PLoS ONE: human knoglemarv mesenchymale stamceller Display Anti-Cancer aktivitet i SCID mus med dissemineret Non-Hodgkins Lymfom Xenografter

Abstrakt

Baggrund

Selvom multimodalitet behandling kan inducere høj remission i mange undertyper af non-Hodgkins lymfom (NHL), en betydelig procentdel af patienter tilbagefald med uhelbredelig sygdom. Effekten af ​​human knoglemarv (BM) mesenkymale stamceller (MSC) på tumorcellevækst er kontroversiel, og ingen specifikke oplysninger om virkningen af ​​BM-MSC på NHL.

Metode /vigtigste resultater

effekten af ​​BM-MSC blev analyseret i to

in vivo

modeller af formidles non-Hodgkins lymfomer med en indolent (EBV

– Burkitt-typen BJAB, median overlevelse = 46 dage) og en aggressiv (EBV

+ B lymfoblastoid SKW6.4, median overlevelse = 27 dage) adfærd hos nøgne-SCID-mus. Intra-peritoneal (ip) injektion af MSC (4 dage efter ip injektion af lymfomceller) steg den samlede overlevelse signifikant på et optimalt MSC:lymphoma forholdet 1:10 i begge xenograftmodeller (BJAB + MSC, median overlevelse = 58,5 dage; SKW6.4 + MSC, median overlevelse = 40 dage). Ved MSC injektion, i.p. tumormasser udviklet mere langsomt og, på den histopatologiske observation, udviste en massiv stromal infiltration koblet til omfattende intra-tumor nekrose. I

in vitro

eksperimenter fandt vi, at: i) MSC /lymfom co-kulturer beskedent påvirket lymfom celleoverlevelse og var kendetegnet ved øget frigivelse af pro-angiogene cytokiner med hensyn til MSC, eller lymfom, kulturer; ii) MSC inducere migrationen af ​​endotelceller i transwell assays, men fremmes endotelcelle apoptose i direkte MSC /endotelcelle co-kulturer.

Konklusioner /Signifikans

Vores data viser, at BM-MSC udviser anti-lymfom aktivitet i to særskilte xenograft SCID musemodeller af dissemineret NHL

Henvisning:. Secchiero P, Zorzet S, Tripodo C, Corallini F, Melloni E, Caruso L, et al. (2010) human knoglemarv mesenchymale stamceller Display Anti-Cancer aktivitet i SCID mus med dissemineret Non-Hodgkins lymfom Xenografter. PLoS ONE 5 (6): e11140. doi: 10,1371 /journal.pone.0011140

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: Februar 23, 2010; Accepteret: 24 maj 2010; Udgivet 16. juni, 2010

Copyright: © 2010 Secchiero et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Associazione Italiana per la Ricerca contro il Cancro (AIRC) tilskud og ved CariFe Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af at multimodalitet behandling, herunder kombination kemoterapi, strålebehandling, og target-monoklonale antistoffer, såsom rituximab, kan fremkalde høj remission i mange undertyper af non-Hodgkins lymfom (NHL), betydelige proportioner af patienterne tilbagefald med uhelbredelig sygdom. Således effektive behandlinger for NHL fortsat et alvorligt udækket behandlingsbehov, overvejer også at hyppigheden af ​​NHL fortsætter med at stige [1]. De mest udbredte former for NHL er B-celle-maligniteter, hvoraf follikulært lymfom (FL) og diffust storcellet B-celle lymfom (DLBCL) omfatter flertallet [2]. Burkitt lymfom er en mindre udbredte form for NHL kendetegnet ved translokation af c-myc-onkogen til Ig tung kæde promotor /enhancer region [3]. Akkumulere beviser har vist, at i lighed med faste tumorer, er det stromale celle komponent i NHL ikke dannet af uskyldige tilskuere i den neoplastiske proces, men det er sammensat af celletyper, der kan aktivt påvirke og fremmer væksten af ​​de tilstødende transformerede celler [4 ] – [9]. Men virkningen af ​​human knoglemarv (BM) mesenchymstamceller (MSC), der anses de stromale progenitor stamceller inden for BM, på væksten af ​​tumorceller er kontroversiel.

