Abstrakt
Aberrant cytosin 5-methylering ligger til grund mange deregulerede elementer af kræft. Blandt parrede ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), søgte vi at profilere DNA 5-methyl-cytosin træk, som kan ligge til grund genom-dækkende deregulering. I en af de mere tætte afhøringer af methylome, vi stikprøven 1,2 millioner CpG steder, hvorfra tyve-fire NSCLC tumor (T) non-tumor (NT) par bruger er følsomme for methylering begrænsning enzym- baserede HJÆLP-microarray-assay. Vi fandt 225,350 forskelligt methylerede (DM) steder i adenokarcinomer
versus
tilstødende ikke-tumorvæv, der varierer i frekvens tværs genomisk rum, særlig bemærkelsesværdig i gen organer (GB; p 2.2E-16). Når endvidere DM blev koblet til differential transkriptom (DE) i de samme prøver, 37.056 differential loci i adenocarcinom dukket op. Ca. 90% af DM-DE relationer var ikke-kanoniske; for eksempel promotor DM forbundet med DE i samme retning. Af de kanoniske ændringer bemærkede, promoter (PR) DM loci med gensidige ændringer i udtryk i adenokarcinomer inkluderet
HBEGF
,
AGER
,
PTPRM
,
DPT
,
CST1
,
MELK;
DM GB loci med overensstemmende ændringer i udtryk inkluderet
FOXM1
,
FERMT1
,
SLC7A5
, og
FAP
gener. IPA-analyser viste adenocarcinom-specifik promoter DMxDE overlay identificeret velkendte lungekræft noder [
TP53
,
Akt
] såvel som mindre kendte knuder [
HBEGF
,
NQO1
,
Grk5
,
VWF
,
HPGD
,
CDH5
,
CTNNAL1
,
PTPN13
,
DACH1
,
SMAD6
,
LAMA3
,
AR
]. De unikke resultater fra denne undersøgelse omfatter opdagelsen af talrige kandidat De unikke fund fra denne undersøgelse omfatter opdagelsen af talrige kandidat methylering steder i både PR og GB regioner ikke tidligere identificerede i NSCLC, og mange ikke-kanoniske relationer til genekspression. Disse DNA methylering funktioner potentielt kunne udvikles som risiko- eller diagnostiske biomarkører, eller som kandidat mål for nyere methylering locus målrettet forebyggende eller terapeutiske midler
Henvisning:. Mullapudi N, Ye B, Suzuki M, Fazzari M, Han W, Shi MK, et al. (2015) Genom Brede Methylome Ændringer i lungekræft. PLoS ONE 10 (12): e0143826. doi: 10,1371 /journal.pone.0143826
Redaktør: Osman El-Maarri, University of Bonn, Institut of Experimental Hematology og Transfusion Medicine, TYSKLAND
Modtaget: August 18, 2015; Accepteret: November 10, 2015; Udgivet: 18. december 2015
Copyright: © 2015 Mullapudi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Relevante data kan findes på GEO repository-GSE315520, GSE 31552.
Finansiering: Dette arbejde blev støttet af NCI 1RC1 CA145422-01 (SDS); 1K24-CA139054-01 (SDS); Stony-Wold Herbert Foundation (NM); 1R01-CA180126-01 (SDS Co-PI); P30 CA013330 (Albert Einstein Cancer Center core tilskud)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Lungekræft er ansvarlig for den højeste antallet af kræft-relaterede dødsfald i USA [1]. Cancer er kendetegnet ved genom-dækkende ændringer i CpG-methylering, herunder en generaliseret hele genomet hypometylering (tab af methylering) herunder på onkogener, og gensidig hypermethylering på bestemte loci (øget methylering), herunder tumor suppressor genpromotorer [2,3]. Nylige undersøgelser har vist, at den funktionelle konsekvens af 5-methylering af cytosin er afhængig af det genomiske kontekst og specifik sekvens, hvor den forekommer [4,5]. Methylering af CG rester inden CG øer (CGI) i genpromotorer er forbundet med gendæmpning. Dog findes, methylering af CGI inden gen organer at være forbundet med vævsspecifik ekspression og genaktivering i kræft genomer [6-8].
Paneler af kendte kandidat tumorsuppressorgener er blevet undersøgt i kliniske lungekræft prøver at karakterisere promotor-methylering [9,10], hvilket giver kortfattede methylering signaturer [11], samt at skelne mellem de forskellige histologiske undertyper [12]. Methylering ændringer forekomme tidligt under udviklingen af lungecancer [13], og kan således anvendes som prædiktive markører for at afsløre potentielle maligniteter [14,15]. Således kan identificere diskriminerende methylering mærker videreudvikles til diagnostiske analyser til støtte i vurderingen og diagnostik risiko.
DNA methylering kan måles ved målrettede metoder såsom bisulfit sekventering (tBGS) [16], methylation- specifik PCR (MSP) [17], og massespektrometri-baserede metoder (Epityper
®) [18]. Hver platform assays locus-specifik methylering ved højere opløsning, hvor et defineret panel af gener kan vurderes for status methylering af et udvalgt antal CpG rester i dem. Disse metoder afhængig af forudgående kendskab til specifik epigenomic loci at designe assayet.
Blandt discovery metoder til påvisning af mønstre for methylering i en genom-plan, én tilgang er at anvende følsomme for methylering og modstandsdygtige isoschizmer restriktionsenzymer ( HJÆLP, RLM, andre). Andre fremgangsmåder omfatter chromatin immunoprecipitation med methylerede DNA-bindende antistoffer (MBD, MeDIP, andre), eller hydrogensulfit sekventering af et nedsat af genomet (RRBGS, andre) [19]. Hver af disse metoder har sine egne fordomme og af nødvendighed af skalaen, prøver kun en lille delmængde af de menneskelige methylome. Hele genom bisulfit sekventering [20] er designet til tæt forespørge hele methylome ved enkelt base-specifik opløsning. Men i øjeblikket denne metode er for dyrt og analytisk intensivt at udføre på store stikprøvestørrelser.
Nylige undersøgelser har vurderet genom-dækkende methylering i lungekræft at opdage tumor specifikke methylering underskrifter af kræft genomer [13,21,22] . Selamat
et al
[23] brugte Illumina Infinium HumanMethylation27k platform til at karakterisere genom-dækkende methylering af ~ 27.000 CpG sites i 59 matchede T /NT lunge adenocarcinom prøver, og koblet det til transkriptom arrays. Omfattende molekylær profilering af 230 patienter (adenocarcinom) og 178 patienter (planocellulært karcinom) ved TCGA [24,25] gjort brug af en udvidet version af den samme platform, HM450k, der afhører mere end 480.000 CpG sites, på tværs CpG øer og kyster i det humane genom.
Vi hypotese, at en uvildig genom-dækkende tumor vs ikke-tumor søge efter differentielt methyleret loci vil føre til identifikation af nye og kendte loci dereguleret i lungekræft. Derudover undersøger de samme enheder, for differentiel genekspression ville tillade identifikation af større effekt DM loci, i kraft af potentielle indvirkning på udtryk. For at teste disse hypoteser, vi bruges HJÆLP assay [26] til at analysere CpG-methylering af 24 par af tumor (T) og tilstødende ikke-tumor (NT) humane prøver. Dette assay forespørgsler 1,2 millioner CCGG motiv-definerede fragmenter tværs genomet ved restriktionsenzymer
Hpa
II (methylering følsom) og
Msp
I (methylering resistent) for at isolere differentielt methylerede fragmenter af genomet. Disse fragmenter er derefter adaptorligerede og forstærkes og mærkes, hvorefter de co-hybridiseret til en høj densitet microarray. Methylering opdages ved enderne af enzym-genererede fragmenter (CCGG sites) og målt i forhold til
MSP
I-genererede fragmenter til
Hpa
II-genererede fragmenter. Ræsonnement at methylering-dereguleret gener kan være mere synlige, hvis beslægtet /nærtliggende genekspression er ændret, vi yderligere undersøgt sammenslutning af forskelligt methylerede (DM) regioner med differentielt udtrykte (DE) gener, ved anvendelse af mRNA udtryk data fra samme parrede T og NT kirurgisk resektion prøver.
