PLoS ONE: cyclin B1 blænder Kolorektal Cancer invasion og metastase ved Regulering E-Cadherin

abstrakt

Cyclin B1, en mitotisk cyclin, har været impliceret i malignances. Men dens bidrag til kolorektal cancer invasion og metastase er stadig ikke godt forstået. Her har vi vist, at invasionen og metastase af kolorektal cancer er reguleret af cyclin B1. Overekspression af cyklin B1 blev observeret i kolorektale cancer væv, men dette forhøjede ekspression blev negativt forbundet med lymfeknudemetastaser, fjernmetastase fase, og TNM fase. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse bevist, at lav cyclin B1 ekspression blev forbundet med dårlig samlet overlevelse af patienter med colorectal cancer. Hæmning af cyclin B1 i kolorektale cancerceller forbedret celle migration og invasion af tre forskellige kolorektale cancer cellelinjer. Ved at studere den mulige mekanisme, hvorved cyclin B1 undertrykker kolorektal cancer invasion og metastase, observerede vi, at undertrykkelse af cyclin B1 faldt ekspressionen af ​​E-cadherin-protein-niveau. Vores resultater tyder på, at cyclin B1 kunne undertrykke invasionen og metastaser af kolorektal cancer celler gennem regulering af E-cadherin udtryk, som gør det muligt at udvikle potentielle interventionsstrategier for tarmkræft

Henvisning:. Fang Y, Liang X, Jiang W, Li J, Xu J, Cai X (2015) cyclin B1 Undertrykker Kolorektal Cancer invasion og metastase ved Regulering E-Cadherin. PLoS ONE 10 (5): e0126875. doi: 10,1371 /journal.pone.0126875

Academic Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, KINA

Modtaget: Januar 18, 2015; Accepteret: April 8, 2015; Udgivet: 11 maj, 2015

Copyright: © 2015 Fang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den internationale videnskabelige og teknologiske samarbejdsprojekter i Kina (https://www.istcp.org.cn/) (Grant No. . 2012DFA30410 til Xiujun Cai), og National Science-teknologi Support Plan Projekter af Kina (https://www.most.gov.cn/) (Grant nr 2012BAI14B06 til Xiujun Cai)

Konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

på trods af øget generel bevidsthed, kolorektal cancer er stadig en af ​​de tre førende årsager til malignitet dødelighed på verdensplan [1]. De fleste af de patienter med tarmkræft i den tidlige fase (TNM stadie I og II) kan behandles effektivt af kirurgisk resektion og 5-årige overlevelsesrater for scenen kræftformer tidlige er op til 95% (fase I) og 60-80 % (fase II), hhv. Men de fleste patienter med metastatisk kolorektal cancer i fremskredent stadium (TNM stadie III og IV) er normalt refraktære over for eksisterende behandlinger og har en ganske dårlig prognose, da 5-årige overlevelsesrater falde drastisk til 35% med lymfeknude involvering (fase III ) og til 10%, når sygdommen har spredt sig til fjerntliggende organer (stadium IV) [2-5]. Således metastasedannelse er den afgørende og mest dødbringende hændelse under denne sygdomsforløbet. Faktisk tumormetastase er en kompliceret biologisk proces, der involverer primær tumor angiogenese, cancercelleinvasion, vaskulær /lymfatiske intravasation, fjernt målorgan ekstravasation, og væksten af ​​besatte celler i fremmed mikromiljø til dannelse metastatisk kolonisering [6-8]. Selv dysregulering af signalveje og dysfunktion af mange molekyler er blevet identificeret i cancermetastase, kan de ikke fuldt ud forklare fænomenet kolorektal cancer metastase [2]. Det er således af stor betydning for at afdække de biologiske mekanismer, der ligger metastase i kolorektal cancer og formulere strategier til at gribe ind i denne proces.