MSC sædvanligvis isoleret fra det vedhængende mononukleære brøkdel af BM aspirater, kan proliferere i mange passager i kultur og har flere egenskaber, der gør dem til et attraktivt valg som celle terapeutiske midler. Faktisk er de relativt ikke-immunogene, selvom mekanismen for deres immun privilegium ikke er velbeskrevet og er genstand for intens undersøgelse [10] – [12]. På grund af disse egenskaber, MSC udviser betydelig terapeutisk potentiale i degenerative sygdomme [13], [14]. På den anden side, med hensyn til deres potentielle terapeutiske anvendelse i neoplastiske sygdomme, har nogle undersøgelser antydet, at adoptivt overført MSC kunne favorisere tumor indpodning og progression

in vivo

[9], [12], [15]. De skadelige virkninger kan stamme fra forskellige MSC egenskaber. Faktisk MSC specifikt migrere mod steder med aktiv tumorigenese, hvor de kunne integrere den specialiserede tumor niche, bidrage til udviklingen af ​​tumorassocierede fibroblaster og myofibroblaster [16] – [18], stimulere angiogenese [18] – [20], og fremme væksten og lægemiddelresistens af både solide tumorer og hæmatologiske maligniteter [18], [21] – [26]

på dette grundlag i den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt virkningen af ​​BM-afledte MSC administration. i to modeller af dissemineret NHL, oprettet ved intraperitoneal (ip) injektion i nøgne-SCID-mus af EBV

– Burkitt-typen BJAB og EBV

+ B lymfoblastoide SKW6.4 cellelinjer, kendetegnet ved en indolent ( BJAB) og en aggressiv (SKW6.4) adfærd. I modsætning til vores forventning, fandt vi, at BM-MSC signifikant forlænget overlevelse lymfom bærende implanteret.

Resultater

Karakterisering af BJAB og SKW6.4 xenograftmodeller

SCID mus ip injiceret med et forudbestemt optimalt antal (2 x 10

6) af lymfom (BJAB eller SKW6.4) celler. BJAB xenotransplantater blev karakteriseret ved peritoneale tumorer, som begyndte at blive håndgribelig og målbar ved ekstern observation ved 18-20 dage efter injektion og stadige fremskridt indtil mus død (figur 1A). På den anden side, i SKW6.4 xenotransplantater, en tumorcelle masse var næppe håndgribelig enhver tid undersøgt punkt. Histopatologisk undersøgelse af de peritoneale masserne viste, at både BJAB- og SKW6.4-afledte tumorer har en solid vækstmønster af CD20

+ lymfoblastoide celler (figur 1A). Variabel formidling af CD20

+ lymfoblastoide celler blev observeret i lymfeknuder og milt, mens knoglemarv og nyrer var normalt upåvirket (figur 1B). Desuden har begge lymfom-bærende xenotransplantater, særlig SKW6.4 xenotransplantater, ofte udviste isoleret eller massiv infiltration af CD20

+ lymfoblastoide celler i leveren (figur 1B).

SCID-mus var i.p. injiceret med BJAB eller SKW6.4-celler (2 x 10

6). A, BJAB men ikke SKW6.4 xenotransplantater var præget af peritoneale tumorer målbare ved ekstern observation. Pil viser den ydre grænse af tumor masse. I mellemværker, makroskopisk udseende peritoneale masser og histologiske H er E og CD20 farvninger (original forstørrelse, 20 ×) vist. B, histopatologisk undersøgelse af necroptic vævssnit opnået fra SKW6.4 xenograft viser fraværende (nyre og knoglemarv), isoleret (pile; milt og lever) eller massive (lymfeknude og lever) infiltration af CD20

