PLoS ONE: Reverse Sammenhæng mellem MicroRNA-145 og FSCN1 påvirker Gastric Cancer Migration og Invasion

Abstrakt

MikroRNA’er (Mirs) spiller en vigtig rolle i at modulere genekspressionen i de processer af tumorigenese og tumor udvikling. Tidligere undersøgelser har vist, at MIR-145 nedreguleres i maven neoplasme og er relateret til tumor migration og invasion. Men både den molekylære mekanisme og funktion af MIR-145 i mavekræft er fortsat uklare. Den foreliggende undersøgelse er den første demonstration af den betydelige nedregulering af MIR-145-ekspression i infiltrativ gastrisk cancer sammenlignet med ekspanderende mavekræft. Derudover analyser korrelation afsløret stærke inverse korrelationer mellem miR-145 og FSCN1 ekspressionsniveauerne i infiltrativ gastrisk cancer. Desuden viste vi, at miR-145 direkte henvender FSCN1 og undertrykker celle migration og invasion i mavekræft. Knocking ned udtryk for FSCN1 førte til undertrykkelse af migration og invasion i gastriske kræftceller, og re-udtrykkende FSCN1 i miR-145-overekspression celler vendt deres migration og invasion defekter. Vi konkluderede derfor, at miR-145 regulerer celle migration og invasion i gastrisk cancer primært ved direkte rettet mod FSCN1

Henvisning:. Chen Jj, Cai Wy, Liu Xw, Luo Qc, Chen G, Huang Wf, et al . (2015) Reverse Sammenhæng mellem MicroRNA-145 og FSCN1 påvirker Gastric Cancer Migration og Invasion. PLoS ONE 10 (5): e0126890. doi: 10,1371 /journal.pone.0126890

Academic Redaktør: Chengfeng Yang, Michigan State University, USA

Modtaget: Januar 14, 2015; Accepteret: April 8, 2015; Udgivet: May 26, 2015

Copyright: © 2015 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. 1. National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81.172.283) JCC (https://www.nsfc.gov.cn/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. 2. Natural Science Foundation i Fujian-provinsen (Grant nr 2012D037) JCC (https://xmgl.fjkjt.gov.cn/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft har en af ​​de højeste dødelighed for maligne tumorer på verdensplan [1]. Forbedret medicinsk teknologi kan forbedre resultatet af gastrisk cancer. Imidlertid mavekræft stadig den næsthyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald [2], som er forårsaget af tumorinvasion og metastase. Sammen invasion og metastase danne en proces, hvor maligne tumorceller overføre fra en primærtumor til andre områder og derefter danne tumorer på et fjernt sted gennem det lymfatiske kanal, blodkar eller kropskavitet [3]. Derfor afklaring de molekylære mekanismer, der er involveret i udviklingen og invasiv af mavekræft er nødvendig.

I 1977 Ming klassificeret gastriske carcinomer i ekspanderende og infiltrative typer baseret på deres vækst og invasionsevne mønstre [4]. Disse typer er let genkendelige histologisk. Ekspanderende carcinomer vokser massevis og ved ekspansion resulterer i dannelsen af ​​diskrete tumornoduler, hvorimod infiltrative carcinomer har tumorceller, der invaderer individuelt [5]. Af de to typer af gastrisk kræft, infiltrativ mavekræft er mere invasiv end ekspanderende mavekræft. En sådan klassificering giver således en henvisning til at skelne mavekræft prøver klinisk og letter detaljerede undersøgelser vedrørende de molekylære mekanismer i mavekræft.

MikroRNA’er (Mirs) spiller kritiske roller i mange biologiske processer, herunder kræft processer, ved direkte at hæmme ekspressionen af ​​target mRNA’er gennem forskellige molekylære mekanismer [6, 7]. Derudover Mirs undergår aberrerende regulering under carcinogenese og kan fungere som enten onkogener eller tumorsuppressorer [7]. Nylige undersøgelser har vist, at mange Mirs påvirker proliferation og invasion i gastrisk cancer. MIR-21 er opreguleret i gastrisk cancer og fremmer tumor proliferation og invasion i gastrisk cancer ved at målrette PTEN [8]. I modsætning hertil er MIR-145 nedreguleret i human gastrisk cancer [9]. Desuden har forskning vist, at MIR-145 kan undertrykke cellemigration og invasion ved at hæmme N-cadherin proteintranslation i gastriske cancerceller [10]. Imidlertid Kamikihara et al [11] detekteret ekspressionsniveauerne af N-cadherin i 146 patienter med gastrisk cancer ved immunhistokemi, og resultaterne viste, at kun 31 patienter (21%) havde N-cadherin-positivt udtryk. Derfor kan nogle andre molekylære mekanismer i MIR-145 regulerer cellemigrering og invasion i gastrisk cancer.