Resultater
genom-dækkende undersøgelse af differentielt methyleret loci i lunge tumor versus ikke-tumor
Blandt 24 NSCLC lunge resektion donorer (S1 tabel), ved hjælp af HJÆLP-microarray analyse identificerede vi 452,754 Hpall fragmenter markant forskelligt methylerede (DM; p 0,05, FDR-korrigerede) i tumor versus tilstødende ikke-tumor (tabel 1). Af disse DM sites, blev 57% fundet i kodende regioner (omfattende 38% af disse CCGG sites repræsenteret i array). (Figur 1) En anden 39% af disse blev fundet i intergeniske regioner (48% af disse websteder repræsenteret i array) og det meste hypomethylated i tumorer. Ca. 7% blev fundet i promotorregioner (26% af disse steder på arrayet). Gene initiativtagere (PR) og gen organer (GB) viste både hyper- og hypo-methylering. (Tabel 1). Promotor hypometylering overskredet hypermethylering i antal (tabel 1). Baseret på en permutation test foretaget ved hjælp af stikprøver inden rummene (PR /GB /IG) fandt vi, at DM loci er markant overrepræsenteret i gen kropsregioner (p 2.2E-16).
452754 loci er væsentligt forskelligt methylerede (DM) mellem T og NT baseret på en FDR 0,05. Flertal af DM loci hypomethylated i T vs NT.
(A) Ca. 91% af de 1,2 millioner loci repræsenteret i HELP microarray er placeret i gen-krop (GB) og intergeniske (IG) regioner, med et lille mindretal (9%) af loci placeret inden promotorer (PR). (B) statistisk signifikans (Y-akse) kontra delta (X-aksen) (størrelse) af DM. Delta (X-aksen) angiver forskellen i methylering mellem tumor (T) vs non-tumor (NT) i et givet locus. Loci hypermethyleret i T i forhold til NT har delta 0. P-værdi (Y-aksen) beregnes på grundlag af Benjamini Hochberg justeret FDR. Hos FDR p 0,05, 433.505 loci tværs af alle genomiske rum findes at være differentielt methyleret i T vs NT. Røde prikker angiver statistisk signifikant DM loci.
Størrelsen af differential methylering (delta) varieres ved rum og retning af forandring. Moderat /store grader af DM hypermethylering i PR og GB (delta 1; PR = 74%, GB = 63%) var mere udbredt end små grader (1 delta 0,5; PR = 24%, GB = 33%) af hypermethyleringsassocierede ændringer i disse rum (fig 2). Omfanget af moderate /store hypermethyleringsassocierede ændringer var forskellig fra hypometylering ændringer, hvor den moderate /stor fordeling af genomisk region var PR = 12%, GB = 14%, IG = 17%. Inden tumor initiativtagere, blev CG øer (CGI) og CG kyster (CGS) oftere hypermethyleret end hypomethylated (Fig 2B). Samlet fordeling af DM loci varieres ved PR genomisk placering (CGI, CGS, andet) blandt alle NSCLC histologier (ChiSquare p = 2.2E-16) og blandt adenocarcinom-only (ChiSquare1.9E-4). Der var betydelig DM uden for CGI og CGS.
(A) Alle NSCLC histologier DM blev klassificeret som ubetydelig, lille eller moderat baseret på den absolutte værdi. (1 abs delta 2 er moderat /Large, 1 abs delta 0,5 er Lille, 0,5 abs delta 0 er ubetydelig). DM loci med FDR p 0,05 baseret på parret t-test blev betragtet til denne analyse. Flertal af hypermethylering i tumorer er observeret at være af moderat /stor størrelsesorden i initiativtagere og gen-organer, mens der i de intergeniske regioner, små ændringer er mest hyppige. Størstedelen af hypometylering er observeret at være af lille størrelse i alle tre rum. En betydelig del af hypometylering ændringer er af ubetydelig størrelsesorden endnu statistisk signifikant. (B) Retning af DM og fordelingen inden initiativtagere kategoriseret baseret på placering i CG-øer og CG-kyster. Inden for kategorien af DM promotor loci, hypermethylering er hyppigere i tumorer i forhold til hypometylering for disse loci inden CG-øer og CG-kyster. Samlet DM forskelle varierer fra PR genomisk placering (CGI, CGS, andet); alle NSCLC histologier var ChiSquare p = 2.2E-16; adenocarcinom kun histologi ChiSquare p = 1.9E-4.
Individuelle cancer gener identificeret ved differentiel methylering
top 25 differentielt methylerede loci inden promotorområder og gen organer er opført (S2 Tabel). Kort sagt, for alle histologier blev observeret kombineret DM i mange initiativtagere (S2A tabellen) [hypermethylering i
C7orf54
,
DARS
,
SPTAN1
,
DOM3Z
,
PCNX
,
CTNNAL1
, andre; hypometylering i
NQO1
,
SIRP1B
,
UNC5CL
,
NFIA
,
CST1
, andre], og i gen organer [hypermethylering i
NOL10
,
ARHGEF12
,
UST
,
RGS3
,
MBNL2
, andre; hypometylering
FBXL7
,
RYR2
,
NTRK3
,
ADAMTS12
,
PARK2
, andre]. For adenocarcinom specifikt DM blev observeret i initiativtagere [hypermethyleret
RASL12; SPTAN1
,
mir-26a
, hypomethylated
NQO1
,
SIRPB1
,
NF1A
] og gen-organer [hypermethyleret
AKAP13
,
ANK familie
,
PRKCE
,
ROS1
; hypomethylated
FAM171A1
,
PARK2
,
BCAS3
,
RHOJ
] og mange andre.
Heat kort over top 50 mest forskelligt methyleret loci inden for undergruppen af adenocarcinomer (fig 3A og 3B) Salg
(A) -promotor regioner; og (B) Gene organ regioner. Adskillige gener viser differentiel methylering (DM) ved mere end ét locus og vises flere gange i Heatmap. . Blå = Ikke Tumor, Rød = Tumor
top 50 mest DM loci (FDR justeret p 0,05 sorteret efter størrelse delta), afspejler adskillelse af T og NT i de fleste af de parrede prøver undtagen i prøverne 603T, 653T og 542T. Flere loci inden for samme gen show DM, hvilket resulterer i en gentagelse af gen navne i varmen kort. De multiple loci inden et gen (f.eks PR:
TMEM88
,
GIMAP6
,
RUSC2
, andre; GB:
CDH13
,
CACNA203
,
NOMO3
, andre) havde en tendens til at være overensstemmende, omend ufuldstændigt, med retningen af DM (hyper- vs hypometylering).
CpG methylering validering
methylering af tre repræsentative DM CCGG loci valgt på grundlag af DM størrelsesorden (en i promotoren for DARS og to i promotoren for RGS3) blev kvantitativt bestemt af den høje opløsning Sequenom MassARRAY
® metode, og sammenlignet med resultaterne fra HELP microarray-baserede assay ved anvendelse Spearman rangorden korrelation software [27]. Korrelationen (rho) var 0,72 (p = 0,0006), hvilket indikerer, at resultaterne af HELP assay signifikant korreleret med reference- resultaterne af Sequenom MassARRAY
® henvisning assay (S1 Fig)
Identifikation af diskriminerende klassificører
Den gennemsnitlige nøjagtighed for top 100 eller top 25 DM loci tumor versus modeller ikke-tumor klassificering, alle NSCLC histologier i aggregat, var 87% og 90% hhv. På adenocarcinom data delmængde, den gennemsnitlige nøjagtighed for top 100 og top 25 DM loci var 80% og 79% respectivelyIn Generelt klassifikationsmodeller tendens til at være mere specifik end følsomme. (S7 tabel). To loci (
LOXL4
og
LINC00841
) blev gentagne gange valgt inden for top DM loci under klassifikationsprocessen.
Methylering x Expression Flet
DNA loci blev integreret med tidligere genererede mRNA transkriptom microarray data blandt de 21 T-NT-par, hvor begge datasæt var til rådighed. (S2 Fig). Denne analyse gav n = 433.666 DM loci i alle rum (tabel 2). For eksempel, at samle alle histologier identificerede vi n = 75 loci, der viste hypermethylering i PR regioner og samtidig nedregulering af mRNA-ekspression ved microarray. Der var n = 219 loci inden GB regioner, der viste samtidig hypermethylering og opregulering af udtryk.