+ humane lymfoide celler. Original forstørrelse, 20 ×. C, Kaplan-Meier overlevelse analyse af NHL xenograftmodeller. Overlevelsen procentdel af mus injiceret med BJAB (n = 15) eller SKW6.4 (n = 15) celler blev målt fra den dag, lymfom celle injektion indtil dødsdagen. Asterisk,

s

. 0,01

Af note, på trods af de større peritoneal masserne i BJAB med hensyn til SKW6.4 xenograft mus, median overlevelse SKW6.4 xenotransplantater var signifikant (p 0,01) kortere (27 dage) sammenlignet med den af ​​BJAB xenografter (47 dage, figur 1C).

Injektion af BM-afledte MSC signifikant forlænger overlevelsen af ​​både BJAB og SKW6.4 implanteret

for at bestemme virkningen af ​​humane BM-MSC på overlevelsen af ​​lymfom xenografter, grupper af SCID-mus var ip injiceret med enten BJAB eller SKW6.4-celler, og efter 4 dage, med MSC på en lymphoma:MSC forhold på 10:01. En gruppe mus blev injiceret med MSC alene, som kontrol. Xenograft mus behandlet med BJAB + MSC og SKW6.4 + MSC viste en signifikant (p 0,01) stigning i overlevelse sammenlignet med den respektive BJAB (figur 2A) eller SKW6.4 (figur 2B) xenotransplantater. Notatet øge mængden af ​​indsprøjtet MSC til en lymphoma:MSC forhold på 2:01 ikke forbedre den samlede overlevelse BJAB xenografter (figur 2A). Endvidere i BJAB xenograft model, som tillod nøjagtig måling af tumormassen ved ekstern inspektion, fandt vi, at forbedringen i overlevelse blev modsvaret af en signifikant (p 0,05) forsinkelse af tumorvækst i mus injiceret med BJAB + MSC med hensyn til mus injiceret med BJAB alene (figur 2C).

SCID-mus var ip injiceret med enten BJAB (n = 10) eller SKW6.4 (n = 10) celler og, efter 4 dage, med MSC på en lymphoma:MSC forhold på 10:01. Som kontrol blev en gruppe mus (n = 10) injiceret med MSC alene. Kaplan-Meier analyse af NHL xenograftmodeller, der sammenligner overlevelse af mus injiceret med BJAB ± MSC (A) eller SKW6.4 ± MSC (B). I BJAB xenograft mus, resultater opnået i en gruppe mus (n = 10) injiceret med MSC på en lymphoma:MSC forhold på 02:01 er også vist (A). Overlevelsen procent blev målt fra den dag, lymfom celle injektion indtil dødsdagen. Asterisk,

s

0,05 i forhold til BJAB eller SKW mus. C, Peritoneale tumorer blev målt hver uge, indtil dyredødelighed, som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder section.Results er middelværdier ± SD. Asterisk,

s

. 0,05

histopatologisk undersøgelse af den tumorale væv fra xenograft SCID mus viste påfaldende distinkte egenskaber mellem peritoneale masser udviklet ved injektion med enten lymfomceller eller lymfomceller + MSC. Disse analyser blev det meste udført på BJAB xenograftmodel grund af større størrelse af masserne, men lignende histopatologiske karakteristika blev også observeret i SKW6.4 xenotransplantater. Som vist i figur 3A, BJAB tumorer udviste en solid vækstmønster med en upåfaldende stromal meshwork, bekræftet af Massons trichromfarvning, og få intra-tumor fartøjer, som påvist ved CD31 immunhistokemisk farvning, en histopatologisk situation, der minder om der blev observeret i de fleste af human NHL [27]. På den anden side, tumorale masse udviklet i mus co-injiceret med BJAB og MSC celler viste et helt andet aspekt, kendetegnet ved: områder med stromale broer blandet med BJAB cellelag, som klart dokumenteret af både H 0,05), der er koblet til apoptose induktion, når BJAB blev co-dyrket i nærværelse af MSC-celler, ved en lymphoma:MSC forhold af 10:01 (figur 4A). På den anden side, celle levedygtighed og apoptose niveauer af SKW6.4 kulturer, var fuldstændig upåvirket af tilstedeværelsen af ​​MSC (figur 4A). Desuden, med henblik på at sammenligne frigivelsen af ​​pro-angiogene cytokiner (tabel S1), udførte vi antistof-baserede protein array analyse af kultursupernatanter af: i) SKW6.4 lymfomceller, ii) MSC, iii) SKW6.4 /MSC samdyrket i direkte kontakt; iv) SKW6.4 /MSC samdyrket i Transwell-plader. Som forventet, MSC producerede signifikante niveauer af flere pro-angiogene cytokiner, hvoraf nogle (angiogenin, IL-8, CCL2 og VEGF) var signifikant opreguleret af den ledsagende tilstedeværelse af SKW6.4-celler (figur 4B). Både direkte og transwell lymfom /MSC co-kulturer var lige effektive til at fremme cytokinfrigørelse. Mængderne af IL-8 og VEGF blev yderligere målt ved ELISA (figur 4C), og resultaterne var i overensstemmelse med dem af proteinet array analyse (figur 4B). Som vist i figur 4C, bør det også bemærkes, at en signifikant (p 0,05) forøgelse af frigivelsen af ​​IL-8 og VEGF med hensyn til MSC alene, blev observeret både i MSC /SKW6.4 samt i MSC /BJAB co-kulturer.

BJAB og SKW6.4-celler blev dyrket i fravær eller nærvær af MSC, på en lymphoma:MSC forhold på 10:01. A, Efter 96 timers dyrkning blev lymfomcellen apoptose analyseret ved dobbelt Annexin V /PI-farvning. B, blev Kultursupernatanter høstet fra: SKW6.4 lymfomceller alene, cand.scient alene, SKW6.4 /MSc direkte co-kulturer og SKW6.4 /MSc Transwell co-kulturer. Frigivelsen af ​​pro-angiogene cytokiner blev vurderet i kultursupernatanterne ved hjælp af en proteom profiler menneskelig angiogenese array. Cirklerne på membranerne fremhæve fire cytokiner (angiogenin, IL-8, CCL2 og VEGF) frigivet af MSC, der er betydeligt opreguleret ved samtidig tilstedeværelse af SKW6.4 celler. Lignende resultater blev opnået fra tre uafhængige forsøg og resultater fra en af ​​dem er vist. Søjlediagrammet rapporterer resultaterne af de densitometriske analyser af membraner. Forkortelser af de analyserede cytokiner er defineret i tabel S1. Asterisk, p 0,05. C, Niveauer af IL-8 og VEGF blev målt i kultursupernatanterne af de angivne kulturer ved ELISA. Data er rapporteret som middelværdi ± SD af fire uafhængige forsøg, som hver blev udført in duplo. Asterisk, p. 0,01

MSC inducere migrering af endotelceller og fremme endotelceller apoptose ved direkte MSC /endotel kontakt celle