Epithelial-mesenkymale overgang (EMT) er kendt som en afgørende mekanisme i kolorektal cancer metastaser og en central regulator af fjernt organ dannelse [9-11]. Under processen med EMT, at epitel-afledte tumorceller tab af celleadhæsion og polaritet, og forstærkning af migrerende og invasive egenskaber, hvilket resulterer i muliggøre tumorceller infiltrere omkringliggende væv, og dermed giver licens disse celler til at metastasere til fjerntliggende væv [9, 12 ]. På molekylært niveau, E-cadherin er den bedst karakteriseret molekylær markør for EMT. Tab af E-cadherin ekspression er kendt som den mest fremherskende kendetegnende for EMT [13-15]. E-cadherin, kodet af CDH1 genet, som er placeret på kromosom 16q22 [16], er et transmembrant glycoprotein begrænset til epitelceller og er primært ansvarlig for intercellulære compliance junctions [17]. Mange transkriptionsfaktorer, såsom Snail, ZEB1, ZEB2, FOXC2, Slug, og Twist har vist sig at direkte eller indirekte bevirke undertrykkelsen af ​​E-cadherin promotor-aktivitet [18-21]. Desuden blev tab eller reduktion af E-cadherin ekspression sig at tillade eller fremskynde invasion og metastase, og således foreslået som et potentielt prognostisk faktor i colorektal cancer [22-25].

cyclin B1, kortlagt til humant kromosom 5q12, er kendt som en mitotisk cyclin grund af dets centrale rolle i modulering G2 /M-fase progression af cellecyklus, og deltager i cellevækst, differentiering, apoptose, og metastase i forskellige cancertyper [26-29]. Hidtil har forøget ekspression af cyclin B1 blevet rapporteret i bryst-, prostata-, esophageal, lunge, colon og gastriske cancere [30-36]. I vores tidligere undersøgelse, vi fandt også overekspression af cyclin B1 fremmet celleproliferation og tumorvækst i human colorectal cancer [37]. Men manglen på prognostisk relevans eller gunstig prognose for cyclin B1 blev også observeret i kolorektal cancer, lymfom og pancreas Neuroendokrin tumor [35, 38, 39]. Disse uoverensstemmelser indikerer yderligere undersøgelse for at være nødvendig.

I denne undersøgelse at belyse, om og hvordan cyclin B1 er involveret i cellen invasion og metastase i kolorektal cancer, vi oprindeligt vurderet cyclin B1 udtryk i 150 par kolorektal cancer og matchede tilstødende ikke-tumor kolorektale væv, derefter analyseret dets overensstemmelse med klinisk-patologiske træk. Interessant fandt vi, at overekspression af cyclin B1 i colorektal cancer var negativt korreleret med lymfeknudemetastaser, fjernt metastase, TNM stadier, og ringe overlevelse. Vores undersøgelse viste også inhibering af cyclin B1 undertrykt ekspression af E-cadherin, og efterfølgende førte til induktionen af ​​migration og invasion af kolorektale cancerceller. Disse resultater ikke kun associeret cyclin B1 med metastaser i kolorektal cancer, men også giver en lovende mål til behandling af patienter sene stadie med colorectal cancer.

Materialer og Metoder

Patienter og prøver

tumorform og matchede tilstødende normale kolorektale væv blev opnået fra 150 patienter, som gennemgik kirurgi ved Sir køre køre Shaw Hospital, School of Medicine, Zhejiang University (Hangzhou, Kina), fra april 2005 og juni 2009. i særdeleshed, tilstødende normale væv blev taget 5 cm sideværts fra kanten af ​​kræft region. Ingen af ​​disse patienter havde fået kemoterapi eller strålebehandling før operationen. Den foreliggende undersøgelse blev godkendt af Sir køre køre Shaw Hospital Research Etisk Udvalg og alle prøverne blev opnået med skriftligt informeret samtykke (S1 Fig). Alle prøver blev omgående nedfrosset i flydende nitrogen efter kirurgisk resektion og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-ekstraktion.

Kliniske oplysninger af disse patienter, herunder alder, køn, differentiering status, tumorplacering, tumorstørrelse, lymfeknudemetastase , fjernt metastase, og TNM fase blev opsamlet og vist i S1 tabel. Patienterne blev fulgt op en gang hver 3. måned i mindst 5 år postoperativt. Alle patienter blev kontaktet via telefon eller spørgeskemaundersøgelser breve til at kontrollere på deres sundhedstilstand. Død af patienterne blev konstateret af rapporten fra deres familie.

RNA-ekstraktion og kvantitativ real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. cDNA blev syntetiseret fra 2 ug totalt RNA under anvendelse PrimeScript RT reagens Kit (Takara) og amplificeret med SYBR Premix Ex Taq (Takara) på ABI 7500HT systemet (ABI). Primeren af ​​cyclin B1 blev vist tidligere [37]. GAPDH blev anvendt som intern kontrol. Relativ kvantificering af mRNA-ekspression blev beregnet med 2

-ΔCT eller 2

-ΔΔCT metode.

Cell kultur og transfektion

Den menneskelige kolorektal cancer cellelinjer p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116 og SW480 blev opnået fra American Type Culture Collection. p53

+ /+ HCT116 og p53

– /- HCT116 celler blev dyrket i McCoys 5A komplet medium (Gibco). De SW480 celler blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS (Gibco). Alle tre cellelinjer blev dyrket i et befugtet kammer med 5% CO

2 ved 37 ° C.

siRNA mod cyclin B1 og siRNA negativ kontrol blev syntetiseret ved Bioneer. Celler blev transient transficeret med siRNA hjælp lipidbaserede transfektionsreagenser DharmaFECT1 (Dharmacon) ifølge fabrikantens protokol. Den transfektion effektivitet og transfektion niveau af cyclin B1 siRNA blev bestemt tidligere [37].

cellemigrationsassay

24 efter transfektion, 1 × 10

5 behandlede kræftceller i 200 pi serumfrit medium blev tilsat til den øvre del af Transwells (8 um porestørrelse, Costar). De nederste kamre blev fyldt med medium suppleret med 10% FBS og inkuberet ved 37 ° C /5% CO

2, indtil påvisning tid (24h for p53

+ /+ HCT116, 36h til p53

– /- HCT116 og 36h for SW480, henholdsvis). Celler på undersiden af ​​membranen blev fikseret, farvet med 0,1% krystalviolet og talt (fem uafhængige mikroskopiske felter ved en 20 ganges forstørrelse). Assays blev udført in duplo og gentaget tre uafhængige gange.

Cell invasion assay

En 24-brønds transwell plade (8-um porestørrelse overtrukket med matrigel (BD Biosciences) blev anvendt til måling celle invasion kapacitet. 24 timer efter transfektion, 1 x 10

5-celler blev resuspenderet i serum-frit medium og tilsat til det øvre kammer. The medium suppleret med 10% FBS blev anvendt som chemoattractant til det nedre kammer inden undersøgelsen. celler blev inkuberet ved 37 ° C i den angivne tid (30h for p53

+ /+ HCT116, 42h til p53

– /- HCT116 og 48h for SW480, henholdsvis). cellerne på den øvre overflade blev skrabet med vatpinde og skyllet væk, hvorimod de invaderede celler på den nedre overflade blev fikseret, farvet med 0,1% krystalviolet i 1 time, og kvantificeres ved bestemmelse af celleantallet i fem randmonly udvalgte synsfelter assays blev udført in duplo og gentaget tre uafhængige gange.

Western blot-analyse

Celler blev opsamlet og lyseret i RIPA-buffer indeholdende protease inhibitor (Pierce). Proteinkoncentrationen blev bestemt med BCA assay kit, og samme mængde protein blev elektroforesebehandlet på 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel og overført til polyvinylidendifluorid membrances (PVDF, Millipore). Efter blokering for ikke-specifik binding blev membranen inkuberet med specifikke primære antistoffer mod cyclin B1 (1: 2000; Epitomics), E-cadherin (1: 1000; Abcam), og GAPDH (1: 2.000; Santa Cruz) natten over ved 4 ° C og derefter vasket tre gange med Tris-bufret saltvand og Tween 20, efterfulgt inkuberet med de passende peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (HRP, Dawen Biotec) i 1 time ved stuetemperatur. Proteinet ekspression blev endelig visualiseret under anvendelse forøget kemiluminescens-detektion (ECL, Biological Industries). Intensiteterne af protein-ekspressionssignaler blev kvantificeret under anvendelse af densitometrisk analyse med Mængde One software (Bio-Rad), og de resulterende værdier af proteinet blev normaliseret til de tilsvarende loading kontroller.

Immunhistokemi

Anti -E-cadherin antistof (Epitomics) blev anvendt til IHC-farvning af xenotransplantattumorer. IHC blev udført som tidligere beskrevet [37].

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS standardversion 21.0 (SPSS Inc) og GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Forskel mellem grupper i væv prøver blev vurderet af parametrisk Mann-Whitney

U

test. Relativ kvantificering af cyclin B1 ekspression blev beregnet med 2

-ΔCT eller 2

-ΔΔCT metode (ACt = cyclin B1 (CT) -GAPDH (CT); ΔΔCT = ACt (tumor) – ACt (Normal)) og data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. Kaplan-Meier og log-rank tests blev anvendt til at evaluere patientens samlede overlevelse (OS) og skabe overlevelseskurver baseret på de høje og lave cyklin B1 niveauer (som defineret af ROC-kurven). Den univariate og multivariate overlevelsesanalyse blev udført med Cox regressionsmodellen. Alle in vitro eksperimenter blev udført in duplo og gentaget tre gange. Til in vitro og in vivo dyreforsøg, blev forskellen mellem to grupper evalueret under anvendelse af Students

t

-test, og data er præsenteret som gennemsnit ± SD. Værdi af

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

cyclin B1 overekspression er negativt korreleret med lymfeknude matastasis, fjernmetastaser og avancerede TNM stadie i humane kolorektale cancer væv

For at identificere potentielle rolle cyclin B1 i kolorektal cancer metastase, vi oprindeligt undersøgt ekspressionen af ​​cyclin B1 i 150 par af tyktarms- og endetarmskræft og matchede tilstødende ikke-tumor kolorektale væv ved hjælp af QRT-PCR. Cyclin B1 mRNA blev overudtrykt i 139/150 (92,7%) par, med en gennemsnitlig øget fold ændring på 5,30 i kræft væv. Vi fandt endvidere, at den relative gennemsnitlige ekspression af cyclin B1 var meget lavere hos patienter med lymfeknudemetastaser end hos patienter uden metastaser (

P

= 0,011) (Fig 1B). Hos patienter med fjernmetastaser, niveauet af cyclin B1 var også signifikant lavere end hos patienter uden fjernmetastaser (

P

= 0,021) (figur 1C). Som vist i tabel 1, sammenhængen mellem cyclin B1-niveau og klinisk-patologiske karakteristika viste ekspressionen af ​​cyclin B1 var negativt korreleret med lymfeknudemetastaser, fjernmetastaser, og avancerede TNM stadie (

P

= 0,007) (Fig 1D ) hos patienter med colorectal cancer. Der blev dog ikke signifikant sammenhæng fundet mellem cyclin B1 udtryk og andre klinisk-patologiske træk, såsom patientens alder, køn, tumor site, tumorstørrelse og differentiering (alle

P

0,05). Desuden har vi også bekræftet protein niveauet af cyclin B1 i 30 kliniske væv prøver, herunder 10 normale kolorektale væv, 10 kolorektal cancer væv uden metastaser, og 10 kræft væv med metastase ved western blot. Vi opnåede konsistent resultat med resultatet RNA-niveau. Cyclin B1 protein blev overudtrykt i kolorektal cancer væv uden metastaser, sammenligne til de normale kolorektale væv (

P

= 5.51 × 10

-5), mens cyclin B1 protein niveau faldt betydeligt i kolorektal cancer væv med metastase, når der sammenlignes med dem uden metastase (

P

= 0,012) (fig 1E). Disse data viser, at cyclin B1 udtryk omvendt var forbundet med kolorektal cancer metastaser.

(A) cyclin B1 mRNA-ekspression blev testet ved hjælp af QRT-PCR i 150 par humane tyk- og endetarmskræft væv og tilstødende ikke-tumor-væv. Ændringer i ekspression er vist som scatter diagrammer, idet y-aksen angiver Cyclin B1 ekspression. Dets ekspression blev normaliseret til det niveau af GAPDH-ekspression i hver prøve. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. ***

P

0,001. (B) QRT-PCR-analyse af cyclin B1 ekspression i patienter med tyktarmskræft med eller uden lymfeknudemetastaser. Dataene er repræsenteret som en 2

-ΔΔCT (tumor /normal). *

P

0,05. (C) Statistisk analyse af relativ cyclin B1 udtryk niveau i kolorektal cancer væv med eller uden fjernmetastaser. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. *

P

0,05. (D) Vurdering af relativ cyclin B1 udtryk niveau i kolorektal cancer væv af TNM fase I, II, III og IV. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. *

P

0,05; **

P

0,01; NS, ikke signifikant. (E) Western blot validering af cyclin B1 proteinniveau i normale kolorektale væv (N) og kolorektal cancer væv (CA) med metastaser (M +) og uden (M-). GAPDH blev anvendt til normalisering. Relative intensitet af cyclin B1 protein blev vist i de følgende søjlediagrammer. Data er præsenteret som middelværdi ± SD. ***

P

0,001. *

P

0.05.

cyclin B1 udtryk er negativt forbundet med nedsat overlevelse i kolorektal cancer

For at evaluere den prognostiske potentiale cyclin B1 i kolorektal cancer, vi analyserede sammenhængen mellem cyclin B1 udtryk og overlevelse varighed hjælp Kaplan-Meier analyse med log-rank test. Vi oprindeligt afbildet modtageren operating characteristic (ROC) kurve for cyclin B1 (Fig 2A). Ifølge den maksimale Youden indeks, den optimale afskæringsværdi for cyclin B1 ekspression var 3,33 gange i tumor /non-tumor. Så de 150 patienter med colorectal cancer blev inddelt i to grupper: høj cyclin B1 udtryk (n = 88), at cyclin B1 udtryk forholdet ≥ 3,33, og lav cyklin B1 udtryk (n = 62), at cyclin B1 udtryk forholdet 3,33, ifølge den afskårne niveau (Fig 2B). Kaplan-Meier estimering analyse viste en korrelation mellem cyclin B1 udtryk niveau og samlet overlevelse gange. Patienter med et lavt niveau af cyklin B1 havde en naturligvis lavere overlevelsesrate end dem med et højt niveau af cyclin B1 ekspression (

P

= 0,002) (fig 2C).

(A) optimal cut-off niveau af cyclin B1 relative ekspression blev bestemt på grundlag af den største af sensitivitet og specificitet af modtager opererer karakteristik (ROC) analyse for samlet overlevelse. Areal under kurven (AUC) af ROC var 0,90. (B) Ifølge den optimale afskæringsværdi (3,33 gange) blev 150 patienter med kolorektal cancer opdelt i to grupper: ≥ 3,33 blev betragtet som en forhøjet cyklin B1 ekspression gruppe (n = 88); 3,33 blev betragtet som en lav cyklin B1 ekspression gruppe (n = 62). (C) Kaplan-Meier overlevelsesanalyse ifølge cyclin B1 ekspression i patienter med kolorektal cancer (log-rank test). (D) Kumulative overordnede overlevelse kurver af patienter med høje eller lave Cyclin B1 ekspressionsniveauerne ved multivariat analyse.

For at afgøre, om cyclin B1 udtryk er en selvstændig indikator for den samlede survical for kolorektal kræftpatienter, vi først anvendes en univariate Cox proportional hazards regressionsmodel til at estimere den enkelte hazard ratio for alle de klinisk-patologiske karakteristika. Resultaterne viste, at den samlede overlevelse significally var relateret til cyklin B1 ekspressionsniveauet (RR = 2,062; 95% CI, 1,273-3,340; P = 0,003) og fire andre parametre (tumorstørrelse lymfeknudemetastase, fjernmetastaser, og TNM stage ; alle

P

0,05). Men i den multivariate analyse, Cox proportional hazards model herunder cyclin B1 ekspression, tumorstørrelse, lymfeknudemetastase, og fjern metastase, der er konstateret tumorstørrelse, lymfeknudemetastase og fjernmetastaser som de uafhængige prognostiske indikatorer for den samlede overlevelsesraten for patienter med colorektal cancer (HR: 0,564, P = 0,022; HR: 0,205, P = 2,0 × 10

-8; HR: 0,148, P = 1,0 x 10

-6 henholdsvis), men ikke cyclin B1 ekspression (p = 0,45) (fig 2D). De statistiske værdier af cyclin B1 udtryk og andre klinisk-patologiske egenskaber, der stammer fra Cox proportionel risiko regressions model er vist i tabel 2.

