PLoS ONE: Plasma microRNA’er, miR-223, miR-21 og miR-218, som nye potentielle Biomarkører for Gastric Cancer Detection

Abstrakt

Baggrund

MikroRNA’er (miRNA), endogene små ikke-kodende RNA, stabilt påvist i human plasma. Tidlig diagnose af gastrisk cancer (GC) er meget vigtigt at forbedre terapi virkning og forlænge overlevelsen af ​​patienter. Vi havde til formål at identificere, om fire miRNA (miR-223, MIR-21, miR-218 og MIR-25) tæt forbundet med tumorgenese eller metastase af GC kan tjene som nye potentielle biomarkører til GC detektion.

Metode

Vi målte oprindeligt plasmaniveauerne af de fire miRNA i 10 GC-patienter og 10 raske kontrolpersoner med kvantitativ revers transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR), og derefter sammenlignet plasma miRNA resultater med udtrykkene i kræft væv fra otte GC patienter. Endelig blev tilstedeværelsen af ​​miR-223, miR-21 og miR-218 i plasmaet valideret i 60 GC-patienter og 60 raske kontrolpersoner, og områder under modtageren opererer karakteristiske (ROC) kurver af disse miRNA blev analyseret.

Resultater

Vi fandt, at plasmaniveauerne af miR-223 (

P

0,001) og miR-21 (

P

0,001) var signifikant højere i GC patienter end hos raske kontroller, mens mIR-218 (

P

0,001) var signifikant lavere. ROC analyser givet AUC værdier på 0,9089 for miR-223, 0,7944 for miR-21 og 0,7432 for miR-218, og kombineret ROC analyse afslørede den højeste AUC værdi på 0,9531 i at diskriminere GC patienter fra raske kontroller. Desuden plasmaniveauerne af miR-223 (

P

0,001) og miR-21 (

P

= 0,003) var signifikant højere i GC patienter med stadium I end hos raske kontroller. Desuden plasmaniveauerne af miR-223 var signifikant højere i GC patienter med

Helicobacter pylori

(Hp) infektion end dem uden (

P

= 0,014), og signifikant højere hos raske kontrolpersoner med Hp-infektion end dem uden (

P

= 0,016).

konklusioner

Plasma miR-223, miR-21 og miR-218 er nye potentielle biomarkører for GC detektion .

Henvisning: Li Bs, Zhao yl, Guo G, Li W, Zhu Ed, Luo X, et al. (2012) Plasma microRNA’er, miR-223, miR-21 og miR-218, som nye potentielle Biomarkører for Gastric Cancer Detection. PLoS ONE 7 (7): e41629. doi: 10,1371 /journal.pone.0041629

Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, USA

Modtaget: December 21, 2011; Accepteret: 27. juni, 2012; Udgivet: 30 Jul 2012

Copyright: © Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Natural Science Foundation of China (NSFC, nr 81.071.412). De finansieringskilder havde rolle i dataindsamling og analyse, men ikke rolle i studie design, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den fjerde mest almindelige malignitet i verden og den næststørste årsag til kræft død hos begge køn i hele verden. De højeste dødelighed er estimeret i Østasien [1]. Den 5-årige overlevelsesrate for mavekræft er mindre end 20% -25% i USA, Europa og Kina [2]. Øjeblikket, komplet kirurgisk resektion er den mest effektive behandling, der tilbyder en fremragende (90%) chance for en kur for patienter med tidlig gastrisk cancer [3]. For avanceret gastrisk cancer, trods kurativ kirurgi, omkring 80% af patienterne dør inden for kort tid fra locoregional tilbagefald (87%) og /eller fjernt metastase (30%) [4]. Derfor forbedring i tidlig diagnose kan øge chancen for en kur i tidlige GC patienter eller forlænge overlevelsen af ​​patienter med tidlige fase GC. Men de fleste debuterende GC’er er vanskelige at opdage [5]. De konventionelle serum markører for GC, såsom kulhydrat antigen 19-9 (CA19-9) og carcinoembryonisk antigen (CEA), mangel tilstrækkelig følsomhed og specificitet for at lette tidlig påvisning.

MikroRNA’er (miRNA) er små, ikke kodende RNA, der posttranscriptionally regulerer genekspression. Afvigende ekspression af miRNA er blevet korreleret med flere sygdomme, herunder cancere [6]. Tidligere undersøgelser har indikeret, at væv miRNA udtryk profiler kan betragtes som diagnostiske biomarkører i kræft [7] – [9]. Imidlertid er denne diagnostiske metode begrænset i sin virkning som vævsprøver er ikke praktisk at få adgang til og er invasiv at opnå. Et stigende antal papirer rapporterer, at cirkulerende miRNA stabilt detekteