 celler fra CDDP-induceret apoptose. Dette fremgik af hæmning af apoptotiske signaler ved at reducere ROS produktion gennem regulering af 12-lipoxigenase aktivitet. Desuden blev apoptotiske følsomhed over for CDDP bemærkelsesværdigt steget i GM3 syntase-transficeret HCT116 celler sammenlignet med i kontrol. Desuden GM3 syntase-transficerede celler behandlet med CDDP udviste en forøget akkumulering af intracellulært ROS. Disse resultater tyder CDDP-induceret oxidativ apoptose af HCT116 celler medieres af GM3

Henvisning:. Chung T-W, Choi H-J, Kim S-J, Kwak C-H, Song K-H, Jin U-H, et al. (2014) Den Gangliosid GM3 er forbundet med cisplatin-induceret apoptose i Human Colon Cancer Cells. PLoS ONE 9 (5): e92786. doi: 10,1371 /journal.pone.0092786

Redaktør: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, USA

Modtaget: Juli 2, 2013; Accepteret: 25 februar 2014; Udgivet: May 14, 2014

Copyright: © 2014 Chung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Den nuværende undersøgelse er blevet støttet af Research Program Basic Science gennem National Research Foundation Korea (NRF) tilskud finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (MEST) Korea (NRF-2013R1A1A2005387) og personlig Tumor Engineering Research center tilskud (2008- 0.062.611). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cisplatin (

cis

-diamminedichloroplatinum, CDDP) er et almindeligt anvendt kemoterapeutisk middel til behandling af flere solide tumorer. CDDP binder til DNA til generering DNA addukter [1]. Tidligere undersøgelser har vist, at CDDP regulerer aktiviteten af ​​visse ionkanaler, transport-proteiner og forskellige plasmamembran enzymer [2], [3], og inducerer reaktive oxygenarter (ROS) under cancerkemoterapi [4]. Følgelig CDDP regulerer DNA-reparation, transskription inhibering, cellecyklusstop og apoptose [5]. Det er blevet rapporteret, at de ekstracellulære signal-regulerede kinaser (ERK), c-Jun-N-terminale kinaser (JNK’erne) /stress-aktiveret proteinkinase (SAPK) og p38 mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) aktiveres i CDDP -induceret apoptose af cancerceller [6], [7]. Derudover CDDP inducerer Fas /FasL-medieret apoptose i humane epitelceller [8] og mitochondriebeskadigelse ved kontrol af ekspressionsniveauer af Bcl-2-familien, som har enten pro- eller anti-apoptotiske funktioner. Ved at påvirke CDDP cytotoksicitet i kræftceller, p53-medieret transaktivering af den pro-apoptotiske Bax, faldt Bcl-2-ekspression og spaltning af Bid fører til en reduktion i mitokondriepotentiale og øger caspase-medieret PARP nedbrydning gennem frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier [9] – [12]. Adskillige undersøgelser har rapporteret, at disse apoptotiske fænomener skyldes ændringen af ​​membranens sammensætning [13]. Blandt membrankomponenterne, er det blevet rapporteret, at ekspressionsniveauer af gangliosider er ændret hos lægemiddelbehandlede cancerceller [14].

Klynger af sialinsyreholdige glycosphingolipider (GSL’er) er allestedsnærværende i membranen microdomain i alle pattedyrceller og er impliceret i en lang række biologiske funktioner, herunder celle-celle interaktioner og signaltransduktion [15]. Mange undersøgelser har rapporteret, at specifikke gangliosider såsom GM3, GD3, og GD1b inducere apoptose i forskellige typer af celler [16], [17]. GM3 behandling i umodne prolifererende glia og neuronale celler resulterer i undertrykkelse af celleproliferation og induktion af apoptose [18], [19]. Derudover er GM3 involveret i celledød gennem akkumulering af ROS og intracellulær calciumion indstrømning i de neuronale celler [20], [21]. I murine blære cancerceller, GM3 overekspression inducerer apoptose og reducerer maligne potentiale [22]. I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi den funktionelle betydning af gangliosid GM3 i CDDP-behandlede kolorektale cancerceller.

