PLoS ONE: 2-deoxyglucose Vender Fremme Effekt af insulin på kolorektal cancer-celler in vitro

Abstrakte

En øget risiko for kolorektal cancer er relateret til udviklingen af ​​metabolisk syndrom, herunder hyperglykæmi, og hyperinsulinæmi. De høje kredsløbs- niveauer af glucose og /eller insulin eller anvendelsen af ​​exogent insulin kan fremme carcinogenese, cancer progression og metastase, hvilket kan tilskrives den Warburg virkning eller aerob glykolyse. Vi har forsøgt at løse disse eksisterende spørgsmål ved at anvende glukose analog 2-deoxyglucose (2DG). Ifølge de

in vitro

undersøgelser, vi udførte, kunne glykolyse af kolorektal cancer celler afbrydes af 2DG da det faldt de cellulære produktioner af ATP og laktat. Desuden 2DG apoptose og cellecyklusstandsning, og inhiberede proliferation, migration og invasion af disse celler. Da insulin kan stimulere den cellulære optagelse af hexose, herunder 2DG, kombinationen af ​​2DG og insulin forbedret cytotoksicitet 2DG og i mellemtiden overvandt cancer-fremmende virkninger af insulin. Denne

in vitro

undersøgelse forudsat et synspunkt af 2DG som en potentiel terapeutisk middel mod kolorektal cancer, især for patienter med samtidig hyperinsulinisme eller behandlet med eksogent insulin

Henvisning:. Zhang D, Fei Q, Li J, Zhang C, Sun Y, Zhu C, et al. (2016) 2-deoxyglucose Vender Fremme Effekt af insulin på kolorektal kræft celler

In Vitro

. PLoS ONE 11 (3): e0151115. doi: 10,1371 /journal.pone.0151115

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: September 30, 2015; Accepteret: 22 februar 2016; Udgivet: 3 mar 2016

Copyright: © 2016 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Priority Academic Program Udvikling af Jiangsu højere uddannelsesinstitutioner (PapD). Ingen potentielle interessekonflikter blev offentliggjort

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er kendt for at være stærkt. forbundet med en vestlig livsstil. Forekomsten stiger hurtigt i løbet af det sidste århundrede i takt med den boomende økonomiske udvikling [1] .I betragtning øget sygelighed af metabolisk syndrom, har været gennemført mange undersøgelser for at undersøge deres forbindelse med CRC. Beviser tyder på, at type 2-diabetes mellitus (DM), insulinresistens, hyperinsulinæmi er uafhængige risikofaktorer for kolorektal cancer [2,3].

Type 2 DM er karakteriseret ved hyperglykæmi som følge af kombinationen af ​​insulinresistens og en relative mangel på insulin. Højt cirkulerende glukose niveau er sandsynligvis fremme udviklingen af ​​kræft. Hovedårsagen er, at de fleste cancerceller overvejende afhængige aerob glycolyse til at generere den nødvendige energi til cellulære processer, et fænomen kendt som Warburg effekten [4]. Bortset fra at være den vigtigste energikilde, er glucose anvendes som en væsentlig carbonkilde til anabolske reaktioner [5] .Denne karakteristisk er blevet udnyttet til at afbilde cancer i klinikker ved at anvende 2- (18F) -fluor-2-deoxy-D glucose (FDG) i positronemissionstomografi (PET). Målretning glukosemetabolismen er blevet en potentiel strategi mod kræft. Et af de mest lovende glycolytiske inhibitorer er 2-deoxyglucose (2DG) [6-8]. 2DG er et syntetisk glucose analog, som har C-2 hydroxylgruppen erstattes med hydrogen (Fig 1A). Efter indtastning af cellen via glukosetransportører (gluts), er 2DG omdannes af hexokinase til dannelse phosphoryleret 2DG som akkumuleres i cellen, hvilket fører til den ikke-konkurrerende hæmning af hexokinase, nedsat produktion af ATP og lactat, og til sidst cellevækstinhiberingen og celle død (fig 1B) [6-8].

(A) molekylære struktur af glucose og 2-deoxyglucose. (B) På grund af den strukturelle lighed med glucose, 2-deoxyglucose kommer ind i cellen via gluts, hvilket fører til afbrydelse af glykolyse med nedsat produktion af ATP og lactat [6-8]. G: glucose. 2DG:. 2-deoxyglucose

Ud over virkningerne af hyperglykæmi, insulinresistens og kompenserende hyperinsulinæmi er også vigtige bidragsydere til udviklingen og progressionen af ​​flere neoplasmer [9]. Insulin er blevet bekræftet at være i stand til at stimulere glucoseoptagelse i mange cancerceller [10], som kan fremme Warburg virkning. Insulin kan også udøve mitogene og antiapoptotiske virkninger [11-13]. Desuden kan insulin forstærke biotilgængeligheden af ​​insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF-1) [14-16]. Patienter med samtidig kolorektal cancer og type 2 DM der også bruger insulin står den potentielle trussel, at insulin kan fremme kræft progression. Undersøgelser med dyremodeller har allerede bekræftet den antagelse [17]. Selv i øjeblikket forholdet mellem insulin eller insulinresistens og tarmkræft er ikke eksplicit, kan ingen ignorere de potentielle virkninger af insulin på forskellige stadier af carcinogenese.

Forståelse af glukosemetabolismen og funktionen af ​​insulin i kolorektal cancer celler vil fremme udviklingen af ​​nogle nye metoder til forebyggelse og behandling. Denne

in vitro

undersøgelse har til formål at bestemme anticancer effekter af 2DG og virkningerne af insulin på kolorektale cancer cellelinjer. Desuden dette studie undersøgt muligheden for insulin i styrke anticancer effektivitet 2DG.

Materialer og metoder

Cell kultur

To kolorektale cancer cellelinjer (HCT116, LoVo ) blev opnået fra cellen Bank of Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) og dyrket i høj-glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (4,5 g /l glucose) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS ), 1% penicillin-streptomycin, i en CO 5%

2 fugtig inkubator ved 37 ° C.

Kemikalier

2DG og insulin fra kvæg bugspytkirtlen blev købt fra Sigma (St. Louis, MO). Lægemidler blev opløst i komplet dyrkningsmedium. Løsninger blev filtersteriliseret hjælp 0,22 um sprøjte-filterenheder (Beyotime Bioteknologi, Shanghai, Kina).

Cell proliferation assay

Cell Counting Kit-8 (CCK8) assay for celleproliferation blev udført i henhold til producentens anvisninger (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kina). Celler blev behandlet med 2DG og /eller insulin i 24, 48 eller 72 timer. Derefter dyrkningsmedier blev erstattet med frisk medium suppleret med celleproliferation reagens. Efter 2 timer inkubation blev målinger udført ved anvendelse af en 96-brønds spektrofotometrisk pladelæser (Sunrise-Basic Tecan, Østrig) med absorbansen bølgelængde ved 450 nm. Virkning af insulin på cellulær proliferation blev evalueret, og en passende koncentration insulin blev bestemt for efterfølgende undersøgelser.

Flowcytometri i analyse af apoptose og cellecyklus

Flowcytometri i analysen af ​​apoptose blev udført under anvendelse af en dobbelt farvningsfremgangsmåde med Annexin-V-FITC og propidiumiodid (PI). Assayet blev udført under anvendelse Apoptose Kit (KeyGen Biotech. Co. Ltd, Nanjing, Kina) ifølge producentens anvisninger. Celler blev dyrket med 2DG og /eller insulin i 24 timer og derefter trypsinbehandlet uden EDTA, vasket med PBS, farvet med Annexin V-FITC og PI og analyseret ved flowcytometri (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Data blev behandlet af Kaluza flowcytometri analyse software 1.2 (Beckman Coulter).

For cellecyklus analyse blev Cell Cycle Analysis Kit fra Beyotime Bioteknologi (Shanghai, Kina), der anvendes på grundlag af producentens anvisninger. Celler blev opsamlet, vasket med PBS, fikseret i 75% kold ethanol og inkuberet natten over ved 4 ° C. Derefter blev cellerne vasket og resuspenderet i farvningsopløsning indeholdende PI og RNAseA og inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C før flowcytometrianalyse. Cellecyklus fraktioner blev kvantificeret med WinCycle software (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA).