Undertrykkelse af cyclin B1 lettet vandrende evne i forskellige kolorektale cancerceller

ovenstående observationer fik os til at udforske det potentielle biologiske funktion af cyclin B1 deregulering på kolorektal cancer progression. Evnen hos en tumorcelle at undergå migration gjorde det muligt at ændre positionen inden vævene, og denne proces tillader tumorceller at forlade fra deres primære tumor [40]. Således vurderede vi virkningen af ​​cyclin B1 om migration i kolorektal cancer celler ved hjælp Transwell assay. Tre kolorektale cancercellelinjer, p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116 og SW480 blev transficeret med specifikke cyklin B1 siRNA eller siRNA negativ kontrol, henholdsvis som tidligere rapporteret. Resultaterne viste, at inhibering af cyclin B1 tydeligt forbedret vandrende evne af p53

+ /+ HCT116-celler med 127% (p = 1,45 × 10

-5) (Fig 3A). Tilsvarende migrationen kapacitet af p53

– /- HCT116 blev også bemærkelsesværdigt forøget med 193% (p = 3,30 × 10

-8) (fig 3B) efter undertrykkelsen af ​​cyclin B1 ekspression. Desuden migration aktivitet i cyclin B1 siRNA-transficerede SW480-celler steg betydeligt med 155% (p = 2,85 × 10

-6) (fig 3C), sammenlignet med kontrolceller. Disse data indikerer Cyclin B1 udøver en migrering-undertrykkende funktion i humane colorektale cancerceller, og denne virkning er uafhængig af celletype.

(A, B, C) Transwell migration assays af p53

+ /+ HCT116 , p53

– /- blev HCT116, og SW480 celler udføres efter transfektion med cyclin B1 siRNA eller negativ kontrol hhv. Repræsentative billeder af migration assay blev vist. I alle paneler, at resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. NC, siRNA negativ kontrol. Data viser gennemsnittet af tre uafhængige forsøg ± SD. ***

P

0.001

Knockdown af cyclin B1 fremmer kolorektal cancer celle invasion

Cell invasion er en iboende cellulær proces, hvorved celler reagerer på ekstracellulær. stimuli til at bevæge sig igennem og nedbryde den ekstracellulære matrix (ECM). I kræft, celle invasion tillader kræftceller til at erhverve evnen til at indtaste lymfe og /eller blodkar til udbredelse i kredsløbet, efterfulgt af invasion til fjerne organer til metastatisk vækst [8, 40]. For at undersøge den mulige effekt af cyclin B1 på celle invasion i kolorektal cancer celler, brugte vi den Matrigel Invasion analysen til detektion. Vi fandt, at udtømning af cyclin B1 resulterede i en 1,82 gange og 1,72 gange forøgelse i antallet af indtrængende celler i både p53

+ /+ HCT116 og p53

– /- HCT116 celler (p = 6,88 × 10

-6; p = 6,70 × 10

-6 henholdsvis) (fig 4A og 4B). Ligeledes inhibering af cyclin B1 også øget invasion aktivitet af SW480-celler ved 4,47 gange (p = 2,07 × 10

-7) (Fig 4C). Kollektivt, disse resultater tyder cyclin B1 hæmmer invasion af kolorektal cancer celler.

(A, B, C) blev Effekten af ​​cyclin B1 på celle invasion påvist i tre kolorektale cancer cellelinjer, p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116 og SW480 celler under anvendelse Transwell kammer assays. Kamrene blev overtrukket med matrigel, som fungerer som ekstracellulære cellematrix. Repræsentative billeder af invaderede celler er vist. Dataene er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Fejl- søjler repræsenterer SD. ***

P.

0.001

Hæmning af cyclin B1 falder E-Cadherin niveau i kolorektale cancer cellelinjer

I betragtning af at cyclin B1 negativt korreleret med forbedret kolorektal cancer celle migration og invasion, vi undersøgt, om EMT er en underliggende mekanisme. Dysregulering af E-cadherin er blevet anset for at være den større kritiske molekyle i EMT-medieret cancercelle metastase. Her udforskede vi rolle cyclin B1 i reguleringen af ​​E-cadherin udtryk i de tre ovennævnte kolorektale cancer cellelinjer. Fig 5A og 5B viste begge, at cyclin B1 siRNA transfektion i p53

+ /+ HCT116 og p53

– /- HCT116 stærkt formindsket E-cadherin-protein ekspressionsniveau (p = 0,038; p = 0,011, henholdsvis) . Også i cyklin B1 siRNA-behandlede SW480-celler, blev E-cadherin-protein ekspression naturligvis reduceret sammenlignet med ekspressionen i negativ kontrol-transficerede celler (p = 0,0006) (fig 5C). Vores data indikerer, at cyclin B1-medieret inhibering af celleinvasion kan forekomme via regulering E-cadherin ekspression.

(A, B, C) 72h efter transfektion med 50 nM cyclin B1 siRNA eller siRNA negativ kontrol, den endogent protein niveauer af E-cadherin og cyclin B1 i p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116 og SW480-celler blev analyseret ved western blotting og kvantificeret. Barer viser de relative protein niveauer, der er normaliseret til GAPDH. Data viser gennemsnittet af tre uafhængige forsøg ± SD. *

P

0,05; ***

P.

0.001

Hæmning af cyclin B1 nedregulerer E-cadherinekspression in vivo

For at bestemme om cyclin B1 ændrer E-cadherinekspression in vivo, afprøvede vi E-cadherin-ekspression i vores tidligere tumor xenograftmodeller [37] ved immunohistokemisk farvning. Som vist i figur 6A, blev E-cadherin niveau faldt betydeligt i cyclin B1-undertrykke p53

+ /+ HCT116 tumorer, sammenlignet med cyclin B1 ikke-undertrykkende kontrol tumorer. Tilsvarende blev E-cadherin-protein også tydeligvis nedreguleret i cyclin B1-undertrykkende SW480 tumorer, sammenlignet med kontrol tumorer (Fig 6B). Disse data tyder endvidere effekten af ​​cyclin B1 på E-cadherinekspression

(A) Billeder (x200; X400). Repræsenterer immunhistokemisk farvning af E-cadherin i p53

+ /+ HCT116 tumorer, der udtrykker cyclin B1 shRNA eller vektor kontrol. (B) Repræsenterer billeder (x200; X400). Af E-cadherin i SW480 tumorer, der udtrykker cyclin B1 shRNA eller vektor kontrol

Diskussion

De vigtigste årsager til kolorektal cancer dødelighed skyldes de komplikationer som følge af metastase. Ifølge statistikkerne kræft, er ca. 60% af patienter med tyktarmskræft forventes at udvikle metastaser. Selv om flere approachs til behandling er blevet udviklet for nylig for tarmkræft, patienter med fremskreden eller metastatisk kolorektal cancer har stadig dårlig prognose. I denne undersøgelse viste vi, at cyclin B1 undertrykte kolorektal cancer invasion og metastase gennem regulering af E-cadherin udtryk.

