PLoS ONE: Karakterisering af Voksen α- og β-globin Forhøjede af hydrogenperoxid i Livmoderhalskræft kræftceller, der spiller en cytobeskyttende rolle mod oxidativ Insults

Abstrakt

Mål

Hæmoglobin (Hgb) er den vigtigste oxygen og carbondioxid bærer i celler af erythroid afstamning og er ansvarlig for ilttilførsel til respirerende væv i kroppen. Imidlertid er Hgb også udtrykkes i nonerythroid celler. I nærværende undersøgelse blev udtryk for Hgb i human livmoderhalsen carcinomaceller og dets rolle i livmoderhalskræft undersøgt.

Metode

Udtrykket niveau af Hgb i livmoderhalskræft væv blev vurderet ved kvantitativ revers transkriptase-PCR (QRT-PCR). Vi anvendte flere fremgangsmåder, såsom RT-PCR, immunoblotting, og immunhistokemisk analyse, for at bekræfte Hgb ekspression i cervicale cancerceller. Virkningerne af ektopisk ekspression af Hgb og Hgb mutanter på oxidativ stress og cellelevedygtigheden blev undersøgt ved cellulære reaktive oxygenarter (ROS) analyse og lactatdehydrogenase (LDH) array, hhv. Både Annexin V-farvning-assay ved flowcytometri og caspase-3-aktivitet-assay blev anvendt henholdsvis til at evaluere celle apoptose.

Resultater Salg

QRT-PCR-analyse viste, at Hgb-α- (HbA1) og Hgb-β-globin (HBB) genekspression var signifikant højere i cervical carcinoma end i normale cervikale væv, hvorimod ekspressionen af ​​hæmatopoietiske transkriptionsfaktorer og erythrocyt specifikke markørgener ikke blev forøget. Immunofarvning eksperimenter bekræftede ekspressionen af ​​Hgb i cancerceller af cervix uteri. Hgb mRNA og protein blev også påvist i de humane cervikale carcinoma cellelinier SiHa og CaSki, og Hgb Ekspression blev opreguleret af hydrogenperoxid-induceret oxidativ stress. Vigtigere, ektopisk udtryk for vildtype HbA1 /HBB eller HbA1, snarere end mutanter HbA1

H88R /HBB

H93R i stand til at binde hemo, undertrykt oxidativ stress og forbedret celle levedygtighed.

Konklusioner

de nuværende resultater viser for første gang, at Hgb udtrykkes i cervikale carcinomceller og kan virke som en antioxidant, formildende oxidativ stress-induceret skade i livmoderhalskræft celler. Disse data giver en væsentlig indvirkning ikke kun i globin biologi, men også i forståelsen af ​​livmoderhalskræft patogenese associeret med oxidativt stress

Henvisning:. Li X, Wu Z, Wang Y, Mei Q, Fu X, Han W ( 2013) Karakterisering af Voksen α- og β-globin Forhøjede af hydrogenperoxid i Livmoderhalskræft kræftceller, der spiller en cytobeskyttende rolle mod oxidativ Fornærmelser. PLoS ONE 8 (1): e54342. doi: 10,1371 /journal.pone.0054342

Redaktør: Russell O. Pieper, University of California-San Francisco, USA

Modtaget: 9 juli, 2012; Accepteret: 12. december, 2012; Udgivet: januar 17, 2013 |

Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (hjemmeside er https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default 124.htm) (nr 31.201.033, 31.270.820, 81.230.061 og 81.001.184) og blev delvist støttet af tilskud fra udviklingsprogram Kina (hjemmeside er https://www.973.gov.cn/Default_3.aspx) (nr 2012CB518103 og 2012CB518105) National Basic Science and. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hæmoglobin (Hgb), de store hemproteinet af erytrocytter, letter transporten af ​​ilt og kuldioxid i blodet. HGB molekylet er en samling af fire globulære proteinunderenheder. HgbA, den mest almindelige type af Hgb i voksne mennesker, er en tetramer bestående af to hæm-holdige a- og p-underenheder holdes sammen af ​​ikke-kovalente interaktioner (α

2β

2) [1], [2] . Andre hvirveldyr hæm indeholdende proteiner med strukturel homologi til globinkæder omfatter myoglobin, som er bredt findes i hvirveldyr hjerter og tværstribede og glatte muskler [3], cytoglobin, hovedsagelig beskrevet i bindevæv [4], og neuroglobin, udtrykkes bredt i hjernen [ ,,,0],5].

den fælles funktion Hgbs som et hvirveldyr main oxygen og carbondioxid bærer er en forholdsvis ny tilpasning under evolutionen, der kræves for at sikre korrekt levering af oxygen til alle celler i kroppen via hjælp af det vaskulære netværk . Ud over denne klassiske rolle, kan Hgbs udføre andre cellulære aktiviteter, herunder intracellulær oxygen transport, oxygen sensing, NO scavenging, hydrogenperoxid scavenging, og jern metabolisme regulering [6]. Nylige undersøgelser rapporterede påvisning af Hgb kæder i andre celler end de af erythroide serier, herunder neuroner [7], [8], [9], retinale celler [10], [11], alveolære epitelceller [12], [ ,,,0],13], [14], endometrium [15], rotte nyre mesangialceller [16], hepatocytter [17] og makrofager [18]. Det blev spekuleret, at funktionen af ​​Hgb i neuroner kan være oxygen opbevaring [9]. I alveolære epitelceller, kan hypoxi-induceret Hgb ekspression spiller en rolle i ilt sensing pathway [14]. Microarray analyser af MN9D dopaminerge cellelinier stabilt transficeret med Hgb-α-globin (HbA1) og Hgb-β-globin (HBB) kæder afslørede ændringer i ekspressionen af ​​gener involveret i oxygen homeostase og mitokondriel oxidativ phosphorylering [7]. Desuden blev Hgb overekspression vist sig at reducere oxidativ stress, hvilket antyder, at Hgb fungerer som en antioxidant [16], [17].

Oxidativ stress er forårsaget af en ubalance mellem dannelsen af ​​aktive oxygenmetabolitter og den hastighed, som de er indfanges ved enzymatisk og ikke-enzymatiske antioxidanter, og det er blevet forbundet med patogenesen og komplikationer af flere sygdomme, herunder cancer [19]. Overproduktion eller utilstrækkelig fjernelse af reaktive oxygenarter (ROS), såsom hydrogenperoxid, hydroxylradikaler og superoxid anion associeret med carcinogenese [20] og invasivitet [21]. Enzymatiske og ikke-enzymatiske antioxidant forsvarsmekanismer regulerer cellulær redox balance og derfor patogenesen af ​​mange sygdomme. Men vores forståelse af de roller oxidant og antioxidant systemer i carcinogenese og tumor udvikling er fortsat begrænset. Bemærkelsesværdigt, en nylig undersøgelse viste, at Hgb fungerer som en antioxiderende peroxidase, svækkende hydrogenperoxid induceret oxidativ stress [22].

Advances in high-throughput microarray teknologi har gjort det muligt at sammenligne genekspressionsprofiler mellem primære tumorer og normale væv. Microarray-baserede genekspression analyser identificeret Hgb gener udtrykkes forskelligt i solide tumorer, herunder brystkræft [23], æggestokkene serøs karcinom [24], og kolorektal carcinom [25]. En nylig proteomisk undersøgelse viste, at serum HbA1 og HBB niveauer blev signifikant forhøjet i æggestokkene kræftpatienter sammenlignet med normale raske kvinder [26]. Selvom kilden til frie Hgb i serummet var ukendt, blev det antaget at være resultatet af oxidativ stress-induceret hæmolyse. De mekanismer, der ligger til grund for reguleringen af ​​Hgb og dets funktionelle konsekvenser i solide tumorer mangler at blive fuldt forstået.

I den foreliggende undersøgelse, viser vi, at Hgb-α, voksen kæde 1 (HBA-a1), og Hgb- β, er voksen kæde-1 (Hbb-b1) udtrykt i carcinomceller af flere typer af faste tumorer. Hgb ekspression blev påvist i klinisk resektion prøver af human cervikal væv og var opreguleret i livmoderhalskræft væv sammenlignet med normale væv. Desuden er vores resultater viste, at oxidativt stress opregulerer Hgb ekspression. Vigtigere er det, Hgb overekspression reduceret oxidativ stress og forbedret levedygtigheden af ​​livmoderhalskræft celler. Kollektivt tyder vore resultater, at Hgb kan være en komponent af det endogene antioxidantforsvarssystem, beskytter celler mod oxidativ skade hos patienter med cervikal cancer.

Resultater Salg

Øget Hgb genekspression i livmoderhalskræft Enheder

For at undersøge differentielt udtrykte gener i livmoderhalskræft, vi analyserede en tidligere publiceret microarray datasæt inklusive 33 livmoderhalskræft og 24 normale prøver. Sammenlignet med normale cervix epitel viste livmoderhalskræft prøver en signifikant forhøjelse i ekspressionen af ​​HbA1 og HBB-gener (tabel 1). Men udtryk for transkriptionsfaktorer til erythroid differentiering [27], herunder NFE2, KLF1 /EKLF, TAL1 /SCL og GATA1 ikke stige. Desuden har ekspression af andre hæmoglobin gener (HBD HBE1, HBG2, HBQ1 og HBZ) og erythrocyt specifikke markørgener, såsom SPTB, ERAF og ALAS2 ikke viser en betydelig stigning. Disse resultater tyder på, at forhøjet HbA1 og HBB udtryk i livmoderhalskræft ikke skyldes erythropoiese, men fra en anden mekanisme.

For at validere potentielle rolle Hgb i human cervikal karcinom, ekspressionsniveauerne af HbA1 og HBB blev undersøgt i 20 livmoderhalskræft prøver og 10 normale livmoderhalsen vævsprøver ved QRT-PCR-analyse. De specifikke primere af HbA1 og HBB var designet til QRT-PCR ifølge National Center for Biotechnology Information (NCBI) database. Specificiteten af ​​primerne til HbA1 og HBB-amplifikation blev bekræftet under anvendelse af RNA ekstraheret fra human knoglemarv og perifert blod som en positiv kontrol (fig. 1A). For det første blev RT-PCR eksperiment udført for at bestemme ekspressionsniveauerne af HbA1 og HBB-generne i 20 livmoderhalskræft prøver (fig. 1B). Overensstemmelse med microarray datasæt, viste QRT-PCR-analyse, at ekspressionen af ​​HbA1 og HBB var signifikant højere i livmoderhalskræft væv end i normale cervix væv (fig. 1C og D). Imidlertid blev ekspressionen af ​​transkriptionsfaktorer til erythropoiese, herunder GATA-1, KLF1, og SCL /TAL1 [27], ikke ændret sig væsentligt i livmoderhalskræft væv sammenlignet med kontrollerne (data ikke vist). Ekspressionen af ​​erythrocyt specifik markørgener, såsom SPTB, ERAF, blev ikke opreguleret i livmoderhalskræft væv, hvilket indikerer, at stigningen i Hgb ekspression ikke var forbundet med erythropoiese. Disse resultater tyder på, at Hgb kan spille en rolle i human cervikal udvikling af kræft.

(A) For at bekræfte specificiteten af ​​HbA1 og HBB primere til QRT-PCR, udtryk for HbA1 og HBB blev undersøgt i human knoglemarv og perifere blodceller. Retrotranscriptase fri (-) som negativ kontrol, H

2O som et kontrolsystem. Hr, Marker. (B) cDNA fra livmoderhalskræft prøver blev fremstillet og analyseret for ekspression af HbA1 og HBB ved RT-PCR. PCR-produkter blev separeret på 2% agarosegeler og visualiseret med ethidiumbromid. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. H

2O som et styresystem, T, repræsenterer primære tumor prøver. Ekspressionsniveauerne af HbA1 og HBB blev målt ved QRT-PCR i 20 humane livmoderhalskræft prøver og 10 normale cervikale kontroller væv. Kvantificering af den angivne normaliserede HbA1 og HBB-niveauer (log

10) af det samlede uparrede normale cervix (n = 10) og livmoderhalskræft (n = 20) prøver er vist. Tukey kasser repræsenterer den øvre og nedre kvartiler divideret med median og whiskers er de største og mindste værdier, eksklusive outliers repræsenteret ved cirkler. Alle forskelle var statistisk signifikant på

P

. 0,05 (C og D)

Påvisning af Hgb Protein i Cervixcancer væv

udtryk for Hgb på proteinniveau blev undersøgt under anvendelse af kommercielle antistoffer mod højt oprensede humane Hgb. På grund af den høje homologi mellem globin familiens proteiner blev specificiteten af ​​antistoffet til påvisning af HbA1 og HBB kæder verificeret ved transfektion i humane embryonale nyre HEK293-celler med ekspressionsvektorer, der bærer EGFP-mærkede globin isoformer (HBA-a1, Hbb-b1 , HBA-x, Hbb-y, HBA-z), som viste ingen krydsreaktion med andre globiner i Immunofarvning eksperimenter (fig. S1). For at undgå krydsreaktivitet med blodceller, blev livmoderhalskræft væv vasket grundigt i PBS før fiksering. Hematoxylin og eosin (H 0,01. (B) HbA1 og HBB-proteinekspression blev induceret ved H

2O

2 behandling. Helcellelysater opnået fra SiHa-celler behandlet med eller uden H

2O

2 (1 mM, 48 h) blev analyseret for HbA1 og HBB-niveauer. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (C) HbA1 og HBB mRNA var opreguleret af H

2O

2 behandling i HEK293 celler. HEK293-celler blev behandlet med H

2O

2 (1 mM, 36 h). Revers transkription PCR produkter blev separeret på 2% agarosegeler og visualiseret med ethidiumbromid. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (D) Dosis og tid afhængighed af svaret af SiHa celler til H

2O

2 behandling. SiHa-celler blev behandlet med en serie af koncentrationer (0, 0,25, 0,5 og 1 mM) H

2O

2 til 8, 16, 24 eller 36 timer. Relativ HbA1 mRNA-niveauet blev bestemt ved QRT-PCR. Data blev udtrykt som gennemsnit ± SD (n = 3). Værdier blev normaliseret til HbA1 niveau i kontrollen (0 mM, 8 timer), som blev sat til 1. En-vejs ANOVA-test for multiple sammenligninger blev anvendt til at analysere forskellene mellem behandlingerne.

**

P

0,01;

***

P

. 0,001, sammenlignet med 0 mM behandling

For at undersøge mulige dosis og tid afhængighed af H

2O

2-induceret opregulering af Hgb blev SiHa celler behandlet med forskellige H

2O

2 koncentrationer for forskellige tidsperioder og analyseret ved standard QRT-PCR. Som det ses i fig. 4D, H

2O

2 øget Hgb mRNA-niveauer i en dosis- og tidsafhængig måde. Effekten af ​​oxidativ stress på ekspressionen af ​​GATA-1 og KLF1, som er transkriptionsfaktorer, som regulerer Hgb ekspression under erythropoiese, blev undersøgt. I overensstemmelse med en tidligere undersøgelse i hepatocytter [17], den opregulering af Hgb ved H

2O

2 blev ikke medieret af GATA-1 og KLF1, hvilket tyder på, at en anden underliggende mekanisme kan være involveret (fig. S5 ).

Dæmpning af ROS Generation og apoptose induktion ved HbA1 /HBB eller HbA1, men ikke HbA1

H88R /HBB

H93R Overekspression i livmoderhalskræft Celler

for at undersøge den biologiske rolle Hgb i cervicale cancerceller, blev HbA1 og HBB overudtrykt ved transient transfektion af SiHa-celler. Forøget ekspression af HbA1 og HBB blev bekræftet ved immunoblotting (fig. 5A). Baseret på en tidligere undersøgelse, der viser, at visse oxidative stress inducerbare gener har antioxiderende [30], vi den hypotese, at Hgb kan have antioxidant egenskaber i livmoderhalskræft celler som reaktion på oxidativ stress. Vi undersøgte derfor de intracellulære niveauer af ROS i celler behandlet med H

2O

2 ved hjælp fluorogene sonder og fra superoxid anion. Ektopisk ekspression af HbA1 /HBB i SiHa-celler behandlet med exogen H

2O

2 undertrykt den intracellulære produktion af H

2O

2 og superoxid anion som bestemt ved immunofluorescens-analyse (fig. 5B og C) . Kvantificering af ROS-produktion ved flowcytometri viste, at fluorescensintensiteten i celler, der overudtrykker HbA1 /HBB var signifikant lavere end i celler transduceret med kontrol lentivirus (fig. 5D og E). Procentdel pr totale celletal med høje niveauer af hver ROS i celler, der overudtrykker HbA1 /HBB blev signifikant reduceret sammenlignet med transfektion med den tomme vektor som en kontrol (

P

0,05, n = 3 for hver gruppe; Fig . 5F og G). Lignende resultater blev observeret i CaSki-celler (data ikke vist). Den omstændighed, at ekspressionsniveauet af HbA1 i cervikale cancercellelinier er højere end den for HBB antyder, at flere bioaktive molekyler, ikke kun heterodimeren former, men også monomere eller homodimer former af HbA1 protein kan være til stede på samme tid i livmoderhalskræft celler. Til støtte for denne opfattelse blev SiHa celler blot transficeret med HbA1 og derefter behandlet med eksogent H

2O

2. I overensstemmelse med en nylig undersøgelse [31], procentdel pr totale celletal med intracellulære niveauer af ROS i celler, der overudtrykker HbA1 var signifikant lavere end i celler transficeret med kontrolvektoren (fig. 5H). Du kan afvise enhver generaliseret eller selektive virkning på grund af den ikke-specifikke overekspression af protiens, genereret vi en cellelinie, der udtrykker en inaktiv form af Hgb bærer en aminosyre ændring i Hans ansvaret for at koordinere hemo prostetiske gruppe (HbA1

H88R [ ,,,0],31] og HBB

H93R, fig. S6). Som det kan ses i fig. 5I, de intracellulære ROS-niveauer i celler, der overudtrykker HbA1

H88R /HBB

H93R ikke blev væsentligt reduceret, sammenlignet med i celler transficeret med tom vektor, hvilket antyder, at hæm-bindende aktivitet er påkrævet for Hgb antioxidative funktion.

(a) Helcellelysater fra SiHa-celler transficeret med et kontrolplasmid eller HbA1 og HBB ekspressionsplasmider blev analyseret med et anti-Hb-antistof for at bekræfte overekspression af globinproteiner. Kontrol og HbA1 /HBB- overudtrykker celler blev farvet med fluorogene prober til påvisning af intracellulære H

2O

2 og superoxid anion og udsat for ekstracellulær H

2O

2 (1 mM) i 10 minutter. Immunofarvning bekræftet, at den intracellulære generation af H

2O

2 (B) og superoxid anion (C) blev undertrykt i HbA1 /HBB-overudtrykkende celler. Flowcytometri-analyse bekræftede disse resultater (D og E) og viste, at de intracellulære niveauer af H

2O

2 og superoxid anion var højere i celler udsat for ekstracellulære stimuli end i ubehandlede celler (B og C). Kvantitative analyser bekræftede, at den intracellulære generation af H