Materialer og metoder

Cell kultur og reagenser

Den menneskelige tyktarmskræft HCT116 blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; JBI, Daegu, Korea) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C under 5% CO

2. Cisplatin blev købt fra Dong-Farmaceutisk CO., LTD (Seoul, Korea).

N

acetyl

L-cystein (NAC) blev opnået fra Molecular Probes ™ (Invitogen, CA). Baicalein var fra Sigma-Aldrich. Antistoffer blev opnået som følger: Anti-poly (ADP-ribosyl) polymerase (PARP), BCL-2, Bax, og p53 blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-glyceraldehyd-3-phosphode-hydrogenase (GAPDH) blev købt fra Chemicon (Temecula, LA). Anti-GM3 (M2590) blev købt fra Biotest Laboratories (Japan).

revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR)

Totalt RNA fra hver celle blev isoleret under anvendelse af Trizol-reagens ( Invitrogen). Et mikrogram af RNA blev underkastet revers transkription med oligo dT-primere under anvendelse AccuPower RT-Premix (Bioneer Co, Daejon, Korea), ifølge fabrikantens protokol. CDNA’et blev amplificeret ved PCR med følgende primere under anvendelse af EF-Taq polymerase (SolGent, Seoul, Korea): GM3 syntase (413 bp), 5′-CCCTGCCATTCTGGGTACGAC-3 ‘(sense) og 5′-CACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3′ (antisense ); GD3 syntase (460 bp), 5’-TGTGGTCCAGAAAGACATTTGTGGA-3 ‘(sense) og 5′-TGGAGTGAGGTATCTTCACATGGGT-3′ (antisense) GaINAc-T (GM2 /GD2 syntase) (230 bp), 5’-CCAACTCAACAGGCAACTAC-3 ‘( sense) og 5’-GATCATAACGGAGGAAGGTC-3 ‘(antisense); β-actin (247 bp), 5’-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3 ‘(sense) og 5′-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3’ (antisense). Anvendelsen af ​​lige store mængder mRNA i RT-PCR-assay blev bekræftet ved at analysere ekspressionsniveauerne af β-actin. PCR-produkterne blev separeret ved gelelektroforese på 1,5% agarose-indeholdende ethidiumbromid med 0,5 × Tris-acetat-EDTA (TAE) puffer.

Cellelevedygtighed assay

Celleproliferation blev undersøgt ved anvendelse af en kommercielt tilgængeligt proliferation kit II (XTT, Boehringer Mannheim, Mannheim, Tyskland). Kort fortalt blev cellerne subdyrket i 96-brønds dyrkningsplader ved en tæthed på 103 celler /brønd i 100 pi DMEM /10% FBS. Efter 24 timers inkubation blev mediet kasseret og erstattet med 100 pi frisk medium indeholdende forskellige koncentrationer af CDDP. Pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO2 i 12 timer. Ved slutningen af ​​inkubationen blev 50 pi af XTT test opløsning fremstillet ved at blande 5 ml af XTT-mærkningsreagens og 100 pi elektron-koblingsreagens, der blev tilsat til hver brønd. Efter 4 timers inkubation ved 37 ° C og under 5% CO2 betingelser blev absorbansen målt under anvendelse en ELISA-læser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ved en test bølgelængde på 490 nm.

Flowcytometrisk estimering af intracellulære redox state

ROS-produktion blev evalueret ved farvning af celler med dichlorodihydrofluorescein diacetat (H

2DCFDA; Molecular Probes, Carlsbad, CA). Celler blev vasket to gange med DMEM indeholdende 10% FBS, inkuberet i 10 uM H

2DCFDA fortyndet i DMEM i 20 minutter ved 37 ° C, vasket med PBS, og trypsiniseret. Dissocierede celler blev vasket to gange med iskold PBS, resuspenderes i PBS, og analyseret ved flowcytometri hjælp FACS Calibur (Becton-Dickinson, Mountain View, CA).

Western blot-analyse

Celler blev homogeniseret i en buffer indeholdende 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,02% NaN

3, 100 ug /ml phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 ug /ml aprotinin og 1% Triton X- 100. Proteinkoncentrationer blev målt under anvendelse af Bio-Rad proteinassay (Bio-Rad, Richmond, CA). Tredive-mikrogram af total cellelysat blev størrelsesfraktioneret ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner under anvendelse af Hoefer elektrotransfer (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). At detektere målproteiner, inkuberede vi membranerne med de respektive antistoffer. Påvisning blev udført under anvendelse af sekundær peberrodsperoxidase-koblet anti-mus og anti-kanin-antistoffer (Santa Cruz), og ECL chemiluminescens systemet (Amersham Biosciences).