Reguleringen af ​​ordnet cellecyklusprogression er afgørende for celler til at opretholde genomisk integritet som er afgørende for celleoverlevelse og kontrolleret spredning. Cycliner er en familie af proteiner, som varierer i deres ekspressionsniveauer under cellecyklussen at aktivere deres specifikke cyclinafhængige kinaser kræves for progression gennem cellecyklussen. Blandt dem, cyklin B1 er af største interesse, fordi det oprindeligt blev antaget, at cyclin B1 kontrolleret G2-M-fasen checkpoint og reguleret korrekt indtræden af ​​mitose, som begge er væsentlige for DNA-syntese og celleproliferation. Akkumulerede beviser har vist, at cyclin B1 blev overudtrykt i brystkræft, esophageal pladecellecarcinom, lungecancer, mavecancer, hepatocellulær cancer og andre cancerceller [31, 32, 41-43]. Statistisk beviser foreslog, at cyclin B1 var relateret til tumor malignance. Derudover har overekspression af cyclin B1 blevet identificeret som en lovende dårlig prognostisk markør hos patienter med hepatocellulær cancer, ikke-småcellet lungecancer og hoved-hals pladecellekarcinom [32, 34, 43]. Imidlertid Chae et al. [44] rapporterede, at cyclin B1 udtryk havde ingen indflydelse på overlevelsen af ​​patienter med brystkræft. Björck et al. [38] rapporterede, at patienter med follikulært lymfom udtrykker højere niveau af cyklin B1 viste bedre resultat efter kemoterapi, sammenlignet med patienter, der udtrykker lavere cyclin B1. Disse diskordante resultater kan forklares ved forskellig ekspressionsmønster af cyclin B1 i forskellige tumortyper. Vi har tidligere fundet, at cyclin B1 blev overudtrykt og vigtige for celledeling og tumorvækst via fremme cellecyklusprogression og /eller reduktion af apoptose i kolorektal cancer celler [37]. Men den rolle og mekanismen for cyclin B1 i kolorektal cancer metastaser er ikke blevet godt undersøgt.

I denne undersøgelse fandt vi Cyclin B1 udtryk niveau i kolorektal cancer væv var også højere end i nomal væv i et stort panel af 150 patienter, i overensstemmelse med vores tidligere data. Imidlertid blev Cyclin B1 overekspression negativt korreleret med aggressive klinisk-patologiske træk, såsom lymfeknudemetastaser, fjernmetastaser, og TNM fase. Patienter, som havde lav udtryk for cyclin B1 var bemærkelsesværdigt ringe samlet overlevelse sammenlignet med patienter, der havde høj ekspression af cyclin B1. Univariate analyse viste, at cyclin B1 var en prognostisk indikator for samlet overlevelse hos patienter med kolorektal cancer, selv om multivariat analyse viste Cylcin B1 ikke var en uafhængig prognostisk faktor. Tilsammen disse resultater viste klart, at lave cyclin B1-niveau er forbundet med dårlig prognose og ugunstige kliniske resultat af kolorektal cancer. Men vores resultater ikke er i overensstemmelse med to andre undersøgelser [35, 45]. Heike et al. viste cyclin B1 overekspression hverken var forbundet med histopatologiske tumor funktioner eller dårlig prognose i kolorektal cancer, mens Jia-Qing et al. afsløret Cyclin B1 overekspression intensiveret i løbet carcinogenese, men aftaget i løbet af invasion, og derefter steg igen i metastaser i kolorektal cancer.

For yderligere at understøtte vores opfattelse, rolle og mekanismen for cyclin B1 i metastaser blev fundet i forskellige kolorektal cancer cellemodeller, p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116 og SW480. Vi fremlagde beviser, at Knockdown af cyclin B1 udtryk inducerede flere celler at infiltrere gennem matrigel og transwell membrance i alle tre kræftceller, viser, at cyclin B1 undertrykker kolorektal cancer metastaser ved negativt at regulere celle migration og invasion. EMT var blevet impliceret som vigtigt skridt i udviklingen af ​​tumorer mod invasion og metastase [9]. E-cadherin var en velkendt celle-celleadhæsionsmolekyle, der dannede epitel adhærente kryds og beslaglagt CTNNB1. I EMT ændringer, undertrykkelse af E-cadherin er et afgørende skridt i udviklingen af ​​mange kræftformer, herunder kolorektal cancer [15, 46]. Det vil være af særlig betydning at udforske den underliggende mekanisme, der resulterer i E-cadherin suppression. Trods mange molekyler er blevet identificeret til at modulere E-cadherin udtryk [17, 47, 48], er flere undersøgelser stadig behov for at belyse de vigtige signalmolekyler til regulering af E-cadherin. Her viste vi, at cyclin B1 deltog i reguleringen af ​​E-cadherin udtryk. Inhibering af cyclin B1 nedregulerede E-cadherin-protein i p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116 og SW480 celler.