Cell migration og invasion assay

migration og invasion af kolorektal cancer celler blev vurderet ved hjælp Transwell Permeable Understøtter (Corning Incorporated, Corning, NY, MA) med filtre på 8,0 um porestørrelse, 6,5 mm i diameter. Cancer cellesuspensioner i DMEM (5 × 10E5 celler /ml, 100 pi) suppleret med eller uden lægemiddel blev tilsat til det øvre kammer af kammeret og 600μL DMEM indeholdende 10% FBS blev tilsat til det nedre rum. Efter 24 timers inkubation blev filtrene høstet og nedsænket i krystalviolet. Celler på den øvre overflade af filteret blev tørret væk med vatpinde. Antallet af celler, der passerede gennem filteret blev talt i fem felter under et mikroskop. For

in vitro

invasion assay Matrigel (BD Biosciences) tilsat til den øvre overflade (50 pi /cm

2) for at danne en matrix barriere og den podede cellekoncentration var 1 × 10E6 celler /ml .

ATP indhold analyser

Den intracellulære ATP-indholdet blev bestemt ved anvendelse af en luciferin-luciferase-baserede metode. Celler blev inkuberet med 2DG og /eller insulin i 24 timer. Derefter blev cellerne trypsineret, talt og behandlet ved hjælp af ATP Assay Kit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kina) og målinger blev udført ved anvendelse af et luminometer (GloMaxTM 20/20, Promega Corporation, Madison, WI). ATP produktionen blev normaliseret til celleantal og udtrykt som procent af normaliserede ATP værdier fundet i kontrolceller.

lactatproduktion analyser

lactatproduktion analyser blev udført ved anvendelse af lactat assaykit (Beyotime Biotechnology, Shanghai , Kina). Efter 24 behandling med 2DG og /eller insulin, blev celler skrabet med en celleskraber og celleantal blev talt. Derefter blev suspensionerne sonikeret på is i 3 cyklusser. Hver cyklus bestod af 5s lydbehandling med en 100W udgangseffekt fra en Qsonica ultralyd celle disruptor (Newtown, CT) efterfulgt af 30’erne inkubation. De sonikerede prøver blev analyseret for at bestemme hele lactat niveauer efter producentens anvisninger. Ekstracellulære lactat niveauer blev også bestemt som dyrkningsmedierne blev indsamlet og testet. Målinger blev udført ved anvendelse af et Tecan spektrofotometrisk pladelæser med absorbansen bølgelængde ved 540 nm. Lactat produktioner blev normaliseret til celle nummer og udtrykt som procent af kontrol.

Protein udvinding og Western blotting

Celler blev behandlet med 20uU insulin og /eller 5 mM 2DG for 24 timer, og derefter blev lyseret med radioimmunaktivitet nedbør assay (RIPA) buffer (Beyotime bioteknologi, Shanghai, Kina) suppleret med 1% phenylmethanesulphonyl (PMSF) (Beyotime bioteknologi). Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af et BCA Protein Assay Kit (Beyotime bioteknologi). Prøverne blev blandet med 5 × SDS-PAGE prøvepåsætningsbuffer. Ens mængder af helt protein ekstrakter blev elektroforese gennem en polyacrylamidgel og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) -membran (Millipore, Billerica, MA) ved Wet Elektroforetisk overførsel. Membraner blev blokeret i 5% skummetmælk i Tris-bufret saltvand plus 0,1% Tween 20 (TBS-T) og derefter inkuberet natten over med angivne primære antistoffer mod Phospho-AMPKα (Thr172) (Cell Signaling Technology), AMPKα (Cell Signaling Technology) , SLC16A3 /MCT4 (Abcam), LC3A /B (Cell Signaling Technology), GAPDH (Cell Signaling Technology), Mcl-1 (Cell Signaling Technology), Survivin (Cell Signaling Technology), MMP2 (Cell Signaling Technology), P62 (Cell Signaling Technology). Blottene blev derefter vasket og inkuberet med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., USA) og visualiseret med Immobilon ™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore Corp, USA) under anvendelse af FluorChem E-systemet (ProteinSimple, Santa Clara, CA ).