Over-ekspression af gangliosid GM3 syntase og dets produkt i HCT116-celler

Til konstruktion af GM3 syntase ekspressionsplasmidet, et 1,1 kb DNA-fragment indbefattende humane GM3 synthase-kodende region blev amplificeret ved PCR under anvendelse af primer-oligonukleotider 5′-CTAAGCTTATGAGAAGGCCCAGCTTGTTATTAAAAGACATC-3 ‘(sense), 5’-ATGAATTCGTTCAAAATTCACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3 ‘(antisense) og human føtal hjerne-cDNA som template. De sense og antisense primere indeholder

Hind

III og

Eco

RI restriktionssites (understreget), hhv. Fragmentet blev oprenset fra en 1% agarosegel ved anvendelse af Wizard SV Gel og PCR Clean-Up System (Promega) og fordøjet med det passende restriktionsenzym og ligeres under anvendelse af T4-ligase (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) i et pcDNA3 vektor til frembringelse pcDNA-GM3. At identificere konstruktionen med GM3 syntasegenet blev restriktionskortlægning og DNA-sekventering udføres. HCT116-celler blev udpladet på 6-brønds plader med densitet på 10

5 celler /brønd og dyrket natten over. Celler blev transficeret med 1 ug pcDNA og pcDNA-GM3 plasmidet ved WelFect-EX ™ PLUS metode (JBI). Efter inkubation de transficerede celler blev dyrket i nærvær af 500 ug /ml G418 (Life Technologies, Inc.). Efter 21 dage i det selektive medium blev individuelle G418-resistente kolonier isoleres. Tre positive kloner, der udtrykker GM3 syntase til høje niveauer, som bestemt ved RT-PCR, blev anvendt til yderligere analyse.

Luciferase assay

reporterplasmider, pGL3-1600 blev fremstillet ved indsættelse af

Sac

i /

Bgl

II fragmenter fra hver af plasmiderne tidligere genererede [23] i de tilsvarende steder i den promotor-løse luciferase vektor pGL3-Basic (Promega). Celler blev udpladet på 6-brønds plader med densitet på 10

5 celler /brønd og dyrket natten over. Celler blev co-transficeret med 0,5 pmol GM3 synthase promotor–luciferase reporterkonstruktioner og 0,5 ug β-galactosidase plasmidet ved WelFect-EX ™ PLUS metode (JBI). Celler blev dyrket i medium indeholdende 10% FBS og inkuberet med CDDP i 12 timer. Luciferaseaktivitet og β-galactosidase-aktivitet blev analyseret ved hjælp af luciferase og β-galactosidase-enzym assaysystem (Promega). Luciferaseaktivitet var normaliseret til β-galactosidase-aktivitet i cellelysatet og den gennemsnitlige blev beregnet på basis tre uafhængige forsøg.

immunfluorescensmikroskopi

HCT116 coloncancer-celler blev podet ved en sub-sammenflydende densitet på 12 mm- diameter sterile dækglas i seks-brønds vævskulturplader. Celler blev fikseret i 3,7% formaldehyd /PBS og vasket tre gange med PBS og derefter permeabiliseret i 0,5% Tween-20 /PBS i 5 minutter ved stuetemperatur. Ikke-specifikke steder blev derefter blokeret med PBS indeholdende 1% bovint serumalbumin i 30 minutter ved stuetemperatur under forsigtig vipning. Derefter blev en opløsning af GM3 (M2590), GD3 eller GM2-specifikke antistoffer oversvømmet over cellerne ved 4 ° C natten over. Efter vask med PBS blev cellerne yderligere inkuberet med FITC-konjugeret anti-muse-IgM i 30 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af vask med PBS, og endelig monteret i anti-fade-reagens (Molecular Probes) indeholdende 4 ‘, 6-iamidino- 2-phenylindol (DAPI). Objektglassene blev analyseret under anvendelse af et Nikon fluorescensmikroskopi (Nikon, Japan). Den præ-absorberede sekundært antistof alene var også inkluderet som en negativ kontrol til eksperimentet.