Da MSC frigive en cocktail af potent pro-angiogene faktorer [28] – [30], har vi undersøgte dernæst evnen hos MSC til at drive migration af endotelceller. Som vist i figur 5A, MSC-kulturer udøvede en potent (p 0,01) pro-migrerende aktivitet på endotelceller, som vurderet i Transwell assays. Baseret på disse observationer, i den sidste gruppe af forsøg har vi undersøgt virkningen af ​​en direkte interaktion mellem MSC og endotelceller. Til dette formål blev subkonfluerende HUVEC podet i plader med 6 brønde, og den følgende dag, MSC blev tilsat ved en endothelial cell:MSC forhold på 05:01. I et sæt forsøg, før tilsætning af MSC, blev HUVEC indlæses med carbocyaninfarvestoffer fluorichrome Dil [31], under hensyntagen til at Dil overførsel fra forskellige celletyper er blevet beskrevet. MSC /HUVEC o-kulturer blev derefter overvåget hver dag ved morfologisk undersøgelse (under et omvendt fasekontrast og fluorescens mikroskop) og kvantificering af den samlede fluorescens sammenlignet med kulturer af kun HUVEC (figur 5B). Som forventet, på dag 1, blev fluorescens begrænset til endotelceller, mens MSC var fuldstændig negative. Over tid vi observerede begivenheder af fluorescensfarvning diffus til MSC, hvilket indikerer, at MSC var fusioneret til den endotelcelle netværk (figur 5B). Parallelt hermed i MSC /HUVEC co-kulturer, vi dokumenteret en progressiv kollaps af endotelcelle-monolaget, med forekomsten af ​​døde endotelceller i nærheden MSC og en betydelig forøgelse af apoptotiske celler, kvantificeret ved Annexin-V /PI dobbelt farvning ( Figur 5B-C). Desværre, i disse sæt af eksperimenter, vi var ude af stand til at udføre trepartsaftaler eksperimenter med tilføjelse også lymfomceller af tekniske problemer primært på grund af forskelle i kultur medier krav.

I A, blev HUVEC migration vurderet i transwell plader mod MSC, podet (72 timer før) i det nedre kammer i Transwell-plader, vs kontrolmedium. 10 × forstørrelse fotografier af repræsentative farvede filtre er vist; mørkere områder skyldes højere celletæthed. Det gennemsnitlige antal migrerende celler pr blev vurderet ved at tælle mindst fire high-power tilfældige felter pr filter. Resultaterne er gennemsnit ± SD fra tre forsøg hver udført i dobbeltbestemmelse. I B og C blev subkonfluerende HUVEC podet i fravær eller nærvær af MSC (endotel cell:MSC forholdet 05:01). Billeder efter fluorescens og fasekontrastmikroskopi viser det betydelige fald i endothelial celledensitet ved tilsætning af MSC til kulturerne. B, Repræsentative billeder, der viser røde Dil-mærkede endotelceller, som de vises i HUVEC kulturer (indsat), og MSC, der erhverver farvningen efter 4 dages co-kulturer med mærket HUVEC. Original forstørrelse 20 ×. Samlet kultur fluorescens af HUVEC og HUVEC + MSC blev kvantificeret med en fluorescenspladelæser. C, er tilstedeværelsen af ​​døde celler i repræsentative billeder ved fasekontrast mikroskopi angivet med en asterisk. Original forstørrelse 20 ×. Samlet celle apoptose blev vurderet ved Annexin V /PI-farvning. Data i B og C er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg, som hver blev udført in duplo. Asterisck,

s

. 0,05

Diskussion

Forrige

in vivo

studier har evalueret effekten af ​​MSC i dyremodeller af hæmatologiske maligniteter begrænset i subkutane gel udstyr [14], [15], [32]. Under hensyntagen til, at størstedelen af ​​NHL hovedsageligt forløber som en systemisk malignitet, i denne undersøgelse har vi udviklet og beskrevet to dyremodeller, der tillod os at undersøge aktiviteten af ​​MSC mod NHL i xenografter bærer disseminerede tumorer. Ja, efter i.p. injektion, maligne BJAB og SKW6.4 lymfomceller dannede tumor masserne, med hyppig formidling til leveren og abdominale lymfeknuder.

Den største fund af denne undersøgelse er, at en enkelt MSC injektion på MSC:tumor celle forholdet så lavt som 01:10, signifikant forlænget overlevelse hos dyr med indolent (BJAB) og aggressive (SKW6.4) lymfomer. Denne observation var særlig opmuntrende, da det blev opnået i formidles NHL bærer xenografter, at efter vores opfattelse, er mere relevant end de subkutane NHL-modeller ansat i tidligere undersøgelser [14], [15], [32]. Af note, øge antallet af MSC, indtil MSC:tumor celle-forhold på 1:02, resulterede ikke i en signifikant forbedring af den terapeutiske effektivitet af MSC. Injektionen af ​​MSC forsinket udviklingen af ​​de peritoneale tumorale masserne af NHL xenotransplantater, og ved necroscopic analyse, tumorprøver udviklet i fravær eller nærvær af MSC viste signifikant histologiske forskelle, som kan sammenfattet som følger: mens BJAB- og /eller SKW6.4-afledte peritoneale masserne viste den typiske svage kapillære netværk også beskrevet i human NHL [27], tilstedeværelsen af ​​MSC fremmet en diffus stigning i α-SMA

