PLoS ONE: BCAR1 Protein Afspiller vigtige roller i Carcinogenese og forudser dårlig prognose i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Målsætning

Vores tidligere undersøgelse foreslog de potentielle kliniske implikationer af BCAR1 i ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) (Mol Diagn Ther 2011. 15 (1):. 31-40). Heri ønsker vi at evaluere den prædiktive magt BCAR1 som markør for dårlig prognose i NSCLC tilfælde, kontrollere de kræftfremkaldende roller BCAR1 i A549 lunge adenocarcinom cellelinje, og vidner om BCAR1 /phospho-p38-aksen.

Metoder

Mellem januar 2006 og juni 2010 var der i alt 182 patienter med NSCLC (151 sager med tilgængelige opfølgning data, og 31 sager tabte til opfølgning på grund af den ugyldige kontaktoplysninger). Vi inspiceret BCAR1, phospho-BCAR1 (Tyr410), phospho-p38 (Thr180 /Tyr182) og p38-ekspression i NSCLC væv og matches tilgrænsende normale væv ved immunoblotting og IHC. Efter BCAR1 -RNA indblanding i A549 celler, vi inspiceret proteinekspression (BCAR1, phospho-BCAR1, phospho-p38 og p38) og udførte cellebiologiske forsøg (cellevækst, migration og cyklus).

Resultater

BCAR1 blev overudtrykt i NSCLC væv (177/182) og cellelinjer (A549 og Calu-3). Det blev imidlertid ikke påvist i den normale tilstødende væv i 161 af de 182 sager. Højere BCAR1 niveauer blev stærkt forbundet med dårligere differentierede NSCLC og forudsagde dårligere prognose. BCAR1 knockdown forårsaget cellevækst anholdelse, celle migration hæmning og cellecyklus anholdelse af A549 celler. Overekspression af BCAR1 var forbundet med aktivering af p38 i NSCLC tilfælde, og BCAR1 knockdown forårsagede reduktion af phospho-p38-niveauer i A549 celler.

Konklusion

Overekspression af BCAR1 er en indikator for dårlig prognose i NSCLC og spiller vigtige roller i kræftfremkaldende carcinogenese, sandsynligvis via aktivering af p38 MAPK. Imidlertid er yderligere undersøgelser nødvendige straks

Henvisning:. Huang W, Deng B, Wang R-W, Tan Q-Y, han Y, Jiang Y-G, et al. (2012) BCAR1 Protein Afspiller en vigtig rolle i Carcinogenese og Forudsiger dårlig prognose i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 7 (4): e36124. doi: 10,1371 /journal.pone.0036124

Redaktør: Keiran Smalley, The Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: 16. december 2011; Accepteret: 26 mar 2012; Udgivet: 27 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC) (nr 81.101.782), NSFC projektet CQ CSTC (nr CSTC2011BB5020), og NSFC Third Military Medical University (nr 2010XQN36). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hvert år er der 1,35 millioner nye lungekræfttilfælde i verden [1]. Worldwide, Lungekræft er den hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald [2]. På grund af de indviklede biologiske funktioner, prognose af lungecancer er stadig meget dårlig [1]. Derfor er det afgørende at afsløre de biologiske funktioner af sygdommen af ​​hensyn til forbedring af terapeutisk effekt [3].

Brystkræft anti-østrogen modstand 1 (BCAR1), også med titlen p130cas, var en af ​​CAS protein (Crk-associeret substrat) familiemedlemmer. Det blev oprindeligt identificeret som et cellulært protein migrerede ved 130 kDa og at være hyperphosphoryleret ved v-Crk og v-Src transformerede celler [4], [5]. Indledningsvis blev intensive undersøgelser fokuseret på sammenhængen mellem brystkræft og BCAR1 [6], [1], [7], [8]. For eksempel Brinkman et al. [7] foreslog BCAR1 overekspression i ZR-75-1 brystcancercellelinje gør antiøstrogen resistens til cellerne. Endvidere Dorssers et al. [8] rapporterede, at BCAR1 udtryk omvendt var relateret til tilbagefald overlevelse og samlet overlevelse tid for brystkræft.