2O

2 (F) og superoxid anion (G) blev inhiberet i HbA1 /HBB-overudtrykkende celler (sort kolonne) mere end i kontrolceller (grå søjle;

P

0,05). Kvantitative analyser bekræftede, at den intracellulære generation af ROS blev reduceret i HbA1-overudtrykkende celler (sort søjle, H), men ikke i HbA1

H88R /HBB

H93R-overudtrykkende celler (sort søjle, I) mere end i kontrol vektor-overudtrykkende celler (grå søjle). *

P

0,05; **

P

0,01;

N

P

. 0,05

En lactatdehydrogenase (LDH) cytotoksicitet assay, som måler frigivelsen af ​​LDH i dyrkningsmediet, blev udført for at undersøge cellernes levedygtighed under oxidativt stress. SiHa celler, der overudtrykker HbA1 og HBB viste LDH frigivelseshastigheder af 22,1 ± 2,2% og 32,5 ± 3,4% som respons på behandling med 0,5 mM og 1 mM H

2O

2 i 24 timer, sammenlignet med 29,6 ± 3,1 % og 34,6 ± 2,1%, henholdsvis i celler transficeret med tom vektor (

P

0,01 og

P

0,05 for 0,5 og 1 mM H

2O

2, henholdsvis n = 3 for hver gruppe) (fig 6A).. SiHa cellelevedygtighed blev også forbedret ved HbA1 og HBB overekspression når celler blev behandlet med 0,5 mM og 1 mM H

2O

2 i 36 timer (

P

0,01). Lignende resultater blev opnået i HbA1-overekspression SiHa-celler (fig. 6B). Vi undersøgte derefter, om funktionen af ​​Hgb at forbedre cellernes levedygtighed afhænger af dens hæm-bindende aktivitet, ved hjælp af HbA1

H88R /HBB

H93R mutanter, som er ude af stand til at binde hæm men bevare kæde konformation. Som det kan ses i fig. 6B, mutation af Hans ansvaret for at koordinere hæm prostetiske gruppe (HbA1

H88R og HBB

H93R) af HgbA forringer dens evne til at forbedre cellernes levedygtighed.

(A) Den levedygtighed SiHa celler behandlet med 0, 0,5, og 1 mM H

2O

2 til 12, 24 og 36 timer som ekstracellulær oxidativt stress blev vurderet ved LDH-frigivelse assay. SiHa-celler transficeret med de HbA1 /HBB-udtrykkende vektorer (sort søjle) viste forøget resistens mod H

2O

2-induceret celle sammenlignet med celler transficeret med kontrolvektoren (grå søjle). Lignende eksperimenter blev præformet i begge HbA1-overekspression celler og HbA1

H88R /HBB

H93R-overekspression celler (B). SiHa-celler blev transfekteret med de angivne plasmider. Otteogfyrre timer senere blev cellerne behandlet med 1 mM H

2O

2 eller venstre ubehandlet i 22 timer. Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev overvåget ved Annexin V-farvning efterfulgt af FACS-analyse (C). SiHa-celler blev transfekteret med de angivne plasmider og fyrretyve time senere, blev behandlet som i (A), Caspase-3-aktivitet i anden gruppe blev målt ved anvendelse specifik caspase substrat AcDEVD-pNA som beskrevet under materialer og metoder. Værdier af absorptionen blev udtrykt som kontrol, som blev sat til 1 (D og E). Alle eksperimenter blev udført tredobbelt og blev gentaget mindst tre gange, og resultaterne er udtrykt som middelværdi ± S.E.M *

P

. 0,05; **

P

0,01;