+ celle inkorporering i hele det stromale rum ved varians af den begrænsede SMA

+ perivaskulær mønster overvejende observeret i fravær af MSC. Desuden blev massive områder af intratumoral nekrose fortrinsvis observeret i lymfom + MSC injicerede dyr og sandsynligvis konto for de reducerede tumormasserne karakteriserer disse mus med hensyn til dyr injiceret med lymfom celler alene.

I forsøget på at belyse mekanismen (e), hvorved MSC udøve anti-lymfom aktivitet

in vivo

, vi har udført en række

in vitro

eksperimenter i co-kultur systemer. Resultaterne stammer fra disse forsøg har tendens til at udelukke en væsentlig direkte cytotoksisk effekt af MSC på lymfomceller, da MSC moderat hæmmede levedygtighed BJAB men ikke udviser nogen mærkbar virkning på SKW6.4 celleoverlevelse /vækst. Af interesse, evnen hos MSC kulturer af secernere høje niveauer af angiogene cytokiner, såsom VEGF, IL-8, angiogenin og CCL2, var signifikant (p 0,01) forøget ved den samtidige tilstedeværelse af lymfomceller. Konsekvent med deres evne til release flere pro-angiogene cytokiner, MSC kraftigt fremmet migration af endotelceller i Transwell analyser. Men når MSC var direkte co-dyrket med endotelceller, observerede vi en signifikant induktion af endotelcelle apoptose. I denne henseende, vores nuværende resultater er i overensstemmelse med de andre Forfattere, der har vist, at MSC under visse omstændigheder kan udøve anti-angiogene aktivitet i stærkt vaskulariserede Kaposi sarkomer [33], samt i normale endotel cellekulturer

i vitro

[34]. Selv om vi ikke var i stand til at dokumentere relevansen af ​​disse

in vitro

data i vores dyremodeller, vores resultater tyder eksistensen af ​​et komplekst samspil mellem MSC, lymfomceller og endotelceller, kendetegnet ved: i) en betydeligt udslip af pro-angiogeniske /pro-migrerende cytokiner efter MSC, som forstærkes af tilstedeværelsen af ​​lymfomceller; ii) en potent kemotaktisk aktivitet af MSC på endotelceller, efterfulgt af en cytotoksisk aktivitet af MSC på endotelceller, hvilket krævede MSC /endotelcelle kontakt.

Vi er også klar over, at ekstrapolering af en given dyremodel til klinisk relevante situationer bør overvejes med ekstrem forsigtighed. Især bør vi huske, at en vigtig begrænsning af vores undersøgelse er repræsenteret ved den omstændighed, at den antitumorale immunrespons er ikke værdifuldt i vores SCID model, men sandsynligt er det vigtigt i den samlede effekt af MSC på tumorvækst. Faktisk er det blevet vist, at den immunosuppressive virkning af MSC kan begunstige tumorvækst i allogene dyr [12]. Selv om nogle kontroversielle data er til stede på den rolle, MSC i udvikling og /eller terapi [35] kræft, [36], flere nye konklusioner kan sammenfattes fra vores undersøgelse: i)

in vitro

vekselvirkning af BM -afledt MSC og lymfomceller dårligt forudsiger

in vivo

effekt af MSC på overlevelsen af ​​xenograft bærende dyr; ii) MSC signifikant modulere stromale netværk af lymfomer

in vivo

, ved at øge antallet af α-SMA-positive celler og inducere en forøgelse af intra- nekrose; iii) MSC fremme endothelcellemigration

in vitro

efterfulgt af endothelial celledød på MSC /endotel direkte celle kontakt.