Statistisk analyse

data blev udtrykt som gennemsnit ± SD fra mindst tre uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev udført på grundlag af t-test. En P-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. De statistiske operationer blev udført ved hjælp af statistiske Package for Social Science-version 19 software (SPSS, Chicago, IL).

Resultater

Insulin forbedret antiproliferative og apoptose induktion af 2DG

in vitro

i den første serie af eksperimenter, vi undersøgt, om 2DG besad nogen antiproliferativ virkning i kolorektale cancer cellelinjer. Celleproliferation blev udført hver 24. time i 72 timer. Data viste, at 2DG udøvede et betydeligt inhiberende virkning på proliferationen af ​​begge celler sammenlignet med kontrollen (Fig 2B1 og 2C1). Den inhiberende virkning var dosis- og tidsafhængig. I modsætning hertil insulin generelt udviste en beskeden forfremmelse på celleproliferation (Fig 2A), som ikke øges i takt med stigningen i koncentrationen af ​​insulin. 20μU /ml insulin tæt på den øvre grænse for normale fysiologiske niveau i fastende tilstand blev udvalgt til efterfølgende undersøgelser. Kombinationen af ​​2DG og insulin (20μU /ml) resulterede i en signifikant større undertrykkelse af cellulær proliferation sammenlignet med 2DG-behandling alene (Fig 2B og 2C).

Procentdele af levedygtige celler på forskellige tidspunkter (24,48 , 72h) blev vist. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD af de opnåede resultater fra tre uafhængige eksperimenter. (A) Cellulær proliferation som respons på ingrediens koncentrationer af insulin. (B og C) HCT116 og LoVo colorektal cancer celler blev behandlet med 2DG ved angivne koncentrationer med eller uden tilstedeværelse af insulin (20μU /ml). (D) Celler blev behandlet i 72 timer med 5 mM 2DG og /eller 20μU /ml insulin. Celle vækstkurver blev konstrueret. *, betydelige forskelle versus kontroller (P 0,05). #, Signifikante forskelle versus kontrol på samme tid (P 0,05).

Cell apoptose analyse ved flowcytometri viste en svag stigning i kræft celle apoptose efter 2DG behandling

in vitro

(fig 3). Andelene af annexin V-positive /PI-negative celler, hvilket indikerer tidligt apoptotiske celler og Annexin V-positive /PI-positive celler, hvilket indikerer sent apoptotiske eller nekrotiske celler, forøget på en dosis-afhængig måde (data ikke vist) under effekt af 2DG. Western blot analyse viste, at 2DG inhiberede udtrykkene for overlevelse proteiner MCL-1 og survivin (fig 4). Selvom det ikke er statistisk signifikant, insulin tendens til at undertrykke cancercelle apoptose. Når insulin blev administreret samtidig blev de apoptotiske celler yderligere øget i forhold til 2DG monoterapi (figur 3). Resultaterne af cellulær proliferation og apoptose assays foreslået, at insulin fremmet anticancer effekter af 2DG og at 2DG vendt kræft effekter af insulin.

Flowcytometrianalyse af celleapoptose blev påvist ved PI og Annexin V-FITC-farvning (A: HCT116, B: LoVo). Celler blev behandlet med 5 mM 2DG og /eller 20μU /m insulin. Forsøg blev udført tre gange. Repræsentative billeder blev vist. *, P 0,05. #, Betydelige forskelle versus kontrollerne (P 0,05)

Western blot analyse af Mcl-1 og survivin.. GAPDH blev anvendt som en belastning kontrol.