FSCN1 er en 55-kDa actinbindende protein, der er associeret med filopodia og actin-baserede fremspring dannelse, og det fremmer cellemotilitet, migration og invasion [12, 13]. FSCN1 udtryk er fraværende eller lav i normal epitel, men FSCN1 er overudtrykt i mange carcinomer, herunder kolorektal adenomer, epitelial kræft i æggestokkene og esophageal pladecellekræft [14-16]. Desuden har en række undersøgelser vist, at tvungen FSCN1 udtryk øger spredning og invasion af æggestokkene og gastriske cancerceller [17, 18].

Nylige undersøgelser har fundet, at miR-145 fungerer som en tumor suppressor, og at miR-145 overekspression undertrykker migration og invasion i prostatakræft og blærekræft ved at målrette FSCN1 [19, 20]. Desuden MIR-145 undertrykker mavekræft cellemigration og invasion ved at målrette N-cadherin. Men den positive ekspression på N-cadherin i gastrisk cancer væv er kun 21% [10, 11]. Fastlæggelsen nøglen målgen af ​​MIR-145 i reguleringen gastrisk cancer invasion er nødvendig.

I den foreliggende undersøgelse, vi først fundet, at MIR-145-ekspression blev bemærkelsesværdigt nedreguleret i infiltrativ gastrisk cancer sammenlignet med i at udvide gastrisk cancer. Desuden har vi dokumenteret, at miR-145 undertrykt celle migration og invasion i gastrisk cancer primært ved direkte rettet mod FSCN1, som fremhævede betydningen af ​​miR-145 og FSCN1 i reguleringen af ​​gastrisk kræft maligne fænotyper.

Materialer og Metoder

kliniske prøver

Alle kliniske prøver blev indsamlet med informeret samtykke fra patienter, der gennemgik gastrektomi på Zhongshan Hospital i Xiamen University i Xiamen (Fujian-provinsen, Kina) fra juni 2012 til oktober 2013 . I alt 160 par af indsamlede kliniske prøver omfattede 80 uklassificerede mavekræft prøver, 40 infiltrative mavekræft prøver og 40 ekspanderende mavekræft prøver. Tumoren patologiske form blev bekræftet af patologi undersøgelse, og de matchede normale gastriske slimhinder blev indsamlet fra mere end 5 cm væk fra tumorer.

Etik erklæring

Studieprotokollerne var i overensstemmelse med etiske retningslinjer i Helsinki-deklarationen (1975) og blev godkendt af Medical Ethics Committee (nr 20.081.012) i Zhongshan Hospital Xiamen University i Xiamen (Fujian-provinsen, Kina). Vi opnåede skriftlig samtykke udsagn fra alle deltagere, der er involveret i denne undersøgelse.

Cellelinjer

MGC-803 og SGC-7901 humane gastrisk cancer cellelinjer blev købt fra Institut for Cellebiologi (Shanghai , Kina, https://www.cellbank.org.cn). The 293T human embryonisk nyrecellelinie blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, MD, USA). MGC-803 og SGC-7901-celler blev holdt i RPMI-1640-medium, mens 293T-celler blev holdt i DMEM. Alle medier indeholdt 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

Luciferase reporter assay

Celler blev transficeret med luciferase- reportergener, β-galactosidase (β-gal) og mIR-145 efterligner eller mIR-145 inhibitor (Guangzhou RiboBio) under anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen). Luciferaseaktivitet blev målt ved 48 timer efter transfektion og transfektionseffektivitet blev normaliseret til den interne β-gal-aktivitet.

RNA-ekstraktion og RT-qPCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen ) og revers-transkriberet med M-MuLV revers transkriptase (Qiagen) for at fremstille cDNA ifølge fabrikantens protokol. Real-time PCR blev udført under anvendelse af SYBR Green-baseret detektion i en Rotor-Gene 6000 instrument (Corbett Life Science) ifølge producentens instruktioner og anvendelse af primerparrene er anført i tabel 1. MIR-145 og U6 primere blev opnået fra Qiagen. GAPDH eller U6 endogene kontrol blev anvendt som en intern standard, og resultaterne blev beregnet ved hjælp af △△ CT (hvor CT er tærsklen cyklus) metode.

Plasmidkonstruktion

primere anvendt til konstruktionen af ​​luciferase reportere og plasmider er anført i tabel 1. det menneskelige FSCN1 3′-utranslaterede område (UTR) blev amplificeret fra MGC-803-cDNA ved PCR-amplifikation med LA Taq DNA Polymerase (Takara) og klonet nedstrøms for luciferase kodende sekvens i pMIR-RAPPORT (Ambion) vektor på Sad og Mlul restriktionssites (Promega) til at konstruere den menneskelige FSCN1-3’UTR-luciferase reporter. Mutationer blev indført i MIR-bindingssteder ved hjælp af en QuikChange Mutagenese Kit (transgen). For MIR-145 og FSCN1 ekspressionsplasmider blev sekvenser amplificeret ved PCR og klonet ind i SpeI /Nhel sites og Xbal /Ndel- steder, henholdsvis af PLV-cs.4.0-Basic Vector (Promega). For FSCN1 interferens plasmid blev to par af sekvenser annealet og subklonet ind PLKO.1 ifølge producentens protokol.

Lentiviral produktion og transfektion

HEK293T celler blev podet på en 6-brønds insert ved 24 timer før transfektion. MIR-145 ekspressionsplasmidet, FSCN1 shRNA plasmid eller FSCN1 ekspressionsplasmid blev derefter co-transficeret med emballering plasmider (pHR og pCMV-VSV-G) ved anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen). Virale supernatanter blev opsamlet ved 48 timer efter transfektion centrifugeret ved 3000 g i 15 minutter og filtreret gennem 0,45 um filtre (Millipore). Virustitere blev bestemt ved at transducere HeLa-celler ved seriefortyndinger og analysere GFP-ekspression ved hjælp af flowcytometri. MGC-803 celler eller 7901-celler ved 50-70% sammenflydning blev inficeret med virale supernatanter indeholdende 10 mg /ml Polybrene i 24 timer. Frisk medium blev derefter tilsat til de inficerede celler, som senere blev udvalgt med puromycin.

Cell migration og invasion assay Salg

Celler (3×10

5) blev udpladet på 8,0 um porestørrelse Boyden kamre (Transwell, Corning Life Sciences, Acton, MA, USA) enten coatede med 10 ug Matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA, USA) per brønd (for invasion assays) eller venstre uden belægning (for migration analyser) i serum-frit medium indeholdende 10 g /l bovint serumalbumin. Medium indeholdende 10% FBS tjente som en kemoattraktant i det nedre kammer. Ikke-invaderende celler blev fjernet med vatpinde efter 36 h (for invasion assays) eller 20 timer (for migration assays). Invaderede celler blev farvet med hematoxylin (HE) og talt. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD fra tre individuelle eksperimenter

Western blotting

Proteiner blev ekstraheret med erythrocyt-lysis buffer (ELB;. 50 mM Tris, 140 mM NaCl, 0,5% NP 40 og 100 mM NaF (pH 7,6)) indeholdende 1 mM phenylmethansulfonylfluorid (PMSF; Sigma-Aldrich, USA). Hver prøve blev separeret på en 10% SDS-PAGE-gel og derefter overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Membranerne blev blokeret med 5% mælk og inkuberet med primært kanin-anti-humant FSCN1 antistof (1: 3000; Cell Signaling Technology, USA) eller muse-anti-humant GAPDH (1: 5000; Sigma-Aldrich) antistof natten over ved 4 ° C . Membranerne blev derefter inkuberet med det passende peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer (Thermo Fisher Scientific). Båndene blev udviklet ved anvendelse af en forøget kemiluminescens (ECL) (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). GAPDH protein blev anvendt som en loading kontrol.