DNA fragmentation assay

De dyrkede celler blev høstet, vasket med PBS, lyseret i puffer (10 mM Tris -HCI (pH 7,4), 10 mM EDTA, 0,5% Triton X-100), og inkuberet på is i 10 min. Prøver blev centrifugeret ved 4 ° C i 10 min, og supernatanter blev inkuberet med 200 ug /ml RNase A ved 37 ° C i 1 time. Efterfølgende blev prøverne inkuberet med 200 ug /ml protease K ved 50 ° C i 30 minutter. Efter udfældning med isopropanol blev DNA resuspenderet i en Tris-EDTA-opløsning. Prøver blev løst ved elektroforese på en 2% agarose gel og visualiseret ved ethidiumbromidfarvning og UV-gennemlysning.

Flowcytometrisk analyse af apoptotiske celler

For at identificere apoptotiske celler, pcDNA- eller pcDNA-GM3 -transfectaed HCT116-celler blev behandlet med CDDP i 24 timer. Prøverne blev vasket med PBS, farvet med 1 ug /ml FITC-Annexin V (BD Pharmingen, San Diego, CA) i 10 minutter i mørke ved stuetemperatur og analyseret ved flowcytometri under anvendelse af et FACS Calibur-instrument (Becton-Dickinson )

HPTLC analyse af gangliosiderne

gangliosider fra humane tyktarmskræft celler behandlet med eller uden CDDP (1,5 × 10

7 celler) blev ekstraheret med chloroform:. methanol: vand (2: 1:0.4, vol /vol /vol), og blev fraktioneret og analyseret ved HPTLC anvendelse af silicagel 60-plader (Merck). Pladerne blev fremkaldt med chloroform: methanol: 0,2% vandig CaC

2 (55:45:10, vol /vol /vol). Gangliosider blev visualiseret ved at sprøjte pladen med resorcinol hydrochorid reagens.

Fremstilling og transfektion af små interferens RNA’er (siRNA’er)

An siRNA duplex designet til at målrette den kodende sekvens af human GM3 syntase mRNA og plante klorofyl a /b-bindende protein-mRNA som en negativ kontrol blev syntetiseret ved Bioneer Corporation. Målsekvenserne til GM3 synthase siRNA’er er 5′-GUAUGUAACGAUGUUGUAU-3 ‘, 5′-CAUCAAAGAGACUGCCUUU-3′, og 5’-CAGGUAUAGCGUGGACUUA-3 ‘. HCT116 coloncancer-celler blev transficeret med GM3 synthase siRNAs og negativ kontrol siRNA henholdsvis ved hjælp WelFect-EX ™ PLUS (JBI), ifølge producentens instruktioner. En dag efter transfektion blev transfektionskomplekser fjernet og erstattet med dyrkningsmedium. Efter inkubation med CDDP i dyrkningsmedium i 24 timer blev de transfekterede celler anvendes til yderligere analyse.

Resultater

CDDP inducerer apoptose gennem akkumulering af ROS

For at bestemme evne CDDP at inducere apoptose i HCT116 celler blev celler behandlet med forskellige koncentrationer af CDDP i 24 timer og DNA isoleret fra CDDP-behandlede HCT116-celler blev resolveret ved elektroforese. Som vist i fig. 1, CDDP-induceret DNA-fragmentering. Vi undersøgte også virkningen af ​​CDDP på ​​mitochondrier-afhængig apoptose signaler og ekspressionen af ​​p53 under CDDP-induceret apoptose. Behandling af HCT116 celler med CDDP resulterede i en forøgelse af p53 og Bax ekspression samt reduktionen af ​​Bcl-2-ekspression. Desuden CDDP behandling resulterede i øget kløvning af PARP, hvilket indikerer caspase aktivering ved frigivelse af cytochrom c gennem reduktion af mitochondriemembranpotential (fig. 1B). Som generering af ROS er blevet rapporteret at spille en vigtig rolle i CDDP-induceret cytotoksicitet [24], blev virkningen af ​​CDDP-behandling på intracellulær redox status HCT116 celler vurderes. Vi sammenlignede produktionen af ​​ROS i CDDP-behandlede celler til at i CDDP-ubehandlede celler ved flowcytometrisk analyse ved hjælp af H