2DG induceret G1 cellecyklusstop

in vitro

Hurtigt prolifererende kræftceller er afhængige af øgede mængder glukose ikke kun til energiproduktion, men også for biosyntesen af ​​nukleinsyrer, proteiner og lipider [18]. Det indgreb i glukosemetabolismen kan arrestere eller forsinke cellecyklusprogression. Flowcytometrianalyse af cellecyklusfordeling viste, at inkubation af celler med 2DG resulterede i en øget procentdel af celler i G1-fasen (Fig 5). Omvendt insulin inducerede en kraftig stigning af celler i S og G2 faser. Imidlertid blev G1 cellecyklusstop af 2DG svækket, men ikke fremmes af insulin

cellecyklusfordeling af cancerceller behandlet under forskellige betingelser. (A: HCT116, B: LoVo). Forsøg blev udført tre gange. Repræsentative billeder blev vist. *, P 0,05. #, Betydelige forskelle versus kontrollerne (P 0,05).

kombinere 2DG med insulin markant undertrykt kræftcellen migration og invasion

in vitro

For at bestemme hvorvidt 2DG kunne dæmpe metastatisk potentiale, blev Transwell Permeable støtter anvendes med og uden Matrigel coating at vurdere invasion og migration, hhv. I sammenligning med kontrolgruppen, invasion og migration var signifikant inhiberet i begge celler behandlet med 2DG (figur 6). Omvendt insulin signifikant forøget kræft cellemigration og invasion. Antallet af migrerede og invaderede celler var henholdsvis 1,28 folder og 1,32 folder af kontrollen i HCT 116, 1,25 folder og 1,42 folder i LoVo. Sammenlignet med 2DG monoterapi, blev migration og invasion i begge celler yderligere deprimeret ved kombinationen af ​​insulin og 2DG. Antallet af migrerede og invaderet celler faldt med over 50% af dem i kontrolgrupper. Western blot analyse viste, at insulin fremmet ekspressionen af ​​MMP2 protein-et centralt medlem blandt matrixmetalloproteinaser, som kan til en vis grad forklare invasionen fremmende virkning af insulin. I modsætning hertil 2DG hæmmede udtryk for MMP2 (Fig 7B).

I migration og invasion analyser af kræftceller, blev analyseret fem tilfældigt udvalgte felter. Repræsentative billeder vises. Antallet af migrerede og invaderede celler blev præsenteret. Data blev repræsenteret som middelværdi ± SD. #, betydelige forskelle sammenlignet med kontroller (P 0,05). * P 0.05.

(A) De samlede og ekstracellulære lactat niveauer blev vist for celler behandlet med 2DG og /eller insulin for 24 timer. Den intracellulære laktat blev bestemt som forskellen mellem de af total og ekstracellulære. #, betydelige forskelle sammenlignet med kontroller (P 0,05). * P 0,05. (B) Western blot-analyse af SLC16A3 /MCT4, MMP2. GAPDH blev anvendt som en belastning kontrol.

kombinere 2DG med insulin ført til markante fald i ATP og laktat produktion

in vitro

På grundlag af anticancer effekter, så undersøgte vi effekten af ​​2DG på glykolysen

in vitro

. Hurtigt proliferende cancerceller er karakteriseret ved forhøjet glycolyse, derfor har vi den hypotese, at 2DG ville føre til glycolyse suppression på grund af sin ikke-metaboliserbar karakter og inhibering af nogle glycolyse enzymer. ATP og lactat niveauer som respons på 2DG blev analyseret. Væsentlige fald i det samlede intracellulære ATP-niveauer blev observeret efter 2DG administration (Fig 8A). Inkubation af HCT116 og LoVo-celler med 2DG på 5 mM i 24 timer førte til ATP-niveauer på 53% og 42% af niveauerne i ubehandlede celler. Tilstedeværelsen af ​​insulin påvirkede ikke ATP-produktion. Når de to lægemidler blev anvendt sammen, blev ATP indholdet faldet yderligere. Som følge af ATP berøvelse, 2DG inducerede opreguleringen og aktivering af AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) som påvist ved Western blot-analyse (Fig 8B). 2DG også inducerede opregulering af LC3I og konvertering fra LC3I til LC3II (Fig 8B), som foreslog opregulering af autofagi. Et andet tegn på autofagi – p62- aftager med højden af ​​autophagy da det kan nedbrydes i denne proces [19]. Som vist i fig 8B, 2DG sænkede p62 niveau. 2DG strukturelt ligner glukose, men det kan ikke metaboliseres til energiproduktion således efterligne virkningen af ​​glucose deprivation og aktiverende autofagi.