For nylig vores undersøgelse foreslog der er en klinisk implikation af BCAR1 i ikke-småcellet lungecancer ( NSCLC) [9]. Vi undersøgte serum BCAR1 niveauer i 80 NSCLC tilfælde og 80 raske kontroller, henholdsvis ved hjælp af et specifikt enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) [9]. Interessant nok fandt vi, at serum BCAR1 niveauer signifikant højere i NSCLC end i kontrolgruppen steg gradvist med progressionen af ​​tumoren mellemstationer, og faldt efter fjernelse af maligne læsioner [9]. Men de onkogene mekanismer BCAR1 i NSCLC er stadig de gåder.

Heri gennemførte vi de yderligere undersøgelser for at evaluere den prædiktive magt BCAR1 som biomarkør for dårlig prognose i NSCLC patienter. Og vi verificeret kræftfremkaldende roller BCAR1 via RNA-interferens (RNAi) i A549 lunge adenocarcinom cellelinje. Forsøg in vivo og in vitro demonstreret den lukkede korrelation mellem BCAR1 ekspression og aktivering af p38, som er en afgørende gren af ​​MAPK (mitogenaktiveret proteinkinase) pathway [10], [11].

Materialer og metoder

Patienter

undersøgelsen protokol blev revideret og godkendt af Research Ethics Board i Daping hospital (Chongqing City, PRChina) [reference nr. TMMU-DPH /2006-012], og informeret samtykke blev skrevet og fået fra alle patienter.

I den gennemførte undersøgelse fra januar 2006 og juni 2010 var der i alt 182 patienter med NSCLC. Pulmonal neoplasma blev diagnosticeret radiografisk og bekræftet af patologi. Ingen af ​​patienterne havde fået behandling før indskrivning i undersøgelsen. De demografiske og klinisk-patologiske karakteristika patienter er vist i tabel 1. Alle patienter gennemgik lobectomy og lymphadenectomy. Et hundrede og tredive fem patienter modtog postoperativ adjuverende kemoterapi (paclitaxel plus nedaplatin). Postoperativ opfølgning var tilgængelig i 151 sager via telefon eller brev interview, og 31 sager tabte til opfølgning på grund af den ugyldige kontaktoplysninger.

Cell Culture

A549 og Calu -3 lungeadenocarcinom cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection og dyrket i RPMI1640 /10% FBS, henholdsvis

RNA-interferens af BCAR1

Først blev følgende oligoribonukleotid parvis anvendt.: 5’CCGGGGTCGACAGTGGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACCACTGTCGACCTTTTTTg-3 ‘og 5′-AATTCAAAAAAGGTCGACAGTGGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACCACTGTCGACC-3’. Fulde sekvenser blev afledt fra sekvensen af ​​human BCAR1 mRNA. Oligonucleotiderne blev opnået fra Sunbio Medical Biotechnology CO., Ltd (Shanghai City, P.R.China). De komplementære to strenge (hver ved 20 uM) i 60 pi annealing buffer (Sunbio Medical Biotechnology CO., Ltd, Shanghai City, P.R.China) blev opvarmet i 5 minutter ved 95 ° C og derefter inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Derefter blev GFP-mærkede lentiviral vektor pLVT351.LV for BCAR1-RNAi konstrueret ved at indsætte udglødning nukleotider i Age I + EcoR I stedet for pMAGic 4.1 (Sunbio Medical Biotechnology CO., Ltd, Shanghai City, PRChina).

andet blev A549-cellelinje udpladet ved 2,3 x 10

5 celler per brønd af 24-brønds celledyrkningsplade og inficeret med lentivirus ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10. celler inficeret med pLVT351- LV og CMV-GFP-LV (blank lentivirusvektor, pMAGic 4.1) blev udnævnt som A549-BCAR1-RNAi og A549-negativ kontrol, henholdsvis.

Western Blotting analyse af BCAR1, phospho-BCAR1, phospho-p38 og p38 i NSCLC væv og celler

NSCLC og matchede tilstødende normale væv (mindst 5 cm væk fra de primære tumorer) var tilgængelige fra i alt tres (herunder 35 adenocarcinomer og 25 planocellulært karcinom) tilfælde for western blotting . Under operationerne blev prøverne indsamlet af teknikerne omgående følgende flytninger. Desuden har vi også forberedt de cellelinjer, herunder Calu-3, A549, A549-negative kontrol og A549-BCAR1-RNAi.