Alle histologier (21 par).
promotor-specifikke underkammer distribution (CGI , CGS, andet) af kanoniske DMxGE relationer (
e
g
promotor hypermethylering:.. gen nedregulering)
versus
ikke-kanoniske relationer (
e
g
promotor hypermethylering:.. gen opregulering) vises i figur 4. Samlet set indenfor PR regioner, CGI mønstre tendens til at følge kanoniske DM: GE mønstre (første bar i hver af de længst til venstre to søjlediagram-trillinger inden et panel) noget mindre hyppigt end de andre promoter rum. Bemærkelsesværdige er, at ikke-kanoniske DM: DE relationer var omtrent lige i den samlede frekvens til kanoniske relationer, som vurderet af denne analyse. For alle 21 par (alle NSCLC histologier, Fig 4A), overordnede fordeling af DMxDE forskelle varierer fra PR genomisk placering (CGI, CGS, andet), ChiSquare p = 3.32E-4. Ligeledes inden for sæt adenokarcinomer (Fig 4B), behøver overordnede DMxDE forskelle varierer fra PR genomisk placering (CGI, CGS, andet), ChiSquare p = 1.10E-7. Størstedelen af PR DM loci er forbundet med hypermethylering når DM loci er inden CG øer. Denne effekt er bemærkelsesværdig blandt adenocarcinomer subset samt, hvor DM hypermethylerede loci i CG øer er for det meste forbundet med nedregulering af genet.
Analyse af DM loci inden promotorregioner og deres overlapning med differentiel genekspression. (Venstre panel A) Alle 21 par (alle NSCLC histologier), overordnede forskelle varierer fra PR genomisk placering (CGI, CGS, andet), ChiSquare p = 3.32E-4.
(Højre panel B)
Inden sæt adenokarcinomer overordnede forskelle varierer fra PR genomisk placering (CGI, CGS, andet), ChiSquare p = 1.10E-7. Flertal af DM promoter loci er forbundet med hypermethylering når DM loci er inden CG øer. Denne effekt er mere udtalt blandt adenocarcinomer, hvor DM loci i CG øer er for det meste forbundet med nedregulering af genet. KEY: “M” = methylering, “E” = udtryk. Opadgående pil viser stigning og nedad pil viser fald.
Antallet af loci fås fra udtryk-methylering overlay vises i 3D-koordinater i panel A (S3 Fig). Genomisk koordinater blev også vist ved Circos parceller; et eksempel på kromosom 3 vises i panel B (S3 Fig). Disse paneler angiver de overordnede mønstre af gen legeme og promotor-methylering og ledsagende genekspression ændringer. Overlappet mellem DM og GE for GB var hyppigere end PR (delvis på grund af relativ overrepræsentation af GB
versus
PR regioner på HELP microarray (tabel 1). Den kanoniske mønster oftest ses i GB var hypometylering og nedregulering (S3 fig).
Eksempler på kvantitative forhold DM til GE i initiativtagerne og gen-organer vises i udvalgte scatter plots (S4 fig). de fleste gener, der var kvalitativt kanoniske for den DM⬄GE forhold viste en tvetydig kvantitativt forhold (vises ikke). de gener, der er udvalgt til visning gør eksemplificere en kanonisk forhold
de øverste otte differentielt udtrykte (dE) gener forbundet med promotor DM loci (S3 tabel:
FILIP
,
HBEF
,
TMEM88
,
VWR
,
CASP12
,
NQO1
,
CST
,
XAGE1D
) gennemgik en kvantitativ kontrol af microarray-baserede GE udtryk ændringer, hjælp QRT-PCR skaleret til
GAPDH
intern husholderske. S5 figur viser disse resultater, viser generel overensstemmelse mellem retningen af GE mellem de to platforme (microarray og QRT-PCR;
r
2
= 0,9367815, s 0,0007), om end med en komprimeret dynamikområde af microarray data, som er typisk i litteraturen [28].