2DCFDA. Som vist i fig. 1C, ROS produktionen blev øget i CDDP- behandlede celler sammenlignet med CDDP- ubehandlede celler. Men samtidig behandling med NAC, et ROS inhibitor, sammen med CDDP reducerede akkumuleringen af ​​intracellulær ROS (Fig. 1C). Korreleret med den hæmmende evne til at inducere ROS, NAC var også i stand til signifikant at hæmme celledødssignaler i nærvær af CDDP, som det fremgår af Western blotting. Som vist i fig. 1D, CDDP inducerede ekspressionen af ​​de apoptotiske proteiner Bax og p53 samt induceret PARP-spaltning og den reducerede ekspression af anti-apoptotiske Bcl-2-protein. Disse virkninger af CDDP på ​​humane coloncancer-celler blev blokeret af NAC. Disse resultater viser, at generering af ROS ved CDDP er påkrævet for apoptose af HCT116 celler.

(A) Efter behandling af CDDP i de angivne koncentrationer i 24 timer, blev genomisk DNA isoleret og separeret ved elektroforese på en 2% agarosegel. DNA’et blev farvet med ethidiumbromid og visualiseret under UV-lys. (B) total protein fra HCT116 celler blev isoleret, og immunoblotting blev udført med de angivne antistoffer. (C) HCT116-celler blev behandlet med eller uden 30 ug /ml CDDP efter forbehandling med 10 nM NAC, efterfulgt af udskiftning af dyrkningsmediet med frisk fremstillet medium indeholdende 10 uM DCFH-DA. Efter 30 minutters inkubation ved 37 ° C blev fluorescensintensiteten målt ved flowcytometri. Resultaterne repræsenterer den fold stigning fra deres respektive kontroller (celler ikke behandlet med CDDP), der betragtes som 1. Data repræsenterer middelværdien ± SD af 3 uafhængige målinger.

*** P 0,001 vs. CDDP-behandlet kontrol. (D) HCT116-celler blev behandlet med eller uden CDDP (30 ug /ml) efter forbehandling af NAC (10 nM). Protein blev isoleret fra cellerne og analyseret ved immunoblotting under anvendelse viste antistoffer. GAPDH blev inkluderet som en intern kontrol.

CDDP øger gangliosid GM3 i kolon kræftceller

Tidligere undersøgelser har rapporteret, at celle apoptose er forårsaget af ændringen af ​​membranen sammensætning [13], [14] .Vi undersøgt, om CDDP i HCT116-celler regulerer ekspressionsniveauer af GM2 og GD3 synthase gener og gangliosiderne af GM2 og GD3, men der var ingen ændringer både i parametrene for genekspression (data ikke vist) og gangliosid produktion (fig . 2D). CDDP øgede ekspression af GM3 syntase kun i CDDP-induceret HCT116-celler (Fig. 2A). Ud over dette, undersøgte vi også, om CDDP inducerer ekspressionen af ​​GM3 syntase ved hjælp af andre coloncancerceller såsom DLD-1, LoVo og WiDr. CDDP behandling resulterede i forøget ekspression af GM3 syntase i andre humane coloncancer-cellelinjer (data ikke vist). Vi videre, om ekspression af GM3 syntase i den foreliggende model for human coloncancer HCT116 celler induceres ved anvendelse af andre kemoterapeutiske midler (5-fluoruracil og doxorubicin), som er vel- kendt for at inducere apoptose af forskellige humane cancerceller samt colon cancerceller. Ekspressionen af ​​GM3 syntase blev ikke induceret af både anticancermidler (data ikke vist). Som vist i fig. 2A, mRNA-niveauer af GM3 syntase blev forøget i HCT116 celler induceret af CDDP, som det fremgår af RT-PCR. Derudover undersøgte vi, om promotoraktiviteten af ​​GM3 syntasegenet stimuleres i CDDP-induceret HCT116 celler. For nylig har vi rapporteret CREB transkriptionel regulering af det humane GM3 syntasegenet [23]. For således at bestemme GM3 syntasegen promotoraktivitet af CDDP, GM3 synthase genpromotor (pGL3-1600), blev CREB mutation af GM3 syntase promotoren (pGL3-1600 CREB Mu) og pGL3-basiske plasmider transficeret i HCT116-celler med eller uden CDDP henholdsvis efterfulgt af måling af luciferaseaktivitet under anvendelse af en reporter assay. Som vist i fig. 1B, den transskriptionelle aktivitet af pGL3-1600 i HCT116-celler behandlet med CDDP var betydeligt højere end i de ubehandlede kontrolceller og i pGL3-Basic-transficerede HCT116-celler med eller uden CDDP behandling. Som forventet transkriptionsaktivitet fra CREB-mutanten markant nedsat med omkring to gange sammenlignet med pGL3-1600 promotoren i CDDP-behandlede HCT116 celler. Som vist i fig. 2C, en stigning i gangliosid GM3 produktion blev observeret i HCT1116 celler induceret af CDDP, som påvist ved immunofluorescens assay. Immunofluorescens aktivitet af GM3 i CDDP-behandlede celler blev stærkt detekterbar på en dosis-afhængig måde, mens der i de ubehandlede celler ikke blev detekteret under anvendelse af M2590 som GM3-specifikt monoklonalt antistof og sekundært antistof som negativ kontrol hhv. Desuden undersøgte vi gangliosid mønstre i HCT116-celler behandlet med og uden CDDP hjælp HPTLC-analyse. Interessant, blandt gangliosiderne, gangliosid GM3 blev markant forøget i HCT116-celler behandlet med CDDP sammenlignede ingen CDDP kontrol (fig. 2D). Disse resultater viser klart, at både GM3 syntase ekspression og gangliosid GM3 produktion er forøget i HCT116-celler behandlet med CDDP.