Derefter blev lysater fra væv og cellelinjer udarbejdet i en RIPA buffer omfattende 50 mM Tris HCI pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% deoxycholsyre og 0,02% natriumazid. Protein- koncentrationer blev bestemt med et BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL).

Proteiner blev denatureret ved 95 ° C i 5 minutter, og 50 ug protein per bane blev løst ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) under anvendelse af 10% polyacrylamidgel. Proteiner blev blottet på polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Thermo), som derefter blev blokeret med 5% skummetmælk i 1 time ved stuetemperatur. Proteinerne blev immunoblottet ved anvendelse af anti-BCAR1 antistof (BD Transduction Laboratories, USA, 1:1000), anti-phospho-BCAR1 (Tyr410) antistof (Abcam, USA, 1:1000), anti-p38 (BD Transduction Laboratories materiale, USA , 1:1000) og anti-phospho-p38 (Thr180 /Tyr182) antistof (cellesignalerende Transduction Laboratories, USA, 1:1000). En anti-β-actin (Sigma) eller GAPDH (Sigma) antistof fungerede som kontrolgruppe.

Grå skalaer for immunoblotting af NSCLC og matches tilgrænsende normale væv blev kvantitativt analyseret ved hjælp af billedfangst og analysesoftware (Image Lab software, Bio-Rad, USA) ifølge producentens instruktioner.

Tissue microarray konstruktion og immunhistokemisk (IHC) analyse af BCAR1, phospho-BCAR1, p38 og phospho-p38 i NSCLC væv

Den hematoxylin og eosin (H +, Svag position ( 25%); ++, Moderat position ( 50%); +++, Stærk position (≥50%). ” 25%” blev klassificeret som lav udtryk, ellers så høj ekspression Tre observatører gennemføres med score dias og middelværdier blev opnået endelig

TDT-medieret dUTP nick ende mærkning assay (TUNEL) af.. NSCLC væv

Vi har udført TUNEL-assay i vævssnit af alle de 182 tilfælde. Apoptose i tumoren blev inspiceret med in situ Celledød Detection kit, POD (Roche, Tyskland). vævssnit blev afparaffiniser i xylen, og hydreret gennem gradueret ethanol og forbehandlet med mikroovn antigen-genvinding (citratbuffer, pH 7,5). Endogen peroxidase blev blokeret med 0,3% H

2O

2 i methanol i 15 min. Derefter vævssnit blev behandlet med 3% bovint serumalbumin i 30 minutter og inkuberet med TUNEL reaktionsblandingen. (TDT: dUTP, 1:20) i 45 minutter ved 37 ° C Vævssnit blev kombineret med konverter-POD, efterfulgt af vask og DAB (Zhong Shong, Kina) farvereaktion . Under TUNEL proceduren blev snit vasket i phosphatpuffer saltvand (PBS). Vævssnit blev modfarvet ved hæmatoxylin, dehydreret gennem gradueret ethanol, ryddet i xylen, og monteret. For negative kontroller blev deioniseret vand anvendt i stedet for TDT. Positive kontroller bestod af betændt menneskelig tonsil. Celler blev betragtet som positive, når intens brun reaktivitet blev påvist i kerner. Apoptotisk indeks blev beregnet procentdelen af ​​nukleare positiv plet i 1000 celler i fem forskellige steder i hver sektion på et 400 x forstørrelse.

Real-time RT-PCR

For at evaluere effekten af ​​RNAi af BCAR1 udførte vi kvantitativ real-time RT-PCR i A549-BCAR1-RNAi og A549-negative kontrolceller. Enten af ​​cellerne blev podet i en koncentration på 1 x 10

5cells /brønd i 6-brønds plader. Efter to dage podning blev totalt RNA ekstraheret fra celler under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen). Første-streng cDNA blev syntetiseret med M-MLV-transkriptase (Promega) og oligo dT. Real-time PCR blev udført under anvendelse af SYBR Green PCR Master Mix (TAKARA) og ABI Prism 7000 Detektionssekvensen systemet (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR-primere blev anvendt som followings: 5′-CAATGCCTCACTGCTCTT-3 ‘og 5′-GTAGTCATAGTCCTCCATC-3’. Specificiteten af ​​detekterede signaler blev bekræftet ved en dissociationskurven bestående af en enkelt top. Alle prøver blev kørt in duplo i hvert forsøg. Værdier blev normaliseret ved menneskelig β-actin.