(A) ATP-niveauer efter behandling af 2DG og /eller insulin (20μU /ml) i 24 i kolorektale cancerceller. ATP-niveauer blev normaliseret til ubehandlet kontrolprøve. Data er gennemsnit ± SD af 3 uafhængige forsøg. #, betydelige forskelle sammenlignet med kontroller (P 0,05). * P 0,05. (B) Western blot analyse af Phospho-AMPKα (Thr172), der repræsenterer aktiv AMPK, AMPKα repræsenterer total AMPK, P62, LC3A /B. GAPDH blev anvendt som en belastning kontrol.

Med hensyn til bestemmelsen af ​​laktat produktion

in vitro

blev cellesuspensioner ultralydbehandlet og analyseres for de samlede laktat niveauer (Fig 7A). Forskellen mellem totalt og ekstracellulære lactatniveauer indirekte kan indikere det intracellulære lactat niveau. Resultaterne viste, at både totalt og ekstracellulære lactat niveauer blev øget med insulin i forhold til kontrol, mens overraskende de intracellulære lactat niveauer blev faldet lidt i begge celler. Vi antager, at lactat kan forbruges af disse normoksiske celler til anabolisme eller eksporteres langt mere kraftigt under påvirkning af insulin. Som forventet, 2DG faldt betydeligt laktat produktion. Kombinationen af ​​de to agenter førte til en yderligere reduceret laktat niveau, mens den intracellulære laktat syntes at være mildt øges. Monocarboxylat transportør 4 (MCT4), der er involveret i ekstrudering af lactat, blev signifikant nedreguleret ved kombination som vist ved Western blot (Fig 7B), hvilket kan forklare stigningen i intracellulær lactat vist omfang.

Diskussion

for at type 2 DM patienter kan hyperglykæmi øger risikoen for kræft, som i nogen grad kan tilskrives den Warburg effekten-et fænomen, de fleste cancerceller overvejende producerer energi ved glykolyse snarere end oxidative fosforylering efterfulgt af en forhøjet sekretion af mælkesyre, selv i den tilstand af tilstrækkelig oxygenspænding [5]. Hyperinsulinæmi kan også være en potentiel bidragyder til kræft som den metaboliske virkning af insulin kan fremme Warburg virkning. En høj (suprafysiologisk) dosis af exogent insulin er ofte nødvendig i behandlingen af ​​diabetes at opnå normoglykæmi. Mens forbedre metabolisk kontrol, kan forhøjet insulin niveau øger risikoen for kræft ved dosisafhængige virkninger på cellulær differentiering, vækst, formering, migrering og invasion [20]. For diabetes-patienter med cancer, er rapporteret udvikling af insulinresistens, der skal kombineres med hyppig insulinreceptor overekspression og øget insulinaktivitet i cancerceller [12]. Insulin kan også hæmme effekten af ​​mange kemoterapeutiske lægemidler [21-23]. Selv om det stadig et spørgsmål om, hvorvidt eller i hvilket omfang, eksogen insulinbehandling forårsager kræft progression i patienter, ingen kan overse den potentielle trussel af insulin, som er blevet bekræftet af

in vivo

dyreforsøg [11 ].

med hensyn til kolorektal cancer, diabetes er blevet foreslået som en vigtig bidragyder til dens udvikling [11]. Epidemiologiske undersøgelser observeret en positiv sammenhæng mellem fastende hyperglykæmi (≥ 6,1 mmol /l) og kolorektal cancer incidens. Trods betydelige fremskridt inden for kirurgisk og medicinsk behandling, kolorektal cancer stadig et meget udbredt og dødbringende malignitet i de udviklede lande. På baggrund af ovenstående standpunkter, foreslår vi, at målrette glukosemetabolismen i behandling af kolorektal cancer er lovende. Selv mange cancerceller er følsomme og sårbare over for glucose deprivation [24]. Denne strategi er praktisk umuligt i pattedyr, fordi processen med glukoneogenese, hovedsageligt i leveren, hvilket giver en kilde til glucose fra ikke-kulhydrat carbonsubstrater, såsom lactat, glycerol. Således det er opnåeligt og bæredygtigt at efterligne glukose afsavn

