PLoS ONE: XB130, en New Adaptor Protein, Regulerer Angivelse af Tumor Smittespredningshæmmende MikroRNA’er i Cancer Cells

Abstrakt

XB130, en roman adapter protein, fremmer cellevækst ved at kontrollere ekspressionen af ​​mange beslægtede gener. MikroRNA’er (miRNA), der ofte mis-udtrykt i cancerceller, regulere ekspression af målrettede gener. I nærværende undersøgelse, vi havde til formål at udforske den onkogene mekanisme XB130 gennem miRNA regulering. Vi analyserede miRNA ekspression i XB130 kort hårnål RNA (shRNA) stabilt transficerede WRO skjoldbruskkirtlen cancerceller af en miRNA-array-assay, og 16 miRNA opreguleret og 22 miRNA blev nedreguleret betydeligt i disse celler, i sammenligning med ikke-transficerede eller negativ kontrol shRNA transficerede celler. Vi valgte tre af de up-regulerede miRNA (miR-33a, miR-149 og miR-193a-3p) og valideret dem ved real-time QRT-PCR. Ektopisk overekspression af XB130 undertrykt disse 3 miRNA i MRO celler, en cellelinie med meget lav udtryk XB130. Desuden vi transficeret MIR efterligninger af disse 3 miRNA i WRO celler. De reguleres negativt ekspression af onkogener (MIR-33a: myc MIR-149: FOSL1, MIR-193a-3p: SLC7A5), ved at målrette deres 3′-utranslaterede region, og reduceret cellevækst. Vores resultater tyder på, at XB130 kunne fremme væksten af ​​kræftceller ved at regulere ekspressionen af ​​tumor undertrykkende miRNA og deres målrettede gener

Henvisning:. Takeshita H, Shiozaki A, Bai XH, Iitaka D, Kim H, Yang BB, et al. (2013) XB130, en New Adaptor Protein, Regulerer Angivelse af Tumor Smittespredningshæmmende MikroRNA’er i kræftceller. PLoS ONE 8 (3): e59057. doi: 10,1371 /journal.pone.0059057

Redaktør: Laszlo Buday, Ungarsk videnskabsakademi, Ungarn

Modtaget: Oktober 6, 2012; Accepteret: 11 Feb 2013; Udgivet: 19 Mar 2013

Copyright: © 2013 Takeshita et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den canadiske Institutes of Health Research (CIHR) driftstilskud MOP-13270, MOP-42.546 og MOP-119.514. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

glødetråd Actin associeret protein (AFAP) er en lille familie af adapter proteiner involveret i intracellulær signaltransduktion, cytoskeletorganisation, celle motilitet og andre cellulære funktioner. Det omfatter AFAP [1], AFAP1L1 (filament actin associeret protein 1 som 1) [2], XB130 (også kendt som filament actin associeret protein 1-lignende 2, AFAP1L2) [3]. De har vist sig at deltage i reguleringen af ​​forskellige signalveje ved at danne protein-protein og /eller protein-lipid-komplekser [1], [4], og under visse omstændigheder disse adapter proteiner kan være involveret i tumorigenese [5], [ ,,,0],. 6]

XB130 er en tyrosinkinase substrat, som kan være tyrosin phosphoryleres med Src og andre tyrosinkinaser [7] – [9], og interagere med Src gennem dets N-terminal SH2 og SH3 domæne bindende motiver og medierer Src relaterede transaktivering af SRE og AP-1 [7]. N-terminalen af ​​XB130 indeholder også en YXXM motiv, der kan binde til p85α underenheden af ​​phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) gennem sine SH2-domæner, og efterfølgende aktiverer Akt [2], [8]. XB130 medierer celleoverlevelse og proliferation gennem flere signaler nedstrøms fra Akt [9]. XB130 i humane skjoldbruskkirtel cancerceller regulerer tumorvækst som vist i en dyremodel med nøgne mus, ved fremme af celleproliferation og inhibering af apoptose. Endvidere knockdown af XB130 reducerer ekspression af mange gener relateret til celleproliferation og /eller overlevelse [10]. XB130 er også involveret i reguleringen af ​​celle migration [11]. Ændring af XB130 ekspression er blevet bemærket i human thyreoideacancer [10], esophageal cancer [12], og gastrisk cancer [13]. Derfor kalder disse undersøgelser til nærmere undersøgelse på funktionen af ​​XB130 i tumorigenese.