(A) Samlet RNA fra HCT116-celler blev isoleret efter behandling med de angivne koncentrationer af CDDP behandling i 12 h og GM3 syntase mRNA blev påvist ved RT-PCR. (B) HCT116-celler blev transient transficeret med GM3 synthase genpromotor (pGL3-1600) og CREB mutation af GM3 syntase promotoren (pGL3-1600 CREB Mu), og derefter dyrket med eller uden CDDP i 12 timer. Luciferaseaktivitet blev bestemt ud fra cellelysater, som beskrevet i Materialer og Metoder. De viste resultater er middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg med tredobbeltbestemmelse måling.

*** P 0,001 vs. CDDP-behandlet kontrol. (C) HCT116 celler blev dyrket og derefter inkuberet med angivne koncentration af CDDP behandling i 12 timer. Immunoreaktivitet mod gangliosid GM3 blev detekteret under anvendelse af et fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret gede-anti-muse-IgM uden eller med M2590 antistof. (D) De gangliosider isoleret fra HCT116 celler behandlet med CDDP (0, 10, og 30 ug /ml) blev analyseret ved HPTLC.

Nedregulering af gangliosid GM3 ved siRNA targeting GM3 syntase beskytter celle apoptose ved CDDP

Vores tidligere data viste, at CDDP inducerede apoptotiske signal begivenheder gennem ROS produktion og øget ekspression af gangliosid GM3 syntase og dets produkt GM3. For således at bestemme, om den øgede gangliosid GM3 i CDDP-behandlede HCT116-celler var associeret med CDDP-medieret apoptose, vi designet tre siRNA’er rettet specifikt mod GM3 syntase (siGM3). No. 2 og 3, men ikke No. 1 af tre siGM3 klart nedreguleret ekspression af GM3 syntase i CDDP-behandlede HCT116 celler, som bestemt ved RT-PCR-analyse (fig. 3A). Desuden siGM3 2 og 3, men ikke 1 (fig. 3B) genoprettede ekspressionsmønstre for Bax, Bcl-2 og p53 i CDDP-behandlede celler til dem i CDDP-uinducerede celler. Disse resultater antyder, at opregulering af GM3 er påkrævet for apoptose af CDDP-induceret HCT116 celler.

HCT116-celler blev transficeret med tre siRNA rettet mod GM3 og negativ kontrol siRNA. Celler blev derefter dyrket i 12 (30 ug /ml). Total RNA og protein lysater fra cellerne blev fremstillet som beskrevet i Materialer og Metoder. (A) Niveauerne af GM3 syntase mRNA i totalt RNA fra hver celle blev påvist ved RT-PCR. (B) Totalt protein blev fremstillet fra cellerne og analyseret ved western blotting under anvendelse af de angivne antistoffer.