Cell Growth Assay

For evaluering af cellevækst, blev A549-negative kontrol og A549-BCAR1-RNAi celler forgyldt på 2,0 × 10

2 brønd i seks-brønds plader hhv. Og enten af ​​cellerne blev inspiceret og fotograferet efter Giemsa-farvning, elleve dage efter udpladning.

cellemigrationsassay

Til vurdering af cellemotilitet blev kammer migration assays udført under anvendelse af en celledyrkningsinsert ( 8-um porestørrelse, 24-brønds format; celleinvasion Assay Kit Cat CHEMICON, nr ECM550).. A549-negativ kontrol og A549-BCAR1-RNAi-celler blev podet i to eksemplarer til en tæthed på 3,0 x 10

5 celler /kammer. Efter 48 timer blev celler, som ikke var flyttet til de nedre brønde fjernet fra den øvre flade af filtrene ved hjælp af vatpinde, og celler, der var flyttet til den nedre overflade af filteret blev farvet ved anvendelse af et Cell Invasion Assay Kit Cat. (CHEMICON, Nr ECM550). Cellemigrering kvantificeret ved visuel tælling efter at være blevet fotograferet. Eksperimenter blev udført i dobbeltbestemmelse. Middelværdier for tre tilfældige felter blev opnået for hver brønd.

Cell Cycle Analyser

Til flowcytometrisk bestemmelse af cellecyklus, 2,0 × 10

6 af A549-negative kontrol celler og A549 -BCAR1-RNAi-celler blev fikseret i 70% ethanol og farvet med propidiumiodid, hhv. De farvede celler blev analyseret på en FACScan flowcytometer for relative cellecykler. Eksperimenter blev udført i to eksemplarer.

celleapoptosen Analyser

Vi evaluerede celle apoptose ved hjælp FACScan flowcytometer. 2,0 × 10

6 af A549-negative kontrol celler (48 timer efter transient transfektion), A549-negative kontrol celler (stabil transfektion), A549-BCAR1-RNAi celler (48 timer efter transient transfektion) og A549-BCAR1-RNAi celler (stabil transfektion) blev fikseret i 70% ethanol og farvet med propidiumiodid, hhv. De farvede celler blev analyseret på en FACScan flowcytometer til relativ celle apoptose. Eksperimenter blev udført i to eksemplarer.

Dataanalyse

Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af t-test, Mann-Whitney U test, Kruskal-Wallis test,

X

2 test og Spearmans rho hhv. Død af enhver årsag var medtaget i beregningen af ​​postoperative overlevelse. Sygdommen specifik overlevelse blev beregnet af Kaplan-Meier-metoden og analyseret ved log-rank test. Prognostiske faktorer blev undersøgt ved univariate og multivariate analyser ved hjælp af en Cox proportionel risiko model. Alle de førnævnte beregninger blev udført under anvendelse af SPSS version 11.0 software til Windows (SPSS, Inc., Chicago, USA). En værdi på p 0,05 (tosidet) blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

BCAR1 er overudtrykt i NSCLC væv og cellelinjer

blev opdaget BCAR1 udtryk (enten. i kernen, cytoplasmaet eller begge) i 57 af de 60 NSCLC tilfælde ved hjælp immunblotting (figur 1a), og 177 af de 182 NSCLC tilfælde ved hjælp IHC assay (figur 1c) hhv. Det blev imidlertid ikke påvist i den normale tilstødende væv i 53 af de 60 tilfælde ved hjælp immunblotting (figur 1a), og 161 af de 182 sager ved hjælp IHC assay (figur ikke vist), henholdsvis. Analyse af gråtoner af immunoblotting foreslog også BCAR1 niveauer signifikant højere i NSCLC end i den normale tilstødende væv (48,2 ± 24,7 vs 11,0 ± 9,8, t-test,

P

0,001, figur 1b).

A: Immunoblotting angivet enten BCAR1 eller phospho-p38 (Thr180 /Tyr182) niveauer i tre NSCLC væv (C) var signifikant højere end i de tilstødende normale væv (N). Men phospho-BCAR1 (Tyr410) og p38 niveauer i NSCLC og de tilstødende normale væv var ens. BCAR1, phospho-BCAR1, p38 og phospho-p38 udtryk blev også påvist i A549 og Calu-3 NSCLC cellelinie ved hjælp Immunoblotting assay. BCAR1 knockdown forårsager mærkbare reduktion af phospho-BCAR1 og phospho-p38-niveauer i A549 celler. B: Grå skalaer analyse af immunoblotting også foreslået BCAR1 og phospho-p38 (Thr180 /Tyr182) niveauer signifikant højere i NSCLC end i den normale tilstødende væv (48,18 ± 24,7 vs 10,97 ± 9,8,

P

0,001 ; 16,03 ± 5,8 vs 28,82 ± 8,0,

P

0,001). Men phospho-BCAR1 (Tyr410) og p38 ikke havde tendens (20,72 ± 6,4 vs 24,37 ± 7,5,

P

= 0,22; 25,3 ± 11,2 vs 27,8 ± 15,2,

P

= 0,476 ). C: IHC foreslog udtryk for BCAR1 (enten i kernen, cytoplasmaet), phospho- BCAR1 (tilbøjelige til at finde i cytoplasmaet), phospho-p38 (tilbøjelige til at finde i kernen), p38 (tilbøjelige til at finde i cytoplasmaet ) og apoptotiske legemer. Bemærk: N (tilgrænsende normalt væv); C (NSCLC væv); ** (

P

0,001); # (

P

0,05).

Men phospho-BCAR1 (Tyr410) blev påvist i cytoplasma i 29 af de 60 NSCLC ved hjælp Immunoblotting (figur 1a), og 32 tilfælde af de 182 NSCLC tilfælde ved hjælp af IHC assay (figur 1c), hhv. Det blev imidlertid også påvist i den normale tilstødende væv i 30 af de 60 tilfælde ved hjælp immunblotting (figur 1a), og 34 af de 182 sager ved hjælp IHC assay (figur ikke vist), henholdsvis. Analyse af gråtoner af immunoblotting foreslog var der ingen mærkbar forskel på BCAR1 niveauer i mellem NSCLC og den normale tilstødende væv (25,3 ± 11,2 vs 27,8 ± 15,2,

P

= 0,476, t-test, Figur 1b) .

BCAR1 og phospho-BCAR1 (Tyr410) blev påvist i A549 og Calu-3 NSCLC celler ved hjælp af immunblotting assay (figur 1a).

Højere BCAR1 niveauer er stærkt korreleret med mere dårligt differentieret tumorer og forudser dårligere prognose

Ved at bruge IHC-analysen i de 182 NSCLC sager, fandt vi, at højere BCAR1 niveauer var stærkt korreleret med mere dårligt differentiering. (Kruskal-Wallis test,

P

= 0,01; tabel 1). Der var imidlertid ingen mærkbar korrelation mellem BCAR1 og andre klinisk-patologiske karakteristika, herunder alder, køn, histologi, TNM stadie, tumorstørrelse og lymphonode metastase (tabel 1). Trods BCAR1 ekspression blev detekteret enten i cytoplasmaet, kernen, eller begge i NSCLC, der ikke var nogen mærkbar sammenhæng mellem placeringen protein og kliniske-patologiske parametre (data ikke vist). Desuden var der ingen signifikant sammenhæng mellem phospho-BCAR1 og de kliniske-patologiske egenskaber (data ikke vist).

overlevelsesraten for BCAR1 høj udtryk gruppen var signifikant lavere end lav-udtryk gruppe (

P

= 0,001, figur 2a). Multivariat analyse viste, at BCAR1 niveauer (hazard ratio 1,777,