Statistisk analyse

Dataene er udtrykt som middelværdi ± SD. Statistisk signifikans blev analyseret med t-test. Sammenhængen mellem de miR-145 niveauer og FSCN1 mRNA /protein udtryk i menneskelige gastrisk kræft blev beregnet ved Spearman korrelation. Alle statistiske analyser blev beregnet ved anvendelse af GraphPad Prism statistik software (GraphPad Software).

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant (NS, ikke signifikant; *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

. 0,001)

Resultater

Stærk invers relation mellem ekspression af miR-145 og dens formodede mål, FSCN1, i human infiltrativ form mavekræft

Vi brugte Targetscan database (https://www.targetscan.org) for at identificere de 3 ‘UTR’er specifikke mål mRNA af miR-145, som kan regulere migration og invasion af gastriske kræftceller. Af alle forudsagte mRNA’er, valgte vi FSCN1, som tidligere er blevet impliceret i tumor migration og invasion. FSCN1 har også stærkt konserverede sekvenser i 3’-UTR, som er komplementær til MIR-145 frø sekvens.

Først undersøgte vi, om korrelationen af ​​MIR-145 og FSCN1 kunne være klinisk relevant ved måling af ekspression af miR-145 og FSCN1 mRNA /protein niveauer i normal /tumor parrede prøver fra 80 patienter med mavekræft. Den statistiske analyse afslørede en signifikant omvendt korrelation mellem ekspressionen af ​​MIR-145 og ekspressionen af ​​FSCN1 mRNA /protein i 80 par af kliniske prøver (Fig 1A og 1B).

(A) negativ korrelation mellem miR -145 udtryk og FSCN1 mRNA-niveauer i normal /tumor parret mavekræft prøver (

P

= 1.63E-7; Spearman rank korrelation test: r = -0,7646, n = 80). (B) Invers relation mellem miR-145-ekspression og FSCN1 protein niveauer (

P

= 3.12E-6; r = -0,6754, n = 80).

Ming klassificeret gastrisk carcinomer ind ekspanderende type og infiltrativ typer baseret på vækst og invasionsevne mønstre, og der eksisterer en sammenhæng mellem Ming klassificering og den kliniske prognose [5]. Derfor blev 40 infiltrative mavekræft prøver og 40 ekspanderende mavekræft prøver valgt som indikeret af repræsentanten HE farvning (Fig 2A). I denne klassifikation, cellerne i en ekspanderende karcinom, i kraft af deres begrænsede gennemtrængende magt, aggregat og producere en afgrænset masse i form af polypoid og Cancersår læsioner. I modsætning hertil celler infiltrativ carcinom spredes perifert og bredt, og en tumormasse ikke danner. Vi testede ekspressionen af ​​MIR-145 og FSCN1 mRNA i gastrisk cancer sammenlignet med den tilstødende normale maveslimhinden ved real-time PCR. MIR-145 blev bemærkelsesværdigt nedreguleret i infiltrativ gastrisk cancer sammenlignet med ekspanderende gastrisk cancer, mens ekspressionen af ​​FSCN1 mRNA var bemærkelsesværdigt opreguleret (Fig 2B). Vi valgte 10 infiltrative mavekræft prøver og 10 udvider mavekræft prøver sammen med deres tilstødende normale væv til at analysere udtryk ved qPCR og western blotting. De overordnede ekspressionsniveauer af MIR-145 var lavere, især i de infiltrative gastrisk cancer prøver sammenlignet med den tilstødende normale gastriske mucosa. Derimod er de samlede mRNA /protein niveauer af FSCN1 var højere i infiltrativ gastrisk cancer (Fig 2C). Følgelig ekspressionen af ​​MIR-145 og dens formodede mål FSCN1 havde en stærk invers relation i human infiltrativ typen gastrisk cancer, hvilket tyder, at de væsentlige roller MIR-145 og FSCN1 er i gastrisk invasion cancer.