MikroRNA’er (miRNA) er små ikke-kodende RNA (ca. 22 nukleotid længder), som specifikt kan interagere med 3′-uoversatte region (3’UTR) målrettede mRNA, hæmme mRNA translation, eller føre til mRNA spaltning og nedbrydning [14]. Antallet af indberettede menneskelige miRNA overstiger 2.000 (miRBase, version 18 på Sanger Institute), og miRNA spiller en vigtig rolle i at kontrollere biologiske processer, herunder udvikling, differentiering, metabolisme og spredning [15] – [18]. Nogle miRNA ofte mis-udtrykt i kræftceller, og er for nylig blevet identificeret som nye faktorer relateret til onkogenese og tumorprogression [19] – [22]. Adskillige nyere undersøgelser fokuserer på reguleringen af ​​miRNA-ekspression og funktion i kræft [23] – [26], herunder kræft i skjoldbruskkirtlen [27] – [29].

Selvom XB130 kan regulere ekspressionen af ​​mange gener relateret til celle spredning [10], og fremmer celledeling og overlevelse via PI3K /Akt vej [9], lidt om mekanismerne bag sin regulering af genekspression. I den foreliggende undersøgelse, søgte vi at bestemme, om XB130 kan regulere ekspression af nogle af disse gener via nedregulering af tumor suppressive miRNA. Vi undersøgte miRNA ekspressionsniveau hjælp XB130 korte hårnål RNA (shRNA) stabilt transficerede WRO skjoldbruskkirtlen cancerceller, i sammenligning med ikke-transficerede celler eller celler stabilt transficeret med negativ kontrol shRNA. På den anden side, vi transficerede MRO cancerceller, der har meget lav udtryk for XB130 med XB130 plasmid for at forbedre sit udtryk. Tre tumor undertrykkende miRNA blev identificeret og undersøges yderligere, hvad angår udtryk for deres målrettede gener, celledeling, og apoptose.

Materialer og metoder

Cell Culture

Menneskelig skjoldbruskkirtlen carcinom WRO celler og MRO celler fra Dr. S. Asa (University of Toronto, Toronto, Canada) [30], som har opnået disse celler fra Dr. J. Fagin (Memorial Sloan-Kettering Cancer center, New York, NY, USA ). Celler blev holdt i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS, 1 mmol /L pyruvat og ikke-essentielle aminosyrer (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, USA) og 1% penicillin-streptomycin. Vi har tidligere etableret WRO celler, der stabilt transficeret med shRNA plasmider til XB130. (C3-1 og C3-4 blev etableret fra vektor C3, C4-3 og C4-11 blev etableret fra vektor C4) og negativ kontrol shRNA plasmid (NC1, NC9 og NC12) blev etableret tidligere [10]. G418 (0,25 mg /ml) blev tilsat til dyrkningsmedium af transficerede celler for at opretholde selektion. Cellerne blev dyrket i et standard befugtet inkubator ved 37 ° C med 5% CO

2.

Protein Undersøgelser og Western Blotting

Western blot blev udført ifølge fremgangsmåderne som beskrevet tidligere [ ,,,0],31], [32]. Kort fortalt blev celler lyseret med modificeret radioimmunaktivitet nedbør assaypuffer (50 mmol /L Tris-HCI, pH 7,5; 150 mmol /L NaCl; 2 mmol /L EGTA, 2 mmol /l EDTA og 1% Triton X-100) indeholdende 10 ug /ml hver af aprotinin, leupeptin, pepstatin, 1 mmol /l phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mmol /l Na

3VO

4 og 10 mmol /l NaF. Proteinkoncentrationer blev målt ved Pierce® BCA Protein Assay Kit (Thermo, Rockford, IL, USA).

Cellelysater indeholdende ens mængder af totale proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og derefter overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev derefter probet med de angivne antistoffer. Proteiner blev afsløret ved SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo). Intensiteterne af proteinbånd blev kvantificeret under anvendelse ImageJ software (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

Monoklonalt XB130 antistof blev frembragt som tidligere beskrevet [7]. Antistoffer til β-actin, MYC, CEBPG, FOSL1, SCL7A5, DECR1, SETD8 blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Anti-PCNA antistof kom fra Abcam (Toronto, ON, Canada). Anti-Ki-67 (klon Ki-S5) kom fra Cedarlane (Burlington, ON, Canada).