P

= 0,028), lymphonode metastaser (hazard ratio 1,277,

P

= 0,040) og TNM stadie (hazard ratio 1,298,

P

= 0,007) var betydelige og uafhængige prognostiske indikatorer for NSCLC tilfælde (tabel 2)

A:. overlevelsesraten for BCAR1 højt udtrykte gruppe var signifikant lavere end for lavt udtrykte gruppe (

P

= 0,001). B: Phospho-p38 positive celler var signifikant og positivt korreleret med procentdele af BCAR1 positive celler, i de 182 NSCLC væv (Spearman Rho, korrelationskoefficient = 0,811, p 0,001). Og procenter af phospho-p38 positive celler i BCAR1 høj-udtrykte væv var betydeligt højere end i lav-udtrykte væv (Mann-Whitney U test z = -3,689

P

0,001). C: De sekventielle sektioner blev farvet for BCAR1, phospho-BCAR1, phospho-p38 og p38, der viste, at cellerne over-udtrykkende BCAR1 har også et højere niveau af phospho-p38 (× 200). Enten phospho-BCAR1 eller p38 var svagt positivt.

BCAR1 knockdown forårsager cellevækst anholdelse, celle migration hæmning og cellecyklus anholdelse af A549 celler

Vi etablerede humane NSCLC kræft A549 celler, stabilt udtrykt pLVT351-LV (A549-BCAR1-RNAi-celler) og CMV-GFP-L.V. (A549-negative kontrolceller) ved brug af et lentivirus system. Mindst en reduktion i mRNA niveauer af BCAR1 i A549-BCAR1-RNAi-celler 80% blev bekræftet ved real-time RT-PCR (figur 3a) og Western Blotting-analyse (figur 1a), hhv. Samtidig kan vi se hæmning af phospho-BCAR1 sammen med BCAR1 knockdown (figur 1a)

A:. Mindst en 80% reduktion i mRNA af BCAR1 i A549-BCAR1-RNAi celler blev bekræftet af real- tid RT-PCR. B: kolonidannende enheder af A549-BCAR1-RNAi var påviseligt mindre end af A549-negative kontrol celler, elleve dage efter plating. C: cellemigrationsassay foreslog BCAR1 knockout forhindrede cellemigrering af A549-BCAR1-RNAi-celler. D: Flowcytometri angivet BCAR1 knockout også forårsaget cellecyklusstop af A549-BCAR1-RNAi celler. E:. Flowcytometri angivet BCAR1 knockout steg ikke apoptose sats efter enten forbigående (39,1% vs. 42,1%) eller stabil transfektion (0,33% vs. 0,4%) i A549 celler

Figur 3b foreslåede kolonidannende enheder af A549-BCAR1-RNAi-celler var påviseligt mindre end af A549-negative kontrolceller, elleve dage efter udpladning (figur 3b). Cellemigrationsassay foreslog BCAR1 knockdown forhindrede cellemigrering af A549-BCAR1-RNAi-celler (figur 3c). Og flowcytometri angivet BCAR1 knockdown også forårsaget cellecyklusstop af A549-BCAR1-RNAi-celler (figur 3d).

BCAR1 negativt korreleret til apoptotisk indeks i NSCLC væv. Dog kan BCAR1 knockdown ikke øge apoptose i A549 celler

Apoptotiske organer blev detekteret i alle de 182 NSCLC væv (figur 1c). Blandt de væv, der var en betydelig og omvendt korrelation mellem BCAR1 og apoptotisk indeks (Spearman Rho, korrelationskoefficient = -0,183;

P

= 0,013). Apoptotisk indeks i BCAR1 højt udtrykte væv var væsentligt lavere end i BCAR1 lavt udtrykte væv (t-test t = 2,312

P

= 0,022).

Men i sammenligning med negativ kontrol celler, har BCAR1 knockout ikke øge apoptose sats efter enten forbigående (39,1% vs. 42,1%) eller stabil transfektion (0,33% vs. 0,4%) i A549-celler (figur 3e).