Materialer og metoder

Celler

SKW6.4 og BJAB cellelinier blev opnået fra DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Tyskland) eller købt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i RPMI-1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco BRL, Gaithersbrg, MD). Human BM-afledte MSC og humane navlestrengsveneendotelceller (HUVEC) blev indkøbt fra Lonza (Walkersville, MD). BM-MSC blev rutinemæssigt dyrket i MSC-vækstmedium (MSC-GM, Lonza). HUVEC blev dyrket på 0,2% gelatine-belagte vævskulturplader i M199 endotelvækstfaktor medium suppleret med 20% FBS, 10 mg /ml heparin og 50 mg /ml ECGF (alle fra Lonza) som tidligere beskrevet [37]. I alle eksperimenter blev MSC og HUVEC anvendes mellem 3

rd og 6

th passage

in vitro.

NHL mus xenograftmodeller

Female CB -17 SCID-mus (4 uger gamle) blev opnået fra Charles River Laboratories (Hollister, CA) og blev opretholdt i overensstemmelse med vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Musene blev opstaldet i mikro-isolator bure med fri adgang til mad og vand. De procedurer, der involverer dyr og deres pleje blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af Institutional Animal Care udvalget ved universitetet i Trieste (godkendelsesnummer italienske sundhedsministerium 191 /2008-D). Især blev enhver indsats lagt på at undgå unødig smerte af dyrene. SKW6.4 eller BJAB (2 × 10

6) celler blev høstet, suspenderet i PBS, og i.p. injiceret i 6 uger gamle mus. Efter 4 dage blev lymfom xenograft mus randomiseret i grupper (mindst 10 mus i hver gruppe), og doseres i.p. med køretøjet (PBS) eller MSC (2 × 10

5 eller 1 × 10

6, svarende til en lymphoma:MSC forhold på 10:01 og 02:01 hhv). I en gruppe af SKW6.4 mus (n = 10), blev MSC injiceret ved 12 dage efter SKW6.4 injektion.

Dyr blev monitoreret dagligt for ændringer i vægt, bivirkninger ved behandlingen eller tegn på nogen sygdom. Tumorvækst bestemtes ved kaliber målinger af to ortogonale akser og tumorvolumenet blev beregnet ved formlen: (π /6) ×

en

2 ×

b

, hvor

en

er den kortere og

b

er den længere akse; tumoren densitet blev antaget at være lig med en. Overlevelse blev beregnet som varigheden af ​​dyrets levetid fra podning af lymfomceller indtil døden. Obduktion blev udført for at bestemme makroskopisk omfang og histologiske karakteristika for de peritoneale masser. Desuden store organer, herunder hjerte, nyrer, lårbenet (for knoglemarv), lever, milt, lymfeknuder blev høstet til mikroskopisk undersøgelse og vurdere mønstret for formidling af transplantation.

Histopatologisk og immunophenotypical analyse

Animal prøver blev fikseret i 10% pufret-formalinopløsning og indlejret i paraffin. For morfologisk analyse blev 4-um-tykke snit skæres fra paraffinblokke og farvet med hematoxylin-eosin. Immunhistokemi blev udført ved hjælp af streptavidin-biotin-peroxidase-kompleks fremgangsmåde under anvendelse af de følgende primære mAb’er til: CD20, α-SMA og CD31 (Dako, Glostrup, Danmark). 3-3’diaminobenzidine blev anvendt som et chromogen (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Til bestemmelse af kollagen indhold blev sektionerne farvet med Masson trichrom. Efter farvninger blev objektglassene undersøgt under et Leica DM2000 optisk mikroskop og mikrofotografier blev taget med et Leica DFC320 digitalkamera.