Individuelle gener afsløret af DM x GE Merge
Alle NSCLC histologier
: overlay DM x DE overlay (S3 Table) gav yderligere genomisk DM loci med kanoniske ekspressionsmønstre (
e
g
PR hypermethylering:.. mRNA nedreguleres og PR hypometylering: mRNA opreguleres; GB hypermethyleret: mRNA opreguleres og hypomethylated: mRNA nedreguleres) [PR n = 113; GB n = 3972] (tabel 2). Bemærkelsesværdige hypermethylerede PR loci med gensidig faldt udtryk GE var
HBEGF
,
DPT
,
AGER
,
SPARCL1
,
PTPRM
,
ARHGEF6
,
TMEM88
,
SEMA6A
. De, PR hypomethylated loci med øget GE var
NQO1
,
CST1
,
TNS4
,
FUT2
,
MELK
,
FAM83A
,
MMP9
,
og SLCO1B3
. De GB loci med overensstemmende methylering og udtryk inkluderet: hypermethyleret /øget GE:
FERMT1
,
SLC7A5
,
FAP
,
KRT15
,
ETV4
,
TFAP2a TPX2
,
FOXM1
; hypomethylated /faldt GE:
AGBL1
,
RHOJ
,
LDB2
,
GHR
,
ITGA8
,
ABCB1
,
SEMA5A
,
GPM6A
.
Inden for kategorien af adenokarcinomer alene, vi fusionerede resultaterne af DM med dE, og opdagede flere loci med differentiale methylering i initiativtagere eller gen organer og sammenhørende genekspression ændringer. Hypermethyleret PR loci med GE nedregulering omfatter
RPL23AP32
,
CTNNAL1
,
HBEGF
,
TMEM88 og CASP12
. Loci viser PR hypometylering og opregulering omfatter
NQO1
,
CST1
,
XAGE1D
,
IGKC og AIM2
. DK loci viser hypermethylering og opregulering omfatter
FAP
,
NLN
,
TPX2
,
og KIF26B
og andre. DK loci viser hypometylering og nedregulering omfatter
AGBL1
,
RHOJ
,
LDB2
,
GHR
,
ITGA8 *
og andre ( S3 Table)
Methylering-Expression forhold i CG-øer og CG-kyster
Vi forespørges sammenhængen mellem DM og dE til DM loci placeret inden promoter CG øer (CGI) og CG kyster ( CGS; defineret som 2 kb opstrøms for en CG island, fig 4; S5 Table). Vi observerede kun en lille procentdel af loci (3-11%), der udviste DM i CGI eller CGS forbundet med den forventede ændring i gen-ekspressionen af den nærmeste genet. Disse omfatter gener såsom
TMEM88
,
S1P1R
,
FZD4
,
GIPC2
,
DNAJB4
,
ADAMTS1
(hypermethyleret i CGI og CGS og nedreguleret) og BUB1 (hypomethylated og opreguleret).
Pathway analyser
analyser tilbydes En oversigt over IPA i S6 tabel. Alle DM loci (Bejamini-Hochberg adj p 0,05) svarende til otte kategorier (baseret på genomisk rum, histologi og med /uden genekspression merge) blev hver analyseret med IPA, for at identificere gen netværk beriget inden for sæt DM loci. I alle de otte tilfælde, “Cancer” var den øverste sygdom associeret med input datasæt, selvom de konstituerende gener var forskellige. Canonical veje fra Opfindsomhed videnbase, der viste sig at blive beriget inden for gen-sæt med adj. p 0,05 rapporteres. Tre af netværkene (Alle NSCLC histologier, DM kun, GB; adenocarcinomer DM kun, GB og adenocarcinomer DM + DE begge, PR) var blandt de otte kategorier sig at have en statistisk signifikant association med en kanonisk pathway med adj. p 0,05, og er yderligere beskrevet nedenfor.
IPA Kræft-relaterede Networks skildringer.
Netværk analyse af disse betydelige netværk tabuleret i S6 tabel er sammenfattet i S6 Fig. Displayet viser, at flere gener, der spiller en vigtig rolle i kræftrelaterede veje forskelligt er methyleres i T i forhold til NT i forskellige kategorier, og fremhæver nogle gener, der ikke er kendt for at gøre det. For eksempel, at samle alle NSCLC histologier, S6A Fig viser kræft-relaterede netværk stammer fra IPA af alt DM loci (adj p. 0,05) inden GB på tværs af alle 24 T /NT par. Gener som
EZH2
,
CDH1
,
CDKN2A
og findes
DNMT3A /3B dele på centrale punkter i dette netværk.
EZH2
(hypomethylated) er medlem af Polycomb-gruppen familie og spiller en vigtig rolle i celledeling, vækst, cellecyklusprogression, transkriptionel repression og invasion.
DNMT3A
/3B (hypermethyleret) koder for en DNA methyl-transferase, der er angiveligt at udføre de novo methylering og har en vigtig rolle i transkriptionel repressional signalering.
CDH1
(hypermethyleret) koder E-Cadherin, en kendt overflade adhæsionsmolekyle nedreguleret i kræft. CDKN2A (hypermethyleret) er en inhibitor af CDK4 kinase og er en betydelig tumorsuppressorgen, vides at være muteret eller deleteret i forskellige cancerformer.
ZEB1
, GB hypomethylated, fremhæves også som et centralt knudepunkt i denne kræft-relaterede netværk. Det koder for et zinkfinger transkriptionsfaktor (også kendt som
TCF8
), som er kendt for at være en inducer af epitelial-mesenkymale overgang i NSCLC [29].
Inden for kategorien adenocarcinomer specifikt ( 16 par S6B Fig viser cancerrelateret gen netværk identificeret fra de mest betydningsfulde (justeret p 0,05). DM loci (indenfor GB) Et centralt omdrejningspunkt for dette netværk er genet
AR
(androgen receptor), som viser sig at være GB hypomethylated i tumorer. AR er en transkriptionsfaktor aktiveres af steroidhormon androgen. det spiller en vigtig rolle i celle-vækst, proliferation, celledød og invasion. på grund af en tilsyneladende centrale i denne særlige DM netværk, vi nærmere DM methylering mønster af AR som det vedrører køn. vi observerede, at de to relevante DM fragmenter (indenfor GB) var bemærkelsesværdig for hypermethylering i GB hos mænd i forhold til kvinder i NT væv entydigt (t-test FDR, fragment 1 = 0,041, fragment 2 = 3.76E-5). Supervillin
(SVIL)
, er også et gen ved et knudepunkt for dette netværk (S6B fig), og er GB hypomethylated i tumorer.
SVIL
er en perifer membranprotein, der regulerer cellemotilitet, spredning og er kendt for at forbedre celleoverlevelse ved at interagere med tumorsuppressorgenet p53 og dens downstream mål [30].
adenocarcinom-specifik promotor DM x DE overlay gjorde fremhæve bekendt (
SMAD6
,
TP53
,
CTNNB1
,
NQO1)
samt ukendte lungekræft IPA noder ( S6c fig). Kræften-relaterede netværk er afledt af denne analyse bestod af en enkelt hypomethylated gen promotor (NQO1) på node i en klynge interagere med
TP53
,
HSP70 og NPM1
. Adskillige hypermethylerede genpromotorer herunder
HBEGF
,
SMAD6
,
PTPN13
,
CDH5
og
SFTPC
blev fundet i periferien af netværket. Dette netværk består af flere gener, der ikke er identificeret som DM fra vores undersøgelse, men udgør en del af nettet i kraft af deres tidligere offentliggjorte interaktioner med andre DM loci, som afbildet i åbne /hvide figurer.
Aktuel vs tidligere rygere
prøven sæt af 24 forsøgspersoner bestod af 11 tidligere rygere og 10 nuværende rygere. Vi undersøgte forekomsten af differentielt methyleret loci baseret på rygning status. Ved justeret p 0,05 niveau, blev ingen loci fundet at være DM mellem nuværende og tidligere rygere
Diskussion
Vi rapporterer en methylome sammenligning undersøgelse for et sæt af NSCLC tumorer
versus
den parrede ikke-tumorvæv i kirurgisk resektion prøver for at identificere genom-dækkende methylering signaturer i lungekræft, og filtrere dem for dem relevant for genekspression ændringer fra de samme prøver. Målet er at informere diagnostisk biomarkør igangværende arbejde i laboratoriet, [31] og target identifikation for den fremtidige udvikling i diagnostiske og forebyggende /terapeutiske undersøgelser [32,33].