Forøgelsen af ​​gangliosid GM3 i CDDP-behandlede HCT116 celler regulerer 12-lipoxigenase (12-LOX) aktivering for ROS produktion

nervecelledød induceret af glutamat resulterer i ROS produktion gennem 12-LOX-aktivering, og induceret lokalisering af 12-LOX til membranen, som er relateret til aktivering af 12-LOX [25]. Vores kolleger har rapporteret, at 12-LOX er rekrutteret til at glycosphingolipid-berigede mikrodomæner (GEM) i en gangliosid GM3-afhængig måde under oxidativ glutamat toksicitet [21]. Vore data viser, at CDDP-induceret mitokondrier-afhængig apoptose signaler gennem gangliosid GM3-medieret ROS-generering i HCT116-celler (fig. 3 og fig. 4A). Undersøgte vi derfor, om en specifik inhibitor af 12-LOX, baicalein inhiberer 12-LOX aktivitet for ROS-produktion i HCT116 celler, der udtrykker gangliosid GM3 induceret af CDDP. Som vist i fig. 4B, CDDP-induceret GM3 syntase ekspression og ROS-produktion. Imidlertid baicalein undertrykte CDDP-stimuleret ROS produktion, selv GM3 syntase ekspression induceret af CDDP ikke blev reguleret af baicalein. Endvidere ROS scavenger NAC, inhiberede ROS-generering, men ikke GM3 syntase i CDDP-behandlede HCT116 celler. Disse resultater tyder på, at CDDP-induceret gangliosid GM3 udtryk kan regulere 12-LOX aktivitet for ROS produktion gennem 12-LOX rekruttering til GEM.

(A) HCT116 celler blev transficeret med siRNA rettet mod GM3 og negativ kontrol siRNA. Cellerne blev derefter dyrket i 12 timer i nærvær eller fravær af CDDP (30 ug /ml). Dyrkningsmediet blev udskiftet med frisk fremstillet medium indeholdende 10 uM DCFH-DA. Efter 30 minutters inkubation ved 37 ° C blev fluorescensintensiteten målt ved flowcytometri. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af 3 uafhængige målinger.

** P 0,01 og

*** P 0,001 vs. CDDP-behandlet kontrol. ns: ingen betydning. For RT-PCR, blev totalt RNA og protein lysater fra cellerne fremstillet som beskrevet i Materialer og Metoder. Niveauerne af GM3 syntase mRNA i totalt RNA opnået fra hver celle blev detekteret ved RT-PCR. (B) HCT116-celler blev behandlet med eller uden 30 ug /ml CDDP efter forbehandling af 10 nM NAC eller 1 uM baicalein, og derefter dyrkningsmediet blev erstattet med frisk fremstillet medium indeholdende 10 uM DCFH-DA. Efter 30 minutters inkubation ved 37 ° C blev fluorescensintensiteten målt ved flowcytometri. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af 3 uafhængige målinger.

*** P 0,001 vs. CDDP-behandlet kontrol. For RT-PCR, blev totalt RNA og protein lysater fra cellerne fremstillet som beskrevet i Materialer og Metoder. Niveauerne af GM3 syntase mRNA i total RNA fra hver celle blev påvist ved RT-PCR.

CDDP-induceret apoptose er forbedret i HCT116 celler, der overudtrykker GM3 syntase