Co-kultur eksperimenter

For lymfom /MSC co-kultur

in vitro

eksperimenter blev MSC podet i 6 brønde plader og den følgende dag, enten BJAB eller SKW6.4-celler blev tilsat til MSC kulturer på en lymphoma:MSC forhold på 10:01. Co-kulturer blev udført i op 96 timer, i lymfom cellemedium. I nogle eksperimenter blev co-kulturer udføres ved anvendelse 24-Transwell-plader (3,0 um, porestørrelse; Corning Costar, Cambridge, MA), med MSC podet i det nedre rum og lymfomceller tilføjet i det øvre rum

i endotel /MSC co-kulturer blev HUVEC podet i plader med 6 brønde og den følgende dag, MSC tilsat ved en HUVEC:MSC forhold på 05:01. Co-kulturer blev udført i op 5 dage i HUVEC-medium. I nogle forsøg før tilsætning af MSC, blev HUVEC indlæses med carbocyaninfarvestoffer fluorochrom Dii (1,1’dioctadecyl-3,3,3 ‘, 3’tetramethylindocarbocyanine perchlorat; Molecular Probes, Invitrogen, Merelbeke, Belgien). Dil er en lipofil molekyle, der inkorporerer i cellemembranen, og har følgende spektrale karakteristika: absorptionsmaksimum ved 549 nm og en maksimal emission ved 565 nm. Til dette formål blev HUVEC inkuberet med 50 pg /ml Dii i 2 timer før udførelse MSC: endotelcelle co-kulturer. Morfologi af HUVEC kulturer og HUVEC /MSC co-kulturer blev observeret periodisk i tid under en omvendt fasekontrast og fluorescens mikroskop og den samlede fluorescens blev kvantificeret med en fluorescenspladelæser.

Apoptose assay

til analyse af apoptose blev celler dobbelt farvet med Annexin V-fluoresceinisothiocyanat (Alexis Biochemicals, Lausen, Schweiz) og propidiumiodid (PI), i henhold til producentens anvisninger og analyseret under anvendelse af et FACScan flowcytometer (Becton-Dickinson , San Jose, CA), som tidligere beskrevet [38]. For at undgå ikke-specifik fluorescens fra døde celler blev levende celler gated stramt under anvendelse af fremadrettet og sidespredning. Især for HUVEC og MSC /HUVEC-kulturer, til at analysere graden af ​​apoptose i hele cellepopulationen, blev substrat-bundet celler høstet ved trypsinbehandling og puljet med flydende celler til farvningen.

Proteome profiler matrix og enzymbundne immunsorbent assays

Kultursupernatanter blev analyseret ved hjælp af proteom profiler human angiogenese array (R & D Systems, Minneapolis, MN), ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev lige store mængder af kultursupernatanter fortyndet og blandet med en cocktail af biotinylerede angiogenese-detektionsantistoffer og inkuberet med (capture) antistof-membraner natten over ved 4 ° C. Efter vask af ubundet materiale blev membranerne inkuberet med HRP-konjugeret streptavidin. Kemiluminescens blev anvendt til signaldetektering. Farvning intensiteten af ​​prikker blev bestemt med ImageQuant software (Molecular Dynamics) og udtrykt som arbitrære enheder.

enzymmaerket analyser (ELISA) for IL-8 og VEGF analyser blev udført af anvendelse af kommercielt tilgængelige ELISA-kits (R & D Systems). Assays blev udført in duplo, og ifølge producentens anvisninger. Resultater blev aflæst ved en optisk densitet på 450 nm med en Anthos 2010 ELISA-læser (Anthos Labtec Instruments, Wals Salzburg, Østrig).

endothelcellemigration assay

Cell migration assay blev udført i 24 -Nå Transwell-plader (8,0 um, porestørrelse) som tidligere beskrevet [39]. MSC blev podet i HUVEC dyrkningsmedium ind i det nedre kammer i transwell-plader, og efter 72 timer, 0,25 × 10

5 HUVEC per brønd blev tilsat til de bedste kamre i 100 pi medium.