Brug af HELP-analysen, var vi i stand til at forespørge 1,2 millioner diskontinuerlig CCGG loci (~ 1% af methylome) på en måde repræsentativ for alle tre genomisk (PR, GB, IG) regioner. Brug af en FDR justeret p 0,05 som cutoff, 452.754 loci på tværs af alle regioner og histologier viser statistisk signifikant forskellen methylering i tumorer. Fordelingen af disse DM sites var især mere koncentreret i gen organer end i promotorområder, selv overvejer regionale forskelle repræsentation på detektoren microarray, som understøttes af en permutation test.
Undersøgelser hidtil har typisk fokuseret på promotor methylering i lungekræft, udnytte promoter-fokuserede brugerdefinerede microarrays [10,15,34] eller perle arrays [23,35] og dermed ofte forespørgslen kun for pre-udvalgte genomiske regioner og loci. Dette er en af de få undersøgelser til dato, at mere agnostically undersøger genom-dækkende methylering på tværs af alle områder af lungekræft genom i flere prøver. De regioner i genomet analyseret ved HJÆLP assayet afhænger forekomsten af CCGG sites i genomet, og ikke af nogen forudgående funktionel eller et segment-wise klassificering af loci. Den HJÆLP assayet er mindre promotor forspændt (GB og IG regioner er repræsenteret 3,5x gange promotorregioner), hvorved der tillades for opdagelsen af hidtil ukendte hændelser knyttet til methylering i andre genomiske regioner i tumorprøver [36]. Men HJÆLP analysen misser ikke-CCGG indlejret CpG sites samt de CCGGs der ville definere en størrelse rækkevidde uden for målet fragmentet størrelsesområde (200-2000bp). HJÆLP (i modsætning Infinium HM arrays) er ikke fokuseret på at opdage sammenhængende CpG’er af foruddefinerede genpromotorer. Mens størrelsen af de samlede DM forskelle mellem tumorer og nontumor lungevæv i et givet locus tendens til at være lille (generelt 2 gange), beroligende er, at validering af forudvalgt DM loci var gunstig sammenlignet med den kvantitative henvisning teknik ( Sequenom MassARRAY
®).
Ved at undersøge gen lister over top DM loci opdaget blandt andre offentliggjorte genom-dækkende studier i lungekræft til dem rapporteret i vores undersøgelse, fandt vi, at, som forventet, grad af overlapning mellem vores studier og andre er beskeden, muligvis udtryk for forskellene i HELP-platform (som registrerer fragmenter afgrænset af individuelle CpG sites, men ikke yderligere fragment-interne CpG steder), og de målregioner forespørges (som i HELP er ligeligt fordelt mellem PR, GB, og IG områder af genomet. Derudover kan vi konstatere, at omfanget af overlap på tværs af studier, der brugte samme microarray-baserede methylering (for fx Infinium array) ([23,24,35] var også ikke stor. Dette kunne stamme fra forskellige fag og prøve heterogenitet faktorer, og kriterier, der anvendes til at rangere DM loci. For eksempel Sandoval
et al
[35] identificerede en
HOXA7
region blandt de øverste mest variable CpG initiativtagere, mens det samme locus ikke er rapporteret i TCGA undersøgelse [24], der udnytter samme platform. På den anden side, begge disse undersøgelser rapporterer forskellen methylering af
HoxA9
locus. Begge disse loci ikke regne på listerne over top DM loci fra vores undersøgelse
Alt i alt resultater fra denne undersøgelse omfatter, at:. Der er mange individuelle DM loci /gener, især i gen organer (S2 og S3 Borde ); der er mange ikke-kanoniske DMxDE relationer; og genelists og netværk relationer omfatter både tidligere indregnet og myriader tidligere ukendt loci. Som tidligere erkendt, genomet er generelt mere hypomethylated, men viser også promotor hypermethylering i kræft versus parrede ikke-kræft væv, som det var tilfældet fra tidlig genom-dækkende undersøgelser af forskellen methylering i lungekræft [2,21-23].
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.