Mikroskopi og Immunofluorescensanalyse

For immunfluorescensfarvning, celler blev dyrket på dækglas præ- behandlet med 50 ug /ml poly-L-lysin. Efter adhæsion blev celler hurtigt fastsat ved 4% paraformaldehyd i 20 minutter og vasket med PBS. Celler blev permeabiliseret med 0,1% Triton-X-100 i 10 minutter og blokeret med 1% BSA i 1 time. Dækglassene blev derpå inkuberet med primært antistof mod XB130 i 2 timer, efterfulgt af vask og inkubering med sekundært antistof konjugeret med Alexa Fluor 594 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i 1 time. Dækglassene blev også farvet for F-actin med Oregon Green 488 Phalloidin (Invitrogen) i 1 time og til kernen med Hoechst farvestof 33342 (Invitrogen) i 10 minutter. Dækglas blev vasket med PBS og monteret på objektglas under anvendelse af Dako Fluorescensmonteringsmedium (Dako, Mississauga, ON, Canada). Farvningen blev visualiseret ved hjælp af et Olympus IX81 mikroskop.

MicroRNA Array og dataanalyse

Fire XB130 shRNA stabilt transficerede kloner (C3-1, C3-4, C4-3 og C4-11) blev anvendt som XB130 knockdown celler. WRO celler og tre negative kontrol shRNA stabilt transfekterede kloner (NC1, NC9 og NC12) blev anvendt til sammenligning. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA). RNA integritet nummer bestemmes af Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) blev anvendt som et mål for kvaliteten af ​​RNA’et. MiRNA udtryk profilering blev udført ved hjælp af menneskelige Agilents miRNA Microarray-system (Agilent Technologies) med en SurePrint G3 8 × 60 K V16 platform for 1.205 humane miRNA (miRBase frigive 16,0). Kort fortalt blev 100 ng af total RNA mærket med Cyanin 3-PCP og hybridiseret på arrayene ved 55 ° C i 20 timer. Slides blev scannet med en Agilent Technologies Scanner G2505C, og de scannede billeder blev analyseret ved hjælp af Agilent Feature Extraction-version 10.7.3. Differentiel udtryk analyse og hierarkisk klyngeanalyse blev udført ved hjælp GeneSpring GX 11.5 (Agilent Technologies).

Target Forudsigelse af miRNA

Targetscan 6.0 (https://www.targetscan.org/), microRNA .org (https://www.microrna.org/), PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/), og DIANA-MICROT v4 /TarBase 5.0 (http: //diana.cslab.ece. ntua.gr/DianaTools/) blev anvendt til at søge efter forventede mål for miRNA.

Real-Time kvantitativ RT-PCR for XB130

Samlet RNA blev ekstraheret ved hjælp af RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), og cDNA blev syntetiseret ud fra det totale RNA under anvendelse af høj kapacitet cDNA RT kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kvantitativ RT-PCR for XB130 blev udført under anvendelse SYBR Green I Master PCR kit på LightCycler480 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA) ifølge producentens protokol. SDHA blev anvendt som en intern reference gen til analyser. PCR-primerne for XB130 og SDHA er: XB130_forward 5′-AGCACAGCACTGGTGAAGAA-3 ‘, 5′-XB130_reverse GTTGCTTGTTGATGGTCACT-3′, 5’-SDHA_forward CGGCATTCCCACCAACTAC-3 ‘og SDHA_reverse 5′-GGCCGGGCACAATCTG-3’. Ekspression af XB130 blev normaliseret ved hjælp af 2-ΔΔCT metode i forhold til SDHA. Den ACt blev beregnet ved at subtrahere Ct-værdier på SDHA fra Ct-værdier i XB130. Gange ændring i genet blev beregnet ved ligningen 2-ACt [33]. Alle assays blev udført tre gange. Gennemsnittet af ekspressionen af ​​XB130 /SDHA forholdet i WRO celler blev sat til 1, og resultaterne blev udtrykt som middelværdi og standardafvigelse af fold af XB130 ændringer.

Real-Time kvantitativ RT-PCR for pri-miRNA og Ældre miRNA

for at kvantificere ekspression af det pri-miRNA og modne miRNA, total RNA blev ekstraheret ved hjælp af Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion). Som for kvantificering af den pri-miRNA, blev cDNA syntetiseret ved hjælp High Capacity cDNA RT kit (Applied Biosystems). Real-time PCR reaktioner blev udført under anvendelse af en TaqMan® Universal Master Mix II og TaqMan® pri-miRNA assays specifikke for har-mir-33a, har-mir-149 og har-mir-193a-3p på en 7900 realtid PCR-system (Applied Biosystems).

Som for kvantificering af de modne miRNA, en TaqMan® MicroRNA RT Kit og TaqMan® miRNA tests specifikke for HSA-miR-33a, har-miR-149 og har-miR- 193a-3p (Applied Biosystems) blev anvendt til RT-reaktioner. Real-time PCR reaktioner blev udført under anvendelse af en TaqMan® Universal Master Mix II og TaqMan® miRNA tests på en 7900 real-time PCR-system (Applied Biosystems). I begge kvantificeringer blev RUN6B (U6) vurderet som endogen kontrol, og resultaterne blev normaliseret ved hjælp af 2-ΔΔCT metoden samme som real-time QRT-PCR for XB130.

Cell transfektion

generering af plasmid af GFP-alone blev GFP-mærkede XB130 (GFP-XB130) og dets N-terminal deletionsmutant (GFP-XB130ΔN) beskrevet tidligere [11]. MRO-celler blev transient transficeret under anvendelse af 60 pi lipofectamin 2000 (Invitrogen) på en 100 mm skål som beskrevet i producentens instruktioner. Mediet indeholdende plasmid blev erstattet med frisk medium 24 timer efter transfektion, og GFP-positive celler blev isoleret ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA) 48 timer efter transfektionen. GFP-positive celler blev derefter anvendt til western blotting og celleproliferationsassays.

Mirvana ™ miRNA Mimic af miR-33a, miR-149 og miR-193a og Mirvana ™ miRNA Mimic Negativ kontrol # 1 blev opnået kommercielt (Ambion ). WRO celler blev transficeret med 50 pmol miR efterligner anvendelse af 5 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen) på en 6-brønds plade ifølge producentens protokol. Mediet indeholdende plasmid blev erstattet med frisk medium 24 timer efter transfektion og total RNA og protein blev ekstraheret 48 timer efter transfektion.

Luciferase Reporter Assay

Seed sekvenser af MIR-33a, miR -149 og miR-193a-3P og parring 3’UTR sekvenser af MYC, FOSL1 og SLC7A5 blev forudsagt af Targetscan. 3’UTR sekvenser blev klonet nedstrøms for ildflueluciferase af pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target ekspressionsvektor og verificeret ved sekventering (Promega, Madison, WI, USA). Den pmirGLO konstruere og miR efterligner eller kontrol miR mimic blev cotransficeret ind WRO celler dyrket i plader med 96 brønde under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge fabrikantens protokol. Otteogfyrre timer efter transfektion, ildflue og Renilla luciferase-aktiviteter blev målt under anvendelse af en Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega). Ildflueluciferase blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. Gennemsnittet af luciferaseaktiviteten af ​​Firefly /Renilla forholdet i WRO celler cotransficeret med hver af de pmirGLO konstruere og styre miR efterligne var sat til 1. Data blev udtrykt som middelværdi og standardafvigelse af fem uafhængige forsøg.

celleproliferation og apoptoseassays

WRO celler blev udpladet i femdobbelt brønde af 96-brønds mikrotiterplader (100 pl /brønd) i celleproliferationsassay, i 12-brønds mikrotiterplader (1 ml /brønd) i celletal assay, og i 6-brønds mikrotiterplader (2 ml /brønd) i apoptose-assay, ved 5 × 10

4 celler /ml og dyrket i 24 timer. Cellerne blev derefter transficeret med miRNA mimic som beskrevet ovenfor.

Celleproliferation blev vurderet ved anvendelse CellTiter 96® Aqueous One Solution celleproliferationsassay (Promega) ved hvert tidspunkt (0, 24, 48, og 72 h) efter transfektion. Efter erstattet med frisk medium, blev 20 pi af CellTiter 96® Aqueous One Solution Reagent tilsat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 2 timer i en fugtig, 5% CO

2 atmosfære. Absorbansen af ​​prøverne blev læst ved 490 nm med en automatisk pladelæser (Thermo). Baggrunden absorbans medium-alene blev subtraheret. Proliferationsindekset blev beregnet som den gennemsnitlige absorbans af celler på det angivne tidspunkt divideret med den gennemsnitlige absorbans af celler ved 0 timer efter transfektion og udtrykt som gennemsnit og standardafvigelse. I celletal assay blev cellerne løsrevet fra kolberne med trypsin-EDTA-opløsning og talt med et hæmocytometer ved hvert tidspunkt. Celleantallet blev udtrykt som middelværdi og standardafvigelse

apoptose assay de transficerede celler blev høstet 72 timer efter transfektion og farvet med fluoresceinisothiocyanat-konjugeret annexin V og phosphatidylinositol (PI), under anvendelse ANNEXIN V. – FITC Kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) i overensstemmelse med producentens protokoller og analyseret af BD AccuriTM C6 flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA).

Resultater

Karakterisering af XB130 shRNA stabilt transficerede WRO celler

at studere roller XB130 i regulering WRO celle aktiviteter, vi transficeres stabilt cellerne med shRNA målrettet XB130. Ekspression af XB130 var signifikant lavere i disse kloner (C3-1, C3-4, C4-3 og C4-11) end i ikke-transficerede WRO celler og andre tre kloner stabilt transficerede med en negativ kontrol shRNA (NC1, NC9, NC12), som bestemt ved Western blot (fig. 1A) og ved kvantitativ reel-tid RT-PCR (fig. 1B). Ekspressionen af ​​SDHA mRNA blev anvendt som en husholdning gen for QRT-PCR (fig. 1B), fordi dets ekspression ikke ændres under forskellige eksperimentelle betingelser [10], [34], [35]. Interessant, viste XB130 knockdown celler langstrakt morfologi når undersøgt med fase-kontrast mikroskopi. Desuden immunofluorecence farvning afslørede, at ekspressionen af ​​XB130 i C3-1, C3-4, C4-3 og C4-11-celler var knap detekterbar, og F-actin-farvning viste også langstrakt morfologi på enkeltcelle-niveauer (fig. 1C, . fig S1)

følgende celler blev undersøgt:. WRO celler (WRO), negativ kontrol shRNA transficerede WRO celler (NC1, NC9 og NC12) og XB130 shRNA transficerede WRO celler (C3-1, C3-4 , C4-3 og C4-11). (A) XB130 shRNA reduceres effektivt XB130 protein niveauer. (B) Real-time kvantitativ RT-PCR viste, at ekspressionen af ​​XB130 mRNA i XB130 shRNA transficerede WRO-celler var signifikant lavere end WRO celler (* P 0,05). (C) WRO, NC9 og C3-1 var immun-farvet med et XB130 antistof og kontrastfarvet for F-actin og kerner med Oregon Green 488 Phalloidin og Hoechst 33342. Udtrykket af XB130 protein i cytoplasma forsvandt i XB130 shRNA transfekterede celler.

MicroRNA Expression profil i XB130 shRNA transfekterede celler

For at identificere miRNA reguleret af XB130, vi udførte miRNA udtryk profil assay, ved at sammenligne XB130 shRNA stabilt transfekterede WRO celler (C3-1, C3-4, C4-3 og C4-11) med kontroller (WRO, NC1, NC9 og NC12) ved hjælp af en microRNA-array assay. GeneSpring GX analyse viste, at 38 miRNA blev ændret betydeligt ved den stabile knockdown af XB130 i WRO celler (p-værdi 0,05), hvoraf 16 var opreguleret (tabel 1) og 22 blev nedreguleret (tabel S1) i XB130 shRNA transficerede celler.

for at bestemme de mekanismer, som XB130 regulerer celleproliferation, vi fokuseret på miRNA undertrykt af XB130 og udvalgte miR-33a, miR-193a-3p og miR-149 for yderligere analyse , som er blevet rapporteret at vise tumorundertrykkende funktioner i forskellige cancere [36] – [38]. For at verificere virkninger XB130 på miR-33a, miR-149 og miR-193a-3p, vi kvantificeret niveauer af disse 3 miRNA ved hjælp af real-time QRT-PCR. Både det modne miRNA (fig. 2A) og pri-miRNA (fig. 2B) niveauer af disse tre miRNA i XB130 shRNA stabilt transficerede WRO celler (C3-1, C3-4, C4-3 og C4-11) var signifikant højere end i de ikke-transficerede WRO celler eller celler stabilt transficeret med negativ kontrol shRNA (NC1, NC9 og NC12).

de modne former (A) og primære udskrifter (B) af miR-33a, miR- 149 og miR-193a-3p er væsentligt højere i XB130 shRNA transficerede WRO celler (C3-1, C3-4, C4-3 og C4-11) end i WRO (* P 0,05)

Ektopisk XB130 Expression Undertrykt Primære og Ældre former for miR-33a, miR-149 og miR-193a-3p

for yderligere at bekræfte de regulatoriske effekter af XB130 på ekspressionen af ​​miR-33a, mir-149, og mIR-193a-3p, udførte vi en “redning” undersøgelse af MRO-celler, som har meget lav XB130 ekspression som bestemt ved western blotting. Vi transficerede MRO-celler med plasmider, der udtrykker GFP-alone, GFP-XB130 eller dens N-terminal deletionsmutant, GFP-XB130ΔN. GFP-positive celler blev opsamlet ved FACS, og ekspressionen af ​​GFP-XB130 og GFP-XB130ΔN proteiner i transficerede MRO celler blev påvist ved Western blotting (fig. 3A). I modsætning til WRO celler, viste MRO celler signifikant højere ekspressionsniveauer af MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p, både de modne og ubearbejdet form. XB130-GFP overekspression resulterede i en signifikant nedregulering af både modne miRNA og pri-miRNA, mens overekspression af GFP-XB130ΔN ikke fremkalde sådanne virkninger (fig. 3B og C). Da N-terminalen af ​​XB130 indeholder funktionelle motiver, der kan interagere med Src [7] og p85α underenhed af PI3K [8], manglen på virkningerne af denne mutant tyder på, at de “redde” virkninger af GFP-XB130 kan være relateret til Src og /eller PI3K relaterede mekanismer. Det faktum, at både de modne og PRI-miRNA niveauer blev reguleret på samme måde af XB130 foreslået, at XB130 påvirket disse tre miRNA mindste delvist på det transskriptionelle niveau.

MRO celler blev transficeret med GFP-vektoren alene, eller GFP-XB130 , GFP-XB130ΔN (XB130 N-terminus deletionsmutant). GFP-positive celler blev opsamlet ved FACS. (A) Western blotting viste, at MRO celler udtrykker meget lav XB130. Transfektion af GFP-XB130 (MRO-XB130) eller GFP-XB130ΔN (MRO-XB130ΔN) viste XB130 udtryk i MRO celler. De modne former (B) og primære udskrifter (C) af miR-33a, miR-149 og miR-193a-3p blev undersøgt af real-time kvantitativ RT-PCR. Disse miRNA og pri-miRNA i MRO celler var signifikant højere end i WRO celler, og signifikant reduceret med overekspression af GFP-XB130, men ikke af GFP-XB130ΔN. * P. 0,05 sammenlignet med WRO celler

overekspression af miR-33a, miR-149 og miR-193a-3p Reduceret Down-stream Målrettet Proteiner Relateret til Cell Proliferation

Vi tidligere rapporteret, at i XB130 shRNA stabilt transficeret WRO celler blev 57 gener relateret til celleproliferation eller overlevelse væsentligt ændret, og de fleste af disse gener blev nedreguleret ved XB130 shRNA [10]. Vi spekulerede at blandt disse gener, nogle er mål for miR-33a, miR-149 og miR-193a-3p. Brug Targetscan 6.0, microRNA.org, PicTar, og DIANA-MICROT v4 /TarBase 5.0, identificerede vi MYC og CEBPG som kandidater af target gener for miR-33a, CEBPG og FOSL1 for miR-149, SLC7A5, DECR1 og SETD8 for miR- 193a-3p. For at vurdere, om disse miRNA faktisk regulerer ekspressionen af ​​kandidat mål, vi transficeret miR efterligner ind WRO celler. Transfektion af disse tre MIR efterligner markant øget niveauer af respektive miRNA (Fig. 4A), men påvirkede ikke XB130 protein niveauer (fig. 4B). I sammenligning med WRO celler, protein niveauer af MYC, FOSL1 og SLC7A5 var lavere i XB130 shRNA stabilt transficerede celler (C3-1 som et eksempel) (fig. 4C-E). Overekspression af MIR-33a resulterede i et fald myc protein niveauer (fig. 4C). Tilsvarende overekspression af MIR-149 nedreguleret FOSL1 proteinniveauer (fig. 4D), og overekspression af MIR-193-3p nedreguleret SCL7A5 proteinniveauer (fig. 4E). Den negative kontrol efterligner (Cont-m) påvirkede ikke disse tre proteiner (fig. 4C-E). Proteinniveauer af CEBPG, DECR1 og SETD8 blev ikke ændret ved overekspression af disse MIR efterligner (data ikke vist).