Overekspression af BCAR1 er korreleret med aktivering af p38 i NSCLC tilfælde og BCAR1 knockdown forårsager reduktion af phospho-p38 i A549 celler

phospho-p38-ekspression blev påvist i 31 af de 60 NSCLC sager ved hjælp af immunoblotting (figur 1a), og 91 i 182 NSCLC tilfælde (tilbøjelige til at finde i kernen) ved hjælp af IHC assay (figur 1c). Svarende til udviklingen i BCAR1 niveauer, grå skalaer analyse viste phospho-p38 niveauer signifikant højere i NSCLC end i de normale tilstødende væv (16,03 ± 5,8 vs 28,82 ± 8,0,

P

0,001; Figur 1b) . Men p38 havde ikke den tendens (20,72 ± 6,4 vs 24,37 ± 7,5,

P

= 0,22) (Figur 1b). Desuden IHC foreslog positive sats på enten BCAR1 eller phospho-p38 var væsentligt højere i NSCLC end i normalt væv (

P

0,001 og P 0,001 henholdsvis) (tabel 1). Men p38 havde ikke sådan tendens (

P

= 0,62).

Vi fandt procentdele af phospho-p38 positive celler var signifikant og positivt korreleret med de BCAR1 positive celler, i alle 182 NSCLC væv (Spearman Rho, korrelation koefficient = 0,811, p 0,001; figur 2b). Og procentdele af phospho-p38 positive celler i BCAR1 høj-udtrykte væv var betydeligt højere end i BCAR1 lavt udtrykte væv (Mann-Whitney U test z = -3,689

P

0,001; figur 2b). Men der var ikke nogen sammenhæng mellem phospho-BCAR1 og phospho-p38-niveauer (P = 0,892).

I et forsøg på at skildre stærk korrelation mellem BCAR1 positive og phospho-p38 positive celler, vi præsenterede den sekventielle sektioner farves i et tilfælde for BCAR1, phospho-BCAR1, phospho-p38 og p38, der viste, at cellerne over-udtrykkende BCAR1 har også et højere niveau af phospho-p38 (figur 2c).

BCAR1 niveauer i Calu-3 celler var påviseligt højere sammenlignet med A549-celler (Figur 1a). Interessant, figur 1a foreslog phospho-p38-niveauer også havde samme tendens. Desuden BCAR1 knockdown forårsager også den betydelige reduktion af phospho-p38 overflod i A549-celler (figur 1a).

Diskussion

BCAR1 som adapter protein lokaliseret til kromosom 16q22-q23

7 , og hovedsagelig består af fire funktionelle dele, herunder en aminoterminal Src homologi 3 (SH3) -domæne, et Src-bindende domæne (SBD), en stor substrat domæne (SD) og en helix-loop-helix domæne (HLH) [12 ], [13]. BCAR1 lokaliserer allestedsnærværende in vitro og in vivo [14], [15], [16], og er involveret i forskellige cellulære processer, herunder migration, kemotaksi, apoptose, cellecyklus, differentiering og så videre [17], [18].

Indtil videre meget få studier fokuseret på carcinogenese af BCAR1 i lungekræft. Wei et al. [19] foreslog, at forankringsuafhængig phosphorylering af BCAR1 beskyttet lungeadenocarcinom celler fra anoikis. For nylig vores undersøgelse antydede, at serum BCAR1 niveauer signifikant højere i NSCLC end i kontrolgruppen steg gradvist med progressionen af ​​tumoren mellemstationer, og faldt efter fjernelse af maligne læsioner [9]. Som et resultat, vi formodes en roman onkogen rolle BCAR1 i NSCLC. Heri, vi havde til formål at kontrollere de kliniske implikationer af BCAR1 overekspression og NSCLC, og for at belyse de carcinogene mekanismer BCAR1 i NSCLC. Som forventet fandt vi BCAR1 protein er især rigelige i NSCLC celler og væv. Og vores undersøgelser in vivo og in vitro viste den tætte sammenhæng mellem BCAR1 udtryk og aktivering af p38 MAPK. Selvom tidligere undersøgelser har vist, at tyrosinphosphorylering af BCAR1 kan være kritisk for nedstrøms signalering [20], vores undersøgelse viste, at phospho-BCAR1 (Tyr410) blev påvist i kun 34 af de 182 sager, og ikke korreleret med klinisk-patologiske karakteristika. Hidtil er mange steder af humant BCAR1 phosphorylering findes som: tyrosin-rester aa 12, 128, 165, 192, 222, 224, 234, 249, 267, 287, 306, 327, 362, 372, 387, 410, 653, 664, 666; serin-rester aa 134, 139, 292, 437, 639; og threonin-rester aa 269, 326, 385. Vi formoder, at nogle bestemte steder af phosphorylering er kritiske for signalet kaskader af BCAR1 i NSCLC. Interessant nok tilstødende normale væv viser meget højere niveauer af phospho-BCAR1 end af BCAR1 proteiner (figur 1a). Vi bekræftede også inhibering af phospho-BCAR1 sammen med BCAR1 knockdown i et forsøg på at verificere effektiviteten af ​​dette antistof. Vi formoder, at en særlig enzym i lungevæv specifikt nedbryder Ikke-phospho-BCAR1 dog phospho-BCAR1 kan overleve. Og alle de ovennævnte hypoteser fortjener yderligere flere undersøgelser.