N

P

. 0,05

ROS (superoxid, hydrogenperoxid, og hydroxylradikaler) er potente intracellulære oxidanter og induktorer af oxidativ skade, der er blevet foreslået som kritiske regulatorer af apoptose [32] og behandlinger med antioxidanter beskytter celler fra apoptose [33]. Eftersom tilstedeværelsen af ​​Hgb (enten HbA1 eller HbA1 /HBB) fører at reducere produktionen af ​​interacellular ROS, er det tænkeligt, at sådanne celler bevarer evnen til at beskytte sig mod oxidative fornærmelser. Således har vi rejst spørgsmålet om, hvorvidt Hgb-medieret beskyttelse mod celledød i SiHa celler var simpelthen på grund af reduceret intracellulær akkumulering af ROS. Vi udforsket denne mulighed ved at bestemme effekten af ​​vildtype HbA1 /HBB, HbA1 og mutanter HbA1

H88R /HBB

H93R-overekspression på H

2O hjælp

2-induceret apoptose ved flowcytometrisk analyse SiHa-celler. Som vist i fig. 6C, viste resultaterne, at befolkningen i de apoptotiske celler induceret af H

2O

2 blev hæmmet i både HbA1 og HbA1 /HBB-overekspression celler, men ikke i HbA1

H88R /HBB

H93R -overexpression celler. Aktivering af en cysteinprotease, kaldet caspase-3 og frembringelsen af ​​ROS blev anset vigtige trin i induktionen af ​​celledød [34] og det vides, at ROS-generering i mitokondrier aktiverer caspase-3 via samarbejde af cytochrom

c

, Apaf-1 og caspase-9 [35]. Derefter undersøgte vi virkningen af ​​Hgb på caspase-3-aktivering. Overensstemmelse med Annexin V binding assay fandt vi, at forøgelse af aktivering af caspase-3 forårsaget af 0,5 mM og 1 mM H

2O

2 efter inkubering i 12, 24 og 36 timer, henholdsvis kunne reduceres betydeligt i både HbA1 og HbA1 /HBB-overekspression celler, sammenlignet med den tomme vektor (fig. 6D). I modsætning hertil ektopisk ekspression af HbA1

H88R /HBB

H93R i SiHa-celler ikke var effektive i forebyggelsen H

2O

2-induceret caspase-3-aktivering (fig. 6E), hvilket antyder, at heme- bindingsaktivitet er påkrævet for dens funktion. Sammenfattende disse resultater antydede, at både HbA1 og HbA1 /HBB overekspression kan have en antioxidant virkning via latrintømning af ROS, og dermed beskytte livmoderhalskræft celler mod oxidativt stress-induceret skade.

Diskussion

I nærværende undersøgelse, viste vi, at Hgb ekspression blev forhøjet i livmoderhalskræft væv sammenlignet med normale livmoderhalsen væv. Dette er det første bevis på, at a- og β-globin-kæderne i Hgb udtrykkes i cancerceller på livmoderhalsen. Vi anvendte den cervikale carcinoma cellelinier SiHa og CaSki at undersøge Hgb-α og Hgb-β-mRNA og proteinekspression ved hjælp af tre forskellige metoder: RT-PCR, immunfarvning og western blot-analyse. Desuden Hgb svækket hydrogenperoxid induceret oxidativt stress i livmoderhalskræft celler, som en antioxidant.

mangeårige forestilling om, at Hgb kun udtrykkes i cellerne i erythroid afstamning er blevet udfordret i de seneste undersøgelser, der viser Hgb udtryk i nonerythrocytes, herunder neuroner [7], [8], [9], retinale celler [10], [11], alveolære epitelceller [12], [13], [14], endometrium [15], rotte nyre mesangialceller [16], hepatocytter [17] og makrofager [18]. Den vigtigste funktion af Hgb i erytrocytter er at transportere ilt fra lungerne til væv og transportere kuldioxid fra væv til lungerne. Den biologiske funktion af Hgb i nonerythroid celler mangler at blive belyst, og dens fysiologiske funktion er stadig et spørgsmål om forhandling. Hgb overekspression i en murin dopaminerg cellelinie, MN9D, ændret ekspression af forskellige gener involveret i oxygen homeostase og mitokondriel oxidativ phosphorylering, hvilket antyder, at Hgb kan fungere som et oxygen storage molekyle i neuroner [9].