( A) mavekræft prøver stammer fra 80 patienter blev klassificeret som indikeret af repræsentanten HE farvning. (B) qPCR data af MIR-145 niveauer i infiltrativ gastrisk cancer (n = 40) sammenlignet med ekspanderende gastrisk cancer (n = 40) (

P

= 8.87E-6) (venstre), og qPCR data af FSCN1 mRNA-niveauer i infiltrativ gastrisk cancer (n = 40) sammenlignet med ekspanderende gastrisk cancer (n = 40) (

P

= 1.18E-10) (højre). (C) repræsentant ekspression af MIR-145 og FSCN1 mRNA /protein niveauer i 10 infiltrative gastrisk cancer prøver og 10 ekspanderende mavekræft prøver sammen med deres tilstødende normale væv (N, tilstødende normale væv, T, tumor væv). Arabic tal indikerer individuelle sampleparrene. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg.

miR-145 direkte henvender FSCN1 i gastriske kræftceller

For at afgøre, om miR-145 regulerer ekspressionen af ​​FSCN1 i gastriske cancerceller, vi først opreguleret niveauet af mIR-145 i gastrisk cancer MGC-803 celler under anvendelse et lentivirus-baseret vektor. Vi derefter udført qPCR, som afslørede, at MIR-145 overekspression betydeligt nedreguleret mRNA-niveauet af FSCN1 (Fig 3A), og Western blot eksperimenter bekræftede, at proteinniveauet af FSCN1 også blev undertrykt i MIR-145-overudtrykkende celler (Fig 3B ). Omvendt knockdown af miR-145 niveauer ved hjælp en miR-145 inhibitor resulterede i signifikant inducerede FSCN1 mRNA /protein-ekspression i både SGC-7901 og MGC-803-celler (fig 3C). Vi genererede et ildflueluciferase reporter vektor indeholdende FSCN1 3’UTR og derefter co-transficerede MGC-803-celler med MIR-145 efterligner eller en MIR-145 inhibitor at undersøge om FSCN1 er et direkte mål for MIR-145. Lysaterne blev analyseret for luciferaseaktivitet 24 timer efter transfektion. Den luciferaseanalyse viste, at miR-145 efterligner resulterede i en ca. 55% fald i aktiviteten, mens miR-145-hæmmer øget luciferaseaktiviteten med 62% i MGC-803 celler i forhold til miR-negative kontrol (Fig 3D). Desuden har vi muterede tre store putative MIR-145 anerkendelse elementer (MRE’er) i FSCN1 3’UTR via QuikChange mutagenese til anvendelse i luciferaseassayet (Fig 3D). Resultaterne viste, at de regulatoriske virkninger af miR-145 efterligner eller miR-145-hæmmer primært blev ophævet, som bekræftede, at dæmpende virkninger af miR-145 på FSCN1 blev ophævet ved afbrydelsen af ​​miR-MRE interaktioner (Fig 3D). Kollektivt, disse undersøgelser forudsat overbevisende dokumentation for, at FSCN1 er et direkte mål for miR-145 i gastriske kræftceller.

(A) qPCR data for FSCN1 mRNA-niveauer i MGC-803 celler stabilt udtrykker LV-GFP (kontrol ) og LV-miR-145 lentivirusvektorer (til højre), og qPCR resultater, der viser miR-145 overekspression niveauer (til venstre). (B) MIR-145 overekspression betydeligt nedreguleret ekspression af FSCN1 protein i MGC-803 celler. (C) qPCR data af MIR-145 niveauer og FSCN1 mRNA-niveauer i SGC-7901 (venstre) eller MGC-803 (i midten) celler transficeret med Ctrl inhibitor eller MIR-145-inhibitor. MIR-145-hæmmer markant opreguleret ekspression af FSCN1 protein i SGC-7901 og MGC-803 celler (til højre). (D) en luciferase reporter vektor indeholdende humant WT-FSCN1 3’UTR eller Mut-FSCN1 3’UTR blev cotransficeret med MIR-145 efterligner eller MIR-145 inhibitoren ind MGC-803 celler. Luciferaseaktivitet blev målt ved 48 timer efter transfektion og normaliseret til p-gal-aktivitet. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD af tre individuelle eksperimenter (**

P

0,01; ***

P

0,001).

Undertrykkelse af FSCN1 er nødvendig for miR-145 til at hæmme migration og invasion af gastriske kræftceller

mavekræft MGC-803 og SGC-7901 celler blev stabilt transficeret med to forskellige FSCN1 shRNAs at hæmme FSCN1 til bedre at forstå potentielle rolle FSCN1 i miR-145-medieret tumor migration og invasion. Den interferens effektivitet FSCN1 shRNAs blev bekræftet ved Western blot analyse (fig 4A og 4B). Transwell assay Resultaterne viste, at evnen hos cellerne til at migrere og invadere var stærkt undertrykt efter banker ned ekspressionen af ​​FSCN1 i MGC-803 og SGC-7901 celler sammenlignet med negative kontrolceller (fig 4C og 4D), hvilket tyder på en væsentlig rolle af FSCN1 i disse processer.

