PLoS ONE: epigenetisk inaktivering af miR-338-3p Bidrager til tumorgenicitet for Gastric Cancer ved Målretning SSX2IP

Abstrakt

MicroRNA er for nylig blevet anerkendt som spiller en fremtrædende rolle i tumorgenese og metastase. Her rapporterer vi, at miR-338-3p epigenetisk blev stille i mavekræft, og dets nedregulering var signifikant korreleret med gastrisk kræft klinisk-patologiske træk. Slående, genoprette miR-338-3p udtryk i SGC-7901 gastrisk cancerceller hæmmede proliferation, migration, invasion og tumorgenicitet

in vitro

in vivo

, i det mindste delvist gennem induktion af apoptose. Desuden vi demonstrere onkogen SSX2IP er et mål for miR-338-3p. Vi foreslår, at miR-338-3p fungerer som en tumor suppressor i mavekræft, og status methylering af dens CpG øen kunne tjene som en potentiel diagnostisk markør for mavekræft

Henvisning:. Li P, Chen X, Su L, Li C, Zhi Q, Yu B, et al. (2013) epigenetisk inaktivering af miR-338-3p Bidrager til tumorgenicitet for Gastric Cancer ved Målretning SSX2IP. PLoS ONE 8 (6): e66782. doi: 10,1371 /journal.pone.0066782

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: Januar 17, 2013; Accepteret: 10 maj 2013; Udgivet: 24 juni 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (tal 30872476, 81072012, 81172324, 91229106, 30900670 og 81.272.749), Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (tal 10jc1411100, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 11jc1407602 og 101.409.042.000), Shanghai Key Disciplin ( S30204), og de vigtigste projekter i National Science Teknologi Pillar Program for Kina (tal 2008BA152B03 og 2011BA203191), Kina Postdoc Science Foundation (antal 2011M500796). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskript

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Gastrisk kræft er en malignitet med høj forekomst og den anden hyppigste årsag til kræft død på verdensplan [1]. Den tidlige diagnostiske sats for mavekræft er lav, og patienter er normalt svært at blive diagnosticeret, før kræften har udviklet sig til fremskredent stadium eller metastaser. Det er således af stor betydning at foretage dybdegående undersøgelse af patogenesen af ​​mavekræft og til at lede efter nye molekylære beslutningstagere og terapeutiske mål.

MikroRNA’er er små RNA, der regulerer genekspression, og de er involveret i en række biologiske signalveje [2]. Flere undersøgelser har afsløret signifikant forskel af microRNA ekspressionsprofil mellem tumorceller og celler afledt af normalt væv, hvilket indikerer, at microRNA har spillet en vigtig rolle i tumorigenese [3], [4]. Således har MikroRNA’er nylig blevet en hotspot af genetisk diagnose og target behandling som nye onkogener eller suppressor gener [5], [6]. Unormal udtryk for microRNA i væv eller serum er nært beslægtet med flere menneskelige maligniteter, herunder gastrisk kræft [7], [8], og flere ned-regulerede microRNA i gastrisk kræft væv har tumor undertrykke funktioner. For eksempel blev Let-7 microRNA familie først fundet som en repressor af RAS, undertrykke RAS og c-myc ekspression på translationel niveau [9]. Ekspressionsniveauet af lad-7a reduceres væsentligt i gastriske tumorer, mens Ras-proteinet er betydeligt højere i gastrisk tumor [10]. Desuden har miR-15b, miR-16 og miR-21 etc været forbundet med udvikling og klinisk diagnose af mavekræft [11], [12]. Vores gruppe har også rapporteret anticancer rolle miR-126, miR-409-3p og miR-155 i gastrisk kræft [13] – [15]