For at undersøge følsomheden af ​​CDDP-medieret apoptose mellem HCT116 celler og HCT116 celler, der overudtrykker GM3 syntase, genereret vi stabile transfektanter, der udtrykker GM3. PcDNA3-GM3 ekspressionsvektor, der huser det humane GM3 syntase cDNA (HCT116 /GM3) og pcDNA3 tom vektor (mock) blev transficeret ind HCT116 celler. Efter selektion af G418-resistente kolonier, bekræftede vi, at ekspressionen af ​​GM3 syntase mRNA og gangliosid GM3 blev højt udtrykt i HCT116 /GM3 celler sammenlignet med mock-transficerede celler, som påvist ved RT-PCR og immunofluorescens assay (fig. 5A). Disse resultater viser, at enzymatisk aktiv GM3 syntase syntetiseres i HCT116 /GM3 celler. Under normale dyrkningsbetingelser (10% FBS), at vækstraten for HCT116 /GM3 celler var ikke forskellig sammenlignet med kontrolceller, og ændringer i apoptotiske signaler blev ikke observeret i disse celler, som påvist ved Western blot-analyse (data ikke vist). Hvis disse transfektanter blev behandlet med CDDP på ​​en dosis-afhængig måde, højere antal celler dissocieret fra pladen i HCT116 /GM3 sammenlignet med mock-celler behandlet med 30 ug /ml CDDP. Faktisk blev HCT116 /GM3-celler vist at være mere følsomme over for CDDP end mock celler i cellevækstinhibering hvilket fremgår af XTT-assay (fig. 5B). Desuden blev en stigning i DNA-skade efter CDDP eksponering set i HCT116 /GM3-celler sammenlignet med mock-behandlede celler under anvendelse af en DNA-fragmentering analyse (fig. 5C). Da Annexin V pletter vendt ud phosphatidylserin på den ydre side af plasmamembranen, spejlvende ud af phosphatidylserin fra indersiden til ydersiden af ​​plasmamembranen er kendt for at være en af ​​egenskaberne af apoptotiske celler. I den foreliggende undersøgelse, som vist i fig. 5D, annexin V-positive celler målt ved flowcytometri blev også signifikant forøget i CDDP-behandlede HCT116 /GM3 celler sammenlignet med mock-celler. For at undersøge den molekylære mekanisme, der ligger den sensibiliserende effekt af GM3 i CDDP-induceret cytotoksicitet, blev caspase-medierede PARP nedbrydning ved reduktion af mitokondriepotentiale undersøgt efter CDDP behandling i forskellige koncentrationer (fig. 5e). Western blot analyse viste, at spaltningen niveau af PARP i HCT116 /GM3 celler blev forøget sammenlignet med mock-celler. Disse resultater antyder, GM3 sensibiliserer HCT116 celler til CDDP-induceret apoptose. Vores resultater viste, at ROS spiller en central rolle i CDDP-induceret HCT116 celler, hvilket fører til celle apoptose. Vi sammenlignede produktionen af ​​ROS i HCT116 /GM3 celler til, at der i mock celler ved flowcytometrisk analyse ved hjælp af H

2DCFDA. Som vist i fig. 5F, CDDP-induceret ROS-produktion blev forøget i HCT116 /GM3-celler sammenlignet med mock-celler, men ikke i NAC-forbehandlede celler, hvilket indikerer, at der kræves en forøgelse af GM3 niveauer for ROS-produktion i CDDP-induceret apoptose af HCT116 celler. Disse data viser, at ROS produktion er afhængig af GM3 niveauer i CDDP-induceret HCT116 celler.

(A) RT-PCR og immunofluorescensbestemmelse bekræftede ekspression af GM3 syntase og dens GM3 produkt i en stabil transfektant af pcDNA- GM3 i HCT116-celler. Som kontrol gjorde vektor alene (pcDNA) transficerede HCT116 ikke udtrykke GM3. Mock, vektor (pcDNA3) transficerede celle HCT116 /GM3, pcDNA3-GM3-transfekterede celler. (B) Cellelevedygtighed blev vurderet 24 timer efter CDDP behandling i de angivne koncentrationer ved hjælp XTT-assay i HCT116 /GM3-celler sammenlignet med mock-behandlede celler. Data er middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg. (C) Efter behandling af CDDP i de angivne koncentrationer i 24 timer, blev genomisk DNA analyseret på en 2% agarosegel. (D) Apoptotiske cellepopulationer blev målt ved FACS Calibur-analyse under anvendelse af Annexin V-farvning som beskrevet i Materialer og Metoder. Pile viser apoptotiske populationer i mock og HCT116 /GM3 celler. (E) HCT116 /GM3 eller mock-celler blev behandlet med angivet koncentrationerne af CDDP i 12 timer. Hel-cellelysater og supernatant medier blev fremstillet og analyseret ved immunoblotting som beskrevet i Materialer og Metoder, anvendelse af de angivne antistoffer. (F) Virkningen af ​​CDDP-behandling blev målt på fluorescens fordeling af DCFH oxidation i HCT116 /GM3 eller mock celler. Som vist i fig.