(A og B) Western-blotting blev anvendt til måling af den relative ekspression af FSCN1 protein i MGC-803 (A) og SGC-7901 (B) celler stabilt udtrykker lacZ shRNA og to forskellige FSCN1 shRNAs. (C og D) ShFSCN1 MGC-803 (C) eller SGC-7901 (D) celler udstillet faldt migration og invasion evne i forhold til shCtrl MGC-803 eller SGC-7901 celler. Repræsentative billeder (øverst) og celletal (nederst) er vist. AU: vilkårlig enhed. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD af tre individuelle eksperimenter (***

P

0,001).

MIR-145 er kendt for at undertrykke migration og invasion af mange kræftformer, herunder gastrisk kræft [10, 19, 21]. Som forventet tvungen udtryk for miR-145 resulterede i signifikant nedsat migration og invasion satser i MGC-803 og SGC-7901 celler. Desuden samtidig re-ekspression af FSCN1 kompromitterede MIR-145-supressed cellemigration og invasion evne næsten fuldstændigt i begge MIR-145-transficerede MGC-803 og SGC-7901 celler (Fig 5A og 5B). Omvendt brugte vi FSCN1 shRNA at hæmme FSCN1 udtryk i miR-145 inhibitor-transficeret MGC-803 og SGC-7901 celler. Knockdown af FSCN1 helt vendt miR-145 inhibitor-medieret aktivering af celle migration og invasion, hvilket tyder væsentlige rolle FSCN1 i denne proces (Fig 5C og 5D). Kollektivt de ovenstående resultater viste, at undertrykkelsen af ​​FSCN1 er nødvendig for MIR-145 til at inhibere migrering og invasion af gastriske cancerceller.

(A og B) Re-ekspression af FSCN1 kompromitterede MIR-145- supressed cellemigration og invasion evne i begge mIR-145-transficerede MGC-803 (A) og SGC-7901 (B) celler. FSCN1 protein niveauer (til venstre), repræsentative billeder (i midten) og celletal (højre) er vist. (C og D) Knockdown af FSCN1 kompromitterede MIR-145-hæmmerinduceret cellemigration og invasion evne i begge MIR-145 inhibitor-transficerede MGC-803 (C) og SGC-7901 (D) celler. FSCN1 protein niveauer (til venstre), repræsentative billeder (i midten) og celletal (højre) er vist. AU: vilkårlig enhed. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD af tre individuelle eksperimenter (ns, ikke signifikant; *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

. 0,001)

diskussion

deregulering af Mirs har været impliceret i forskellige menneskelige kræftformer, herunder menneskets mavekræft. Imidlertid er de molekylære mekanismer, hvorved Mirs modulerer processen med carcinogenese og opførslen af ​​cancerceller er ikke blevet fuldstændigt defineret. Differential miR udtryk i tumorer i forhold til deres tilstødende normale væv eller mellem grupper af tumor prøver med en gunstig eller dårlig klinisk resultat er blevet anvendt til at generere mir signaturer med potentielle prognostiske og /eller prædiktiv værdi i visse typer kræft. Ikke desto mindre, inddragelse af de afvigende udtrykte Mirs i human gastrisk cancer stort set uudforsket. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at MIR-145 nedreguleres i forskellige humane maligniteter, herunder brystcancer, lungecancer og mavecancer [9, 22, 23]. Lu et al [24] fandt, at miR-145 fungerer som en tumor suppressor og mål to onkogener, nemlig ANGPT2 og NEDD9, i renalcellecarcinom. En anden undersøgelse har vist, at MIR-145 undertrykker cellemigration og invasion ved at hæmme N-cadherin proteintranslation i gastriske cancerceller [10]. Men Kamikihara et al [11] fandt, at kun 21% gastrisk kræftpatienter har N-cadherin-positivt udtryk som analyseret ved immunhistokemi. Derfor er en alternativ molekylær mekanisme bag miR-145 involveret i reguleringen af ​​celle migration og invasion af mavekræft.