MicroRNA microarray blev udført for at detektere miRNA profiler i gastrisk. kræft, og vi fandt, at miR-338-3p var betydeligt ned-reguleret (upublicerede data). MIR-338-3p, placeret på kromosom 17q25.3 med en længde på 22 nt, blev først rapporteret i prion-induceret neurodegeneration som ekspressionen af ​​MIR-338-3p reduceres i hjernerne hos mus inficeret med muse-tilpasset skrabe [ ,,,0],16]. MIR-338-3p kunne regulere mRNA-niveauet af sin vært gen Apoptose-associerede tyrosin kinase (AATK) i rotte neuroner [17]. På den anden side, miR-338-3p var opreguleret hos patienter med sporadisk amyotrofisk lateral sklerose (sals), en anden form for nervesystemet læsioner [18]. Vigtigere, en rolle MIR-338-3p i tumorigenese tidligere er blevet foreslået, som MIR-338-3p nedreguleres i rektal cancer [19], og reguleres af Hepatitis B virus X protein (HBx) at inhibere proliferation og invasion af hepatomaceller ved binding til målgener CyclinD1 og smoothened i hepatocellulært carcinom [20] – [22]. Men er stadig ukendt rolle miR-338-3p i GC.

I den foreliggende undersøgelse, vi yderligere analyseret nedreguleringen udtryk for miR-338-3p i GC væv sammenlignet med patient-matchede normale væv, og fastslog, at ekspressionsniveauet af mIR-338-3p var tæt korreleret med de clinicopathologic variabler af GC. Ektopisk ekspression af MIR-338-3p inhiberer proliferation, invasion og metastase af gastriske cancerceller, reducerer tumorigene evne gastriske cancerceller i nøgne mus, og fremmer apoptose. Vi viser også, at MIR-338-3p kan fungere som en tumorsuppressor ved direkte målretning SSX2IP. Således er vores resultater antyder, at MIR-338-3p er en potentiel diagnostisk markør og terapeutisk mål af gastrisk cancer.

Materialer og metoder

1. Cellelinjer og Kultur

De humane mavekræft cellelinjer SGC-7901, blev NCI-N87, BGC-823 og AGS købt hos Shanghai Institutes for Biologisk Institut, Chinese Academy of Sciences [23] – [26]. KATO-III og SNU-1 blev erhvervet fra ATCC (American Type Culture Collection) [24], [27], MKN28 og MKN45 blev opnået fra japanske Cancer Research Resources Bank [28], den immortaliserede gastrisk epitelcellelinje, GES -1, var en gave fra Prof. Feng Bi (Huaxi Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan-provinsen, PR China) [29], [30]. HEK293T, humane embryonale nyre cellelinje, blev bevaret i vores institut. De gastriske cancercellelinier dyrkedes i RPMI1640 tilsat 10% FBS (føtalt bovint serum) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2. HEK293T celler blev dyrket i DMEM (Dulbeccos modificerede Eagles medium) suppleret med den samme dyrket tilstand ovenfor.

2. Etik Statement

Skriftligt informeret samtykke i undersøgelsen blev opnået fra alle deltagere. Undersøgelsen Protokollen blev godkendt af den etiske komité i Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University.

3. Vævsprøver

Primære mavekræft væv og de matchede ikke-tumorvæv blev indsamlet fra 66 patienter, der gennemgår radikale gastrostomi ved Institut for Kirurgi, Ruijin Sygehus, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Ingen af ​​patienterne modtog præoperativ behandling. Alle vævsprøver blev indsamlet med patienternes informerede samtykke og bekræftet af den patologiske undersøgelse, og den histologiske skrive var baseret på Laurens klassificering. TNM klassificering definitioner i henhold til den Internationale Union mod Kræft (2002).

4. RNA-isolering og qPCR

Totalt RNA blev isoleret fra cellelinjer og vævsprøver af

mir

Vana ™ miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Kvaliteten og mængden af ​​de RNA-prøver blev vurderet ved standard elektroforese og spektrofotometriske metoder. Ekspressionsniveauet af MIR-338-3p i cellelinier og vævsprøver blev målt ved qPCR og beregnet som beskrevet [13]. Ekspressionsniveauet af SSX2IP mRNA blev målt ved qPCR ifølge TaqMan® genekspression assays protokol (Applied Biosystems). Den GAPDH mRNA niveau blev brugt til normalisering.