Vores eksperimenter in vitro viste, at BCAR1 knockdown i A549 celler forårsaget cellevækst anholdelse, cellecyklus anholdelse og cellemigration hæmning. Selv BCAR1 knockdown i A549 celler ikke forårsagede celle apoptose, var der en mærkbar og omvendt korrelation mellem BCAR1 og apoptotisk indeks i NSCLC væv. Vi kender ikke årsagerne til uoverensstemmelse mellem NSCLC celler og væv. Derudover vores undersøgelse in vivo viste, at BCAR1 niveauer blev betydeligt, og omvendt korreleret med tumor differentiering, ved enten tælle positive procenter af celler (Kruskal-Wallis test,

P

= 0,010) eller vurdere farves intensitet (achromasy = 0 , stramineous = 1, buffy = 2, brun = 3; Kruskal-Wallis test,

P

= 0,014). Kaplan-Meier-kurve anførte også, at højere niveauer af BCAR1 forudsagde dårligere prognose i 151 sager med gyldige opfølgende data. Alle de førnævnte eksperimenter foreslog BCAR1 havde en afgørende rolle i carcinogenese. Desuden er BCAR1 kendt som Src substrat, og Src inhibitor AZD0530 kan også resultere i signifikant inhibering af cellemigration og matrigel invasion i lungecancerceller [21], som potentielt støtter carcinogenese af Src /BCAR1 akse.

Brug af immunoblotting, Greenberg et al. [22] konstateret, at kun aktiveret p38 MAPK konsekvent blev øget i NSCLC i sammenligning med normalt væv, hvilket tyder på en ekstra rolle for denne vej i ondartet vækst eller transformation celle. Faktisk havde talrige undersøgelser afslørede de carcinogene aktiviteter af p38, herunder stimulering af proliferation og migration [1], [23], [24]. Matsuda K et al. [23] fandt, at EGF fremmer spredning via p38 MAPK signalering kaskader i ASPC-1, PANC-1 og T3M4 bugspytkirtlen kræft cellelinjer, og p38 MAPK inhibitor SB203580 kan hæmme EGF-stimuleret mitogenese. Desuden har p38 MAPK-vejen været impliceret at spille en vigtig rolle i endotelcellemigration fordi inhibering p38MAPK aktivitet nedregulerer VEGF-stimuleret migration [24]. For nylig, Wendt et al. Undersøgelse [25] viste, at forøgelse af ekspression af enten fuld længde eller blot carboxylterminalen af ​​BCAR1 i mammaepitelceller øget p38 aktivering. Interessant nok i 182 NSCLC væv, fandt vi var der en tæt sammenhæng mellem ekspression af BCAR1 og phospho-p38. Ved at evaluere farves intensitet phospho-p38 og BCAR1 (achromasy = 0, stramineous = 1, buffy = 2, brun = 3, ” 2 scoringer” blev klassificeret som lav udtryk, ellers så høj ekspression), vi fandt overflod af phospho-p38 var også signifikant og positivt korreleret med den af ​​BCAR1 (Spearman Rho, p 0,001). desuden BCAR1 knockdown forårsagede også den betydelige reduktion af phospho-p38-niveauer i A549 celler Men de underliggende mekanismer fortjener yderligere undersøgelser Derudover..