in vivo

gennem hæmning af glukosemetabolismen ved anvendelse af farmakologiske midler, såsom 2DG. Når transporteres ind i celler via gluts er 2DG phosphoryleret af hexokinase til dannelse 2DG-6-phosphat, som ikke kan metaboliseres yderligere via glykolyse men snarere akkumulerer og ikke-kompetitivt inhiberer hexokinase og kompetitivt inhiberer phosphoglukoseisomerase [18,25,26]. Derfor er normal glukose metabolisme forstyrret, hvilket fører til energi afsavn og i sidste ende celledød. Heri foreslog vi 2DG som en potentiel kandidat mod tyktarmskræft. Især, når eksogent insulin administreres eller cirkulatorisk hyperglykæmi er kombineret, effektivitet 2DG kan forbedres yderligere, da insulin kan fremme cellulære optagelse af hexose.

Vores

in vitro

undersøgelse funktionelle analyser af kolorektal cancer celler såsom celledeling, apoptose, migration og invasion. Glycolysis blev analyseret ved de produktioner af ATP og laktat. 2DG og insulin blev påført til behandling af disse celler enten alene eller i kombination. Resultaterne viste, at 2DG havde hæmmende virkning på kræft celle, mens insulin havde direkte fremme effekter. Når insulin blev kombineret, blev anticancer effekter af 2DG forbedret og kræft effekter af insulin blev vendt. Den glycolyse inhibering af 2DG blev også fremmet af insulin.

Western blot-analyse for overlevelse proteiner, herunder Mcl-1 og survivin, blev også analyseret. Resultatet viste, at 2DG inhiberede udtrykkene for begge proteiner (Fig 4). Survivin er medlem af inhibitoren af ​​apoptose (IAP) familie. Det er stærkt udtrykt i de fleste humane cancerceller. Survivin kan inhibere caspaseaktivering og undertrykke apoptose. [27,28]. MCL-1 er et anti-apoptotisk medlem af Bcl-2-familien. Det lokaliserer til mitokondrierne, antagoniserer pro-apoptotiske Bcl-2-familiemedlemmer, og inhiberer apoptose induceret af cytotoksiske stimuli. MCL-1 er rapporteret at være involveret i celledød induceret af inhibering af cellemetabolisme. MCL-1 nedregulering spiller en kritisk rolle i 2DG induceret apoptose [7,29].

2DG administration på en lav dosis var ikke helt effektivt at inducere celledød og apoptose. Mens, migration og invasion var markant undertrykt af 2DG, som sandsynligvis ikke blev tilskrevet den beskedne cytotoksiciteten af ​​2DG ved denne dosis. Sottnik et al. rapporterede, at 2DG var meget effektiv til at inhibere metastatisk fænotype af en lang række tumortyper både