(A) Transfektion af MIR efterligner (33a-m, 149-m og 193a-m) signifikant øget respektive miRNA udtryk, mens kontrol miR mimic (fortsat-m) ikke havde en sådan virkning, som kvantificeret ved real-time kvantitativ RT-PCR. (B) Western blotting viser, at transfektion af miR mimic ikke ændrede XB130 proteinniveauer. (C-E) MYC, FOSL1 og SCL7A5 forudsiges mål for miR-33a, miR-149 og miR-193-3p hhv. Øvre panel viser eksempler, at ekspressionen af ​​den forudsagte målproteinet blev faldt med respektive miR efterligner transfektioner som bestemt ved Western blotting. Lavere panel viser kvantificering af ekspressionsniveauerne ved densitometri.

Siden overekspression af GFP-XB130 i MRO celler undertrykt udtryk for miR-33a, miR-149, og miR-193a-3p ( fig. 3A-3B), vi også testet, om det efterfølgende kan påvirke deres down-stream målrettede proteiner. Western blots viste, at sammenlignet med GFP-alone transficerede MRO celler, viste GFP-XB130 transficerede celler højere MYC, FOSL1 og SLC7A5. I sammenligning med GFP-XB130ΔN transficerede celler, de FOSL1 og SLC7A5 niveauer var også klart højere i GFP-XB130 transficerede celler (Fig. S2). Disse resultater støttede miRNA mimiske data i WRO celler.

MIR-33a, miR-149 og miR-193a-3p Direkte Målrettet Binding stedet på 3’UTR af MYC, FOSL1 og SLC7A5, Henholdsvis

Vi brugte derefter pmirGLO Dual-Luciferase reporter for at fastslå, om reduktionen i MYC, FOSL1 og SLC7A5 niveauer ved overekspression af miR-33a, miR-149 og miR-193a-3p miR mimic var gennem 3’UTR af deres målrettede mRNA’er. En betydelig komplementaritet blev identificeret under anvendelse af de algoritmer i Targetscan mellem sekvenser inden for frø regioner MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p og sekvenser i 3’UTR af MYC, FOSL1 og SLC7A5 henholdsvis (fig. 5A ). De pmirGLO konstruktioner, der indeholder et luciferase reporter og 3’UTR af hver af disse 3 gener blev genereret. WRO celler blev co-transficeret med pmirGLO konstruktioner og hver af MIR efterligner eller en negativ kontrol miR. Overekspression af MIR-33a signifikant reduceret luciferaseaktivitet af pmirGLO konstruktionen med klonede 3’UTR-sekvenser af MYC (fig. 5B). Tilsvarende overekspression af MIR-149 og MIR-193-3p signifikant reduceret luciferaseaktiviteter når cellerne blev transficeret med luciferase- konstruktion indeholdende 3’UTRs af FOSL1 og SCL7A5 (fig. 5C og D). Disse resultater viste, at disse 3 miRNA kan påvirke ekspressionen af ​​relaterede målgener ved binding til deres 3’UTRs.

(A) Seed sekvenser af miR-33a, miR-149 og miR-193a-3p og parring 3’UTRs sekvens af MYC, FOSL1 og SLC7A5 som forudsagt af Targetscan er vist. Den pmirGLO konstruere med de klonede 3’UTR sekvenser (luc-myc, luc-FOSL1 og luc-SLC7A5) og miR mimic (33a-m, 149-m og 193a-m) eller styre miR efterligne (fortsat-m) var cotransficeres ind i WRO celler. (B) Overekspression af MIR-33a signifikant reduceret luciferaseaktivitet af pmirGLO konstruktionen med klonede 3’UTR sekvenser af MYC (luc-MYC). Tilsvarende overekspression af MIR-149 og MIR-193-3p signifikant reduceret luciferaseaktivitet af luc-FOSL1 (C), og luc-SCL7A5 (D), henholdsvis.

Reduceret celleproliferation ved overekspression af miR-33a, miR-149 og miR-193a-3p

MYC, FOSL1 og SLC7A5 er kendt for at deltage i reguleringen af ​​celledeling. Eftersom transfektion af hver af disse MIR efterligner nedreguleret respektive målrettet protein, derefter undersøgt vi virkningerne af disse MIR efterligner på celleproliferation. Proliferation af WRO celler blev reduceret ved transfektionen af ​​miR efterligning af MIR-33a, MIR-149 eller MIR-193a-3p, som bestemt ved MTT-assayet (fig. 6A), eller ved celletælling (fig. 6B), i sammenligning med kontrol miR efterligner transficerede celler ved 72 timer efter cellepodning. Derudover er ekspressionen af ​​celleproliferationsmarkører, Ki-67 og PCNA, blev reduceret med hver af disse tre MIR efterligner i sammenligning med ikke-transficerede WRO celler eller celler transficeret med kontrol mimic (fig. 6C). På den anden side, overekspression af GFP-XB130, og at mindre omfang af GFP-XB130ΔN forøget Ki67-ekspression i MRO celler (Fig. S2).

Antallet af levedygtige celler blev bedømt ved MTS-assay (A) og celletælling (B) ved 24, 48 og 72 timer efter transfektion af kontrol mimic (fortsat-m) og specifik miR mimic (33a-m, 149-m og 193a-m). Overekspressionen af ​​MIR-33a, MIR-149 og MIR-193a-3p førte til reduktion i celleproliferation. (C) Cell proliferationsmarkører, Ki-67 og PCNA-niveauer, blev også reduceret i miR efterligne behandlede celler (33a-m, 149-m og 193a-3p). (D) Apoptose blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse PI /annexin V dobbelt farvning. Overekspression af MIR-193a-3a signifikant induceret både tidlig apoptose (annexin V positiv /PI negativ) og sen apoptose (annexin V /PI dobbelt positiv) i WRO celler. *: P 0,05

For at afgøre, om det reducerede celletallet skyldtes apoptose, vi udførte flowcytometri med PI /Annexin V dobbelt farvning.. Annexin V-positive celler repræsenterer tidligt apoptose, mens Annexin V og PI dobbelt positive celler repræsenterer sent apoptose [10]. Overekspression af miR-193a-3a (men ikke andre to miRNA) signifikant induceret både tidlige og sene apoptose i WRO celler (Fig. 6D). Disse resultater tyder på, at de reducerede celle numre i miR-33a og miR-149 efterligner er primært på grund af hæmning af celleproliferation, hvorimod miR-193a-3p kan reducere celledeling og inducere apoptose.

Diskussion

i vores tidligere undersøgelse, microarray analyse identificeret 246 gener væsentligt ændret ved stabilt banke ned af XB130 i WRO skjoldbruskkirtlen kræftceller. Især, 57 ud af de 246 gener er relateret til celle proliferation eller overlevelse, herunder mange transskription regulatorer [10]. Det er blevet anslået, at ca. 30% af alle humane gener kan reguleres af miRNA [39]. Ændringerne i miRNA behandling bidrager til tumorigenese [40]. Derfor vi hypotese, at XB130 kan regulere ekspressionen af ​​vækst-relaterede miRNA og efterfølgende kontrollere gener relateret til celledeling og overlevelse. For at evaluere denne hypotese, vi analyserede miRNA udtryk i XB130 knockdown WRO celler. MicroRNA array analyse viste, at 38 miRNA forskelligt blev udtrykt i XB130 knockdown celler. Blandt dem, vi fokuseret på miR-33a, miR-149 og miR-193a-3p, der er blevet rapporteret som tumor undertrykkende miRNA i forskellige kræftformer. MIR-33a decelererer celledeling virker gennem hæmning af proto-onkogen Pim-1 i lymfom og kolon kræftceller [36]. miR-149 udtryk har en direkte sammenhæng med KCNMA1 og LOX onkogener i klar celle renalcellecarcinom [37]. Tilsvarende MIR-193-3p målretter JNK1 og inhiberer cellecyklusfremadskriden og proliferation i brystcancer [38]. Vi valideret opregulering af miR-33a, miR-149 og miR-193a-3p i XB130 knockdown celler ved real-time QRT-PCR.

I microRNA udtryk processer, RNA-polymerase II producerer lange primære miRNA udskrifter kaldet PRI-miRNA, der er beskåret og spaltes af et multi-proteinkompleks herunder drosha og DICER1 at producere modne funktionelle miRNA [41]. Hvordan miRNA ekspression reguleres er stadig uklart, men forskellige mekanismer er blevet foreslået. Det er vist, at p53 var ansvarlig for post-transkriptionel modning af miR-16-1, miR-143 og miR-145, mens ekspressionen af ​​relaterede pri-miRNA ikke var påvirket af p53 [25].