I den foreliggende undersøgelse, vi bekræftet, at miR-145 er nedreguleret i gastrisk kræft væv sammenlignet til den tilstødende normale maveslimhinden, hvilket er i overensstemmelse med tidligere resultater [9]. I et forsøg på at identificere nye nedstrøms mål for miR-145, brugte vi Targetscan database til at udføre screening eksperimenter. Fra flere kandidater valgte vi FSCN1 til yderligere forsøg, fordi FSCN1 har vist sig at spille en vigtig rolle i tumor migration og invasion. Flere linjer af beviser tyder på, at FSCN1 er den direkte nedstrøms mål for miR-145. For det første FSCN1 indeholder yderst konserverede sekvenser i 3′-UTR, som er komplementær til MIR-145 frø sekvens. For det andet blev en omvendt korrelation mellem miR-145 og FSCN1 findes i de parrede prøver fra gastrisk kræftpatienter. Endelig, når klassificere de kliniske prøver i ekspanderende type og infiltrativ typen baseret på Ming klassificering, fandt vi, at miR-145 er bemærkelsesværdigt nedreguleret i infiltrativ gastrisk kræft i forhold til at udvide mavekræft. I mellemtiden var en stærkere omvendt korrelation også påvist mellem miR-145 og FSCN1 ekspressionsniveauerne i infiltrativ gastrisk cancer. Nærværende undersøgelse kaste nyt lys over sammenhængen mellem miR-145 og FSCN1 i infiltrativ mavekræft. I en tidligere undersøgelse, Lauren opdelt gastrisk kræft i følgende to typer: tarm type og diffus art [25]. Intestinal type, cancer er beskrevet som en glandulær tumor ligner colon carcinom og diffus art kræft er sammensat af solitære eller små klynger af celler uden dannelse af kirtler. De tumor typer i Laurens og Ming klassifikation nøje svare til hinanden. De fleste ekspanderende tumorer har træk af intestinal type cancer, og mest infiltrative tumorer er diffuse typen cancere [5]. Dog kan et betydeligt antal af gastrisk karcinom ikke klassificeret i tarm type eller diffuse type, herunder udifferentierede kræftformer, der ikke infiltrere diffust og glandulær kræftformer, der infiltrerer diffust. Desuden er relativt vanskeligt, fordi den tidlige fase af diffus form kræft, per definition, er ikke diffus påvisning af tidlig mavekræft hjælp Laurens klassificering. Dog kan Ming klassificering løse disse problemer [5]. I Ming klassificering, mønstrene i celle fordeling klart angive en grundlæggende forskel i deres vækstpotentiale samt gennemslagskraft og invasion. Som infiltrativ gastrisk kræft er mere indgribende end at udvide mavekræft, disse resultater tyder på, at miR-145 og FSCN1 både spiller afgørende roller i gastrisk invasion kræft.

Selv om flere rapporter har impliceret reguleringen af ​​FSCN1 af Mirs i mange karcinomer [19, 20, 26], til vores bedste viden, ingen rapport har foreslået, at FSCN1 er et direkte mål for miR-145 i mavekræft. I denne undersøgelse har vi bekræftet, at MIR-145 undertrykker FSCN1 ekspression og gælder målretter 3’UTR af FSCN1 i gastriske cancerceller. Desuden den samtidige re-ekspression af FSCN1 kompromitterede MIR-145-supressed cellemigration og invasion evne næsten fuldstændigt i MIR-145-transficerede MGC-803 og SGC-7901 celler, hvilket indikerede, at undertrykkelsen af ​​FSCN1 er nødvendig for miR -145 til at inhibere migrering og invasion af gastriske cancerceller. Derfor FSCN1 er en vigtig nedstrømsmål af MIR-145 i reguleringen gastrisk cancer invasion.

Sammenfattende den foreliggende undersøgelse identificeret, MIR-145 er primært nedreguleret i infiltrativ gastrisk cancer og at MIR-145-ekspression og FSCN1 udtryk har en stærk omvendt korrelation i infiltrativ mavekræft. Funktionelt, viste vi, at miR-145 undertrykker celle migration og invasion i gastrisk cancer primært ved direkte rettet mod FSCN1. Derfor genoprette ekspressionen af ​​miR-145 kan udforskes som en alternativ terapeutisk strategi mod mavekræft.