in vitro

in vivo

, der var forbundet med cytoskelet reorganisering og inhibering af cathepsin L-ekspression [ ,,,0],30]. I denne undersøgelse har vi bemærket ekspressionsniveauet af MMP2. Matrix (MMP’er) er en familie af zink- og calcium afhængige proteolytiske enzymer, der er involveret i nedbrydningen af ​​ekstracellulær matrix og metastatisk fænotype af kræft. Som et vigtigt medlem af MMP’er har MMP2 vist sig at være stand til at nedbryde collagen IV, de store strukturelle bestanddel af basalmembran [31-33] .Western blot-analyse viste, at insulin fremmet ekspressionen af ​​MMP2 protein, hvilket kan til dels være forklare sin fremme af invasion. I modsætning hertil 2DG inhiberede ekspressionen af ​​MMP2. Glycolysis blev markant hæmmet af 2DG som det fremgår af de begrænsede produktioner af ATP og laktat. På grund af ATP udtømning og øget intracellulær AMP /ATP-forholdet, AMPK, en nøgle cellulær energi-sensor, aktiveres. AMPK aktivering forsøger at inddrive ATP generation via tænding katabolisme og slukning anabolisme. ATP-forbrugende processer såsom biosyntese, cellevækst og proliferation fastholdes [34,35]. Cellecyklusprogression kan stå ved G1-S faseovergangen [36]. Forhøjede glycolyse resulterer i frembringelsen af ​​store mængder af lactat, som skal transporteres ud af celler for at forhindre forgiftning selv. Mælkesyre transport over plasmamembranen medieres af en familie af proton-linked monocarboxylat transportører (MCT) [37]. Forøget ekspression af MCT4 i tumorceller har tidligere [38] blevet rapporteret. Vores resultater viste, at 2DG behandling førte til nedsat lactat produktion og nedregulering af MCT4. De hæmninger af laktat produktion og ekstrudering er vigtige aspekter i anticancer effekter af 2DG siden forhøjet laktat under glukosemetabolismen generelt viser sig at være gavnlig for kræftceller. På den ene side, lactat ved udførsel resulterer i syrning af mikromiljø, som letter tumorangiogenese og giver en gunstig tilstand for aktiveringen af ​​cathepsin og metalloproteinaser fører til ekstracellulære matrix-nedbrydning og tumorcellemetastase [38,39]. På den anden side, ekstracellulær forsuring indirekte bidrager resistens af cancerceller til stråling og visse cytotoksiske lægemidler, såsom doxorubicin [40]. Desuden, lactat kan inhibere differentieringen af ​​monocytter til dendritiske celler og inaktivering cytokinfrigivelse dermed bidrage til immun udslip af cancerceller [40]. Laktat kan yderligere fremme tilstødende aerob vækst tumorceller, da det kan forbruges til at træde i stedet for glukose til oxidativ fosforylering [38].

Baseret på mange nylige undersøgelser, toksiciteten efter 2DG behandling kunne forklares med mere end én mekanisme afhængig af den metaboliske profil for en specifik cancer celletype. Efterligning glucosemangel, 2DG er stand til at inducere autofagi [41-43]. Omdannelsen fra LC3-I til LC3-II er en repræsentativ fremgangsmåde til autophagy flux [19]. En signifikant opreguleret udtryk for LC3 II protein blev påvist i 2DG behandlede kolorektale cancerceller. Udover LC3, P62 er en anden producent af autofagi. P62 er et ubiquitin-bindende protein og er nødvendig for dannelsen af ​​ubiquitinerede proteinaggregater. p62can selektivt inkorporeret i autophagosome gennem binding til LC3, der fører de proteinaggregater for nedbrydning. Lysosomal nedbrydning af autophagosomes fører til fald i P62 [19,44]. Western blot-analyse viste nedsat niveau af p62 efter 2DG administration. Selvom autophagy er almindeligt kendt som en celle overlevelse mekanisme under stressfaktorer, når udførligt aktiveret, selvopholdelsesdrift kan blive til massive ødelæggelser [45]. Trods inhibering af glykolyse og induktion af autofagi, kan 2DG forårsage ændringen af ​​N-bundet glycosylering og intensivering af oxidativ stress [25,26,46].

I betragtning af de bivirkninger af 2DG, andre højt glucose afhængige væv trods kræftceller, såsom hjerne, hjerte, nethinde og testikler, er alle potentielle ofre [38]. Tidligere kliniske forsøg har bekræftet, at 2DG administration var generelt sikkert og veltolereret af patienterne. Interessant nok selv intravenøs administration af 2DG kan forårsage hyperglykæmi, bivirkninger observeret var ganske de samme som for hypoglykæmi [47-49].

Med hensyn til sammenhængen mellem CRC og diabetes, Metformin har også vist sig at være en potentielle lægemiddel mod tyktarmskræft gennem regulering af AMPK og pattedyr mål for rapamycin (mTOR) -signaling vej [50]. Svarende til 2DG, kan Metformin inhibere energiproduktion af cancerceller og påvirke cellens metabolisme. Kombinationen af ​​metformin og 2DG er blevet undersøgt for at være meget mere effektive til at undertrykke cancerceller gennem induktion af apoptose. [51,52].

strategi med at kombinere 2DG og insulin vist sig at være lovende mod kolorektal cancer og kan være nyttige i behandlingen af ​​andre maligniteter. 0,05.