5. DNA Isolering og methyleringsanalyse

Genomisk DNA fra vævsprøver blev oprenset under anvendelse DNAzol (Invitrogen). Natriumbisulfit omdannelse blev udført ved anvendelse af Qiagen Epitect bisulfit Kit (Qiagen) i henhold til producenten. De methylering statuer blev udført ved methylering specifik PCR (MSP). De primere til methyleret eller umethyleret DNA er designet af softwaren Methyl Primer Express v1.0 (ABI) .Den methylering fremad primer for CpG af miR-338-3p: 5′-GGCGGAGTTTATGGTTTTC-3 ‘og den reverse primer: 5’ -AAACCTAACCGATCCTCG-3 ‘, den unmethylation fremadrettede primer for CpG af mIR-338-3p: 5′-TGGTGGAGTTTATGGTTTTT-3′ og revers primer: 5’-AAACCTAACCAATCCTCACAA-3 ‘

6.. Forbigående transfektion af miRNA Efterligner

miRNA-338-3p efterligner og negative kontrol efterligner blev købt fra GenePharma (Shanghai, Kina) .Cells blev udsået i cellekultur plader 20 timer før transfektion at sikre 70% celle sammenløb på øjeblik af transfektion. Transfektion af miRNA efterligner i celler blev udført under anvendelse lipofectamin 2000 (Invitrogen) ifølge producentens procedure. De miRNA efterligner arbejdede på den endelige koncentration på 100 nM. Ved 48 timer efter transfektion blev qPCR og Western blot udført.

7. Celleproliferationsassay

Celleproliferation blev vurderet ved WST (vandopløseligt tetrazoliumsalt) under anvendelse af en celle Counting Kit-8 (Dojindo) ifølge producentens instruktioner. Ved 24 timer efter transfektion med miRNA efterligner, celler (2 x 10

3 celler /brønd) blev frø i 96-brønds plader. Pladerne blev inkuberet i 5 dage. Antallet af levedygtige celler blev vurderet ved måling af absorbansen ved 450 nm.

8. Soft kolonidannelse Assay

GC-celler transficeret med miRNA efterligner blev resuspenderet med 0,3% blød agar i RPMI1640 indeholdende 10% FBS og lagdelt på 0,6% størknede agar i RPMI1640 indeholdende 10% FBS i 6-brønds plader (1 × 10

3 celler /brønd). Pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. Kolonier indeholdende mindst 50 celler blev talt.

9. Cellemigration og invasion assay

Migration af celler blev udført ved anvendelse QCM

TM24-Well Kolorimetrisk Migration Assay Kit (Millipore) ifølge producentens instruktioner. For invasionen assayet blev Cell Invasion Assay Kit (Millipore) anvendt ifølge producentens instruktioner. Celler (1 x 10

5) i 300 pi serumfrit medium blev tilsat til de øvre kamre og dyrket i 48 timer. Ikke-migrerende eller ikke-invaderende celler blev fjernet med Bomuld svaberprøver, Celler, som migrerede eller invaderet til bunden af ​​membranen blev farvet med cellefarvende buffer tilvejebragt i assaykittet og talt under mikroskop og fotograferes. Tre uafhængige forsøg blev udført for de samme betingelser.

10. Apoptose Analyse

Cell apoptose analyse blev præformet med Annexin V-FITC Apoptose Detektion Kit I (BD) ifølge producentens instruktioner. Hvert assay blev udført in triplo og gentaget tre gange uafhængigt af hinanden. Funktionen af ​​nuklear krympning forbundet med apoptose var viste Hoechst 33342 (Beyotime) ifølge den protocol.The morfologi blev visualiseret ved et fluorescensmikroskop, der blev anslået ved bølgelængden 350 nm og målt ved 460 nm.

11. Konstruktion af plasmider og luciferaseaktivitet Assay

Fragmentet af vildtype (wt) 3’UTR af SSX2IP eller sites mutant (mut) 3’UTR af SSX2IP indeholdende det formodede MIR-338-3p bindingssteder blev syntetiseret . Fragmenterne blev klonet i pMIR-rapporten luciferase vektor (Ambion), der indeholder

Firefly

og navngivne pMIR /SSX2IP-3’UTR

wt og pMIR /SSX2IP-3’UTR

mut.Cells var frø i 24-brønds plader 24 timer før transfektion. 500 ng pMIR /SSX2IP-3’UTR

wt eller pMIR /SSX2IP-3’UTR

mut blev transficeret i hver brønd sammen med 20 ng pRL-TK vektor (Promega) indeholdende

Renilla

luciferase og 60 pmol af miR-338-3p eller kontrol efterligner. Celler blev høstet efter 48 timer transfektion.

Firefly

Renilla

luciferaseaktiviteter blev målt ved anvendelse af Dual-luciferase reporter assay (Promega) ifølge producentens instruktioner.

12. Stabil transfektion af miR-338-3p Expression Vector

pSilencer-miR-338-3p vektor og pSilencer-miR-kontrol vektor blev transficeret i SGC-7901 celler henholdsvis bruger lipofectamin 2000 (Invitrogen), og valgt med 100 mg /ml hygromycin B (Invitrogen) i 4 uger. Stabilt transficerede celle kloner blev opsamlet og holdt i halvdelen af ​​koncentrationen udvælgelse.

13. Tumor xenograftmodel

SGC-7901-celler (2 × 10

6 celler /mus) stabilt transficeret med pSilencer-miR-338-3p eller pSilencer-styrevektor blev subkutant injiceret i 4 uger gammel mand nøgne mus (Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina) .De mus blev kontrolleret hver uge blev tumor knuder målt med en skydelære. Mus blev aflivet 4 uger efter injektion, og tumorerne blev fjernet og vejet. Tumor volumen blev evalueret ved hjælp af følgende formel:. Volumen = (bredde + længde) /2 × bredde × længde × 0.5236.Tumor vækstkurver blev beregnet

14. Immunhistokemi

Påvisning af SSX2IP blev udført på paraffinsnit med anti-SSX2IP antistof (Abcam, fortynding 1:1000). Immunkomplekset blev visualiseret med Dako REAL

TMEnVision ™ Detection System, peroxidase /DAB, Kanin /mus (Dako) ifølge producentens procedure. Kernerne blev modfarvet med hematoxylin.

15. Statistisk analyse

Forholdet mellem miR-338-3p udtryk niveau og clinicopathologic parametre blev analyseret af Person

X

2 test. Forskellene mellem grupperne blev analyseret ved hjælp af Student

t

test. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), og

P

0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

1. . Den Ekspression af miR-338-3p er nedreguleret i GC cellelinier og væv

For at udforske den rolle, miR-338-3p i GC, vi først sammenlignet udtrykket niveau af miR-338-3p i otte gastriske cancercellelinier med en udødeliggjort normal gastrisk mucosal epitelial cellelinje (GES-1). Som vist i fig. 1A, miR-338-3p var signifikant nedreguleret i GC cellelinjer sammenlignet med GES-1. For at bekræfte dette resultat, vi sammenlignet også udtryk for miR-338-3p i GC væv og tilstødende ikke-tumorvæv. 66 GC parrede prøver blev inkluderet i denne undersøgelse. Resultaterne viser, at den gennemsnitlige ekspressionsniveauet af MIR-338-3p var betydeligt nedreguleret i tumorvæv sammenlignet med de tilstødende ikke-tumorvæv (fig. 1B). Endvidere har vi belyst sammenhængen mellem MIR-338-3p ekspression og clinicopathologic faktorer. Som vist i tabel 1. 59,1% (39/66) af GC prøver viste nedregulering af miR-338-3p under dobbelt cut-off (relativ udtryk forholdet 0,5), denne situation blev anset for at være signifikant ned -regulated. Baseret på denne afskæring, blev de kliniske 66 sager opdelt i to grupper: MIR-338-3p lavere ekspression gruppe (n = 39) og MIR-338-3p højere ekspression (n = 27). Den lavere ekspression gruppen viste hældning i retning af større tumorstørrelse, mere lymfeknudemetastase, dybere lokal invasion og mere avancerede TNM stadie, men ingen signifikant korrelation med alder, køn eller histologisk type (tabel 1).

(A) Relativ udtryk for miR-338-3p i gastrisk cellelinjer og udødeliggjort normal maveslimhinden epitelial cellelinje (GES-1) (*

P

0,05, **

P

0,01) blev påvist ved qPCR. (B) qPCR for ekspression af MIR-338-3p blev udført under anvendelse 66 sager mavekræft væv og matchede tilstødende væv. Gennemsnittet og standardafvigelsen blev vist (**

P

0,01).

2. miR-338-3p er epigenetisk Lyddæmpet i Gastric Cancer

Som epigenetisk inaktivering er en fælles middel til nedregulering af miRNA udtryk [31], [32], besluttede vi at analysere CpG ø fordeling i promotoren region af mIR-338-3p med methyl Primer Express v1.0 software. Resultaterne viste, at der findes CpG-øer i afsnittet (-690 til -241) opstrøms for transkriptionsstartsitet (TSS). Vi undersøgte status for methylering af CpG-øer i promotorregionen ved methylering-specifik PCR (MSP), der dækker området af -366 til -576 (fig. 2A). Ved at bruge MSP, fandt vi, at MIR-338-3p CpG island udførligt blev methyleret i GC cellelinjer sammenlignet med i det gastriske mucosale epitelcellelinie (GES-1). Som forventet, behandling med 5-AZA inducerede signifikant demethylering (Fig. 2B). De repræsentative resultater af MSP-analyse af MIR-338-3p i GC tumorvæv og matches tilstødende ikke-tumorvæv blev vist i fig. 2C. De methylering satser miR-338-3p CpG øer i tumorvæv og tilstødende ikke-tumorvæv fra 66 GC patienter var 78,79% og 24,24%, henholdsvis (**

P

. 0,01, Fig 2D) . Når Receiver Operating Karakteristik kurve og området under kurven (AUC) for methylerede status miR-338-3p i GC blev beregnet, AUC var 0,773 ± 0,042, signifikant højere end den nulhypotesen (

P

0,001), og 95% konfidensinterval var 0,690-0,856 (fig. 2E). Således kunne methylering status MIR-338-3p CpG island tjene som en potentiel molekylær markør for GC.

(A) Skematisk placeringer af CpG sites inden de CpG-øer, der omgiver MIR-338-3p promotor område. (B) MSP analyse for MIR-338-3p methylering i GC cellelinier. M: MSP af methylering specifikke primere; U: MSP af ikke-methylering-specifikke primere (C) Repræsentative resultater af MSP-analyse af MIR-338-3p i gastrisk cancer væv (T) og tilgrænsende normale væv (N). (D) methylering niveauer af miR-338-3p CpG ø i GC tumorvæv og matchede tilstødende ikke-tumorvæv i 66 patienter (78,79% og 24,24%, **

P

0,01). (E) Modtageren transporterende egenskaber kurve af methylering status miR-338-3p. AUC var 0,773 ± 0,042 (

P

0,001), 95% konfidensinterval var (0.690, 0,856)

3.. miR-338-3p Hæmmer mavekræft Cells spredning

Siden miR-338-3p er signifikant nedreguleret i GC, som vist ovenfor, kan det fungere som en tumor suppressor. Derfor Derefter bestemte vi, om overekspression af MIR-338-3p i gastriske cancerceller kan påvirke cellevækst. Syntetisk MIR-338-3p efterligner eller negative kontrol efterligner blev transficeret ind SGC-7901 celler, hvori ekspressionen af ​​den MIR-338-3p er lavest, efterfulgt af WST-assay til overvågning af cellevækst.

ektopisk udtryk for miR-338-3p i SGC-7901 celler blev bekræftet af qPCR og SGC-7901 celler transficeret med miR-338-3p efterligner voksede betydeligt langsommere end kontrolgruppen (fig. 3A) (*

P

0,05, **

P

0,01). For yderligere at karakterisere virkningen af ​​MIR-338-3p på cellevækst, blev blød-ager kolonidannelse assayet udføres. Vi fandt, at antallet af kolonier fra SGC-7901 celler transficeret med MIR-338-3p efterligner var signifikant færre end i kontrolgruppen (Fig 3B-C.) (**

P

0,01) . Konsekvent, hæmning af miR-338 induceret spredning af SGC-7901 (Fig S2 i File S1, *

P

. 0,05). Lignende resultater blev observeret i kontrol GES-1-celler (Fig S1 A-B i File S1, *

P

. 0,05). Sammenfattende disse resultater antydede, at miR-338-3p undertrykker væksten af ​​både GC celler og gastriske epitelceller

I

vitro.

(A) SGC- 7901 celler proliferation blev udført af WST-assay. SGC-7901-celler blev transficeret med MIR-338-3p efterligner eller kontrol efterligner ved en slutkoncentration på 100 nM.The WST-assay blev udført hver 24 timer i 4 dage. Resultaterne er hjælp af tre uafhængige forsøg ± standardafvigelse (*

P

0,05, **

P

0,01).. (B-C) Virkningen af ​​MIR-338-3p på SGC-7901 celler proliferation blev vurderet ved kolonidannelse assayet. SGC-7901 celler transficeret med 100 nM miR-338-3p efterligner eller kontrol efterligner blev sået på 6 brønde. Antallet af kolonier blev talt på en 14

th dag efter podning. (B) Repræsentative fotografier af kolonier. (C) Kolonier blev talt. Resultaterne var hjælp af tre uafhængige eksperimenter ± S.D. (**

P

0,01).

4. miR-338-3p Forhindrer Migration og Invasion af GC Celler

in vitro

Baseret på den idé, at miR-338-3p fungerer som en tumor suppressor af GC, vi nærmere dens virkninger på cellemigration og invasion, en kritisk determinate af malign progression og metastase. Som vist i fig. 4, at antallet af vandrende SGC-7901 celler transficeret med miR-338-3p efterligner var betydeligt mindre end kontrolgruppen (105,00 ± 11.16 vs 145,00 ± 7,00, **

P

. . 0,01 Figur 4 A-B), og antallet af invasive SGC-7901 celler transficeret med miR-338-3p var signifikant mindre i forhold til kontrolgruppen (41,33 ± 4,04 vs 76 ± 10,54, **

P

0,01. fig. 4 C-D). Konsekvent, hæmning af miR-338-3p induceret migration og invasion af SGC-7901 celler (Fig S3 i File S1, *

P

. 0,05). Derimod miR-338-3p havde ingen indflydelse på migration af GES-1 (fig. S1 E i File S1), sandsynligvis fordi GES-1 celler mangler migration og invasive karakter af kræftceller. Disse resultater viste en rolle miR-338-3p hæmme både migration og invasion af GC celler.

(A) Repræsentative fotografier af migrerende celler på membranen (forstørrelse 100 ×). (B) Gennemsnitlig vandrende celle antal tre uafhængige forsøg ± SD (**

P

0,01). (C) Repræsentative fotografier af invasive celler på membranen (forstørrelse 100 x). (D) Gennemsnitlige invasiv celle antal på tre uafhængige eksperimenter ± S.D. (**

P

0,01).

5. miR-338-3p kan fremkalde mavekræft Cells Apoptose

For at belyse den mekanisme af miR-338-3p på GC vækst celle hæmmende effekt, vi testede apoptose analyse ved flowcytometri. Resultaterne viste, at den apoptotiske sats blev øget betydeligt i miR-338-3p efterligner transficeret gruppen sammenlignet med kontrol efterligner transficeret gruppe (**

P

0,01) (. Figur 5A-B). Vi undersøgte yderligere morfologiske træk af apoptose, herunder kondenseret kromatin og nuklear fragmentering af Hoechst 33342 farvning, og bekræftede, at den apoptotiske sats blev øget i miR-338-3p efterligner transfekterede celler (fig. 5C). Konsekvent, hæmning af miR-338 hæmmede apoptose af SGC-7901 celler (Fig S4 i File S1, *

P

. 0,05). Lignende resultater blev observeret i kontrol GES-1-celler (Fig S1 C-D i File S1, **

P

. 0,01). Disse resultater viste, at overekspression af miR-338-3p inducerer apoptose i GC celler, som kan bidrage til de væksthæmmende egenskaber af miR-338-3p.

(A) Repræsentative histogrammer skildrer apoptose af SGC-7901 celler kortvarigt transficeret med miR-338-3p efterligner eller kontrol efterligner. Celler blev farvet med PI og Annexin V-FITC ved 48 h efter transfektion. (B) Procentdelen af ​​apoptotiske celler fra tre uafhængige forsøg ± S.D. er vist (**

P

0,01). (C) Repræsentative histogrammer skildrer nukleare morfologi SGC-7901 celler forbigående transficeret med miR-338-3p efterligner eller kontrol efterligner celler med Hoechst33342 (forstørrelse 200 ×).

6. miR-338-3p Hæmmer Tumorigenicitet og Øger Apoptose

in vivo

Vi næste testede, om ektopisk udtryk for miR-338-3p kunne påvirke væksten og apoptose af gastrisk tumor

in vivo .

SGC-7901-celler blev transficeret med miR-338-3p ekspressionsvektor (p

Lyddæmper

-miR-338-3p) eller kontrol vektor (p

Silencer

-miR -kontrol). De stabile kloner med enten p

Lyddæmper

-miR-338-3p eller p

Lyddæmper

-miR-kontrol blev udvalgt og injiceret subkutant i nøgne mus, og tumordannelse blev overvåget. SGC-7901 celler transficeret med miR-kontrol viste progressiv vækst, men blev hæmmet, når ektopisk udtryk for miR-338-3p. Efter 28 dage blev nøgne mus aflivet, og de tumor vægt og volumen blev målt (fig. 6 A-E). Den gennemsnitlige vægt af tumorer som følge af pSil

encer

-miR-338-3p celler gruppe var signifikant mindre end tumorer fra p

Silencer

-miR-kontrol celler gruppe (1200 ± 193,26 mg vs 1800 ± 229,52 mg, **

P

. 0,01)

(A-C) Fotografier af tumorer afledt for pSilencer-miR-338-3p eller pSilencer-kontrol vektor stabilt transficeret SGC- 7901 celler i nøgne mus. (D) Vækst kinetik for tumorer i nøgne mus. Tumor diametre blev målt hver 7 dage (**

P

0,01). (E) Gennemsnitlig vægt af tumorer i nøgne mus. Middelværdier ± S.D. blev vist (**

P

0,01). (F) Repræsentative fotografier af TUNEL analyse af tumor prøver fra nøgne mus (forstørrelse, 200 ×). (G) Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev talt. Betyder ± SD (**

P

0,01).

For at undersøge, om apoptose bidrager til denne observerede

in vivo

tumor væksthæmning på miR-338 -3p overekspression, blev TUNEL assay udført i tumorvæv. Resultaterne viste, at tumorvæv fra p

Lyddæmper

-miR-338-3p indeholdt betydeligt mere positiv farvning celler sammenlignet med kontrolgruppen (**

P

. 0,01, figur 6F-G ). Således er vores resultater indikerede, at MIR-338-3p inhiberer gastrisk tumorigenese

in vivo

, i det mindste delvist ved at inducere apoptose in situ.

7. miR-338-3p Mål 3′-UTR af Oncogene

SSX2IP

Som miRNA ofte regulere ekspressionen af ​​målgener, vi søgte miR-338-3p s formodede mål ved hjælp af online søgeværktøjer (f.eks Targetscan, Microrna.org og PicTar). Generne forudsagt af alle anvendte programmer blev betragtet kandidat mål for miR-338-3p. Blandt alle de hits, SSX2IP forårsagede vores opmærksomhed, tidligere undersøgelser viste, at SSX2IP er en akut myeloid leukæmi-associeret antigen og et potentielt immunterapi mål for leukæmi [33] – [35], og vores tidligere arbejde viste, at SSX2IP fremmer invasion og migration af hepatocellulære carcinomceller og bidrager til kemoterapi modstand [36].

Et potentielt mIR-338-3p bindingssted blev forudsagt i 3’UTR af SSX2IP (fig. 7A). For at validere denne interaktion, vi sætter en vildtype eller mutant 3’UTR-fragment af SSX2IP i pMIR-RAPPORT luciferase vektor. De resulterende konstruktioner blev co-transficeret med MIR-338-3p efterligner eller kontrol efterligner i HEK293T celler efterfulgt af luciferase reporter assay. Den relative luciferase aktivitet pMIR /SSX2IP-3’UTR

vægt, men ikke pMIR /SSX2IP-3’UTR

mut, blev signifikant undertrykt af miR-338-3p (**

P

.. 0,01) sammenlignet med den af ​​kontrol- efterligner (fig 7B), hvilket indikerer, at mIR-338-3p direkte binder til 3’UTR af SSX2IP at fungere som en suppressor

(a) Skematisk diagram af de formodede bindingssteder af miR-338-3p målrettet 3’UTR af SSX2IP. (B) miR-338-3p efterligner nedreguleret luciferaseaktiviteter kontrolleret af vildtype 3’UTR af SSX2IP (**

P

0,01), men påvirkede ikke luciferaseaktivitet styret af mutant 3’UTR af SSX2IP. Resultaterne er gennemsnit af tre uafhængige forsøg ± S.D. (C) SSX2IP, caspase-3 og Pro-casepase-3 blev detekteret ved Western blot ved 48 timer efter transfektion med MIR-338-3p og kontrol efterligner. (D) SSX2IP mRNA i SGC-7901 analyserede celler af qPCR ved 48 timer efter transfektion med miR-338-3p og kontrol efterligner.

Vi næste undersøgte indflydelsen af ​​miR-338-3p på ekspressionen af ​​SSX2IP, ved at måle mRNA og protein niveauer af SSX2IP efter transfektion SGC-7901 celler med mIR-338-3p eller kontrol efterligner. Som vist i fig. 7C-D, miR-338-3p havde ingen effekt på den

SSX2IP

mRNA niveau målt ved qPCR, men forårsagede betydelig reduktion af proteinniveauet SSX2IP sammenlignet med kontrol-transficeret. Disse resultater antyder, MIR-338-3p undertrykker ekspressionen af ​​SSX2IP på post-transkriptionel niveau, sandsynligvis ved binding til 3’UTR af SSX2IP. Især vi fandt også, at Capase-3 og procasepase-3, to vigtige apoptose gener, blev reduceret tilsvarende (fig. 7C).

8. Ekspressionen af ​​MIR-338-3p er omvendt korreleret med ekspressionsniveauet af SSX2IP Protein i Gastric Cancer

MIR-338-3p nedreguleres i gastrisk cancer og SSX2IP understøttes til et target-gen af ​​MIR-338 -3p, det forfremmet os at spekulere, at SSX2IP kunne være overekspression i mavekræft væv og i forhold til matchede ikke-tumorvæv.

immunhistokemisk analyse af SSX2IP antigen afslørede situationen for farvning for SSX2IP protein i tumorvæv og matches ikke-tumorvæv i 66 gastrisk cancer samples.65% (43/66) af gastrisk cancer væv viste forhøjede immuostaining for SSX2IP protein sammenlignet med matchede ikke-tumorvæv. Især 84% (31/37) af gastrisk kræft væv viste forhøjede immunfarvning i GC prøver af miR-338-3p lav udtryk gruppe, mens data er 41% (12/29) i miR-338-3p høj udtryk gruppe. Analysen af ​​ekspressionen af ​​miR-338-3p og SSX2IP i mavekræft væv bekræftede således, at der findes omvendt korrelation mellem ekspressionen af ​​miR-338-3p og sit mål gen SSX2IP (Person Chi-square test:

P

0,001, Spearman Correlation:.. r = -0,442,

P

0,001, figur 8)

(A) immunhistokemisk analyse viste, at øget ekspression af SSX2IP var mere hyppigt observeret i gastrisk kræft væv i miR-338-3p lavt udtryk gruppe og omvendt. Tumor Non-tumor (SSX2IP) betyder overekspression af SSX2IP i GC tumorvæv sammenlignet med matchede ikke-tumorvæv, og vice versa. (B) Repræsentative fotografier af immunhistokemisk analyse af SSX2IP i parrede GC tumor /ikke-tumorvæv (forstørrelse, 200 ×).

9. Ektopisk ekspression af SSX2IP redder fænotyper forårsaget af over-producerende miR-338-3p i GC Celler

Hvis SSX2IP er en vigtigste mål undertrykt af miR-338-3p i GC, bør ektopisk ekspression af SSX2IP redde de fænotyper forårsaget af mIR-338-3p overproduktion i GC-celler. For at teste denne idé, og SSX2IP ekspressionsvektor eller tom vektor blev individuelt transficeret i SGC-7901, efterfulgt af cytologiske assays til måling af celleproliferation, migration, invasion og apoptose. Som forventet overekspression af SSX2IP delvist eller helt reverserer den inhiberende virkning af MIR-338-3p i GC-celler på hvert aspekt undersøgte vi (fig. 9 A-D). På den anden side, SSX2IP har ingen indflydelse på ekspressionen af ​​MIR-338-3p (fig. S5 i File S1). Vi konkluderede derfor, at kræften suppressor funktion af MIR-338-3p i GC er i det mindste delvist gennem undertrykke sin målgen SSX2IP.

(A) SGC-7901 celler proliferation blev udført ved WST-assay.

Støtte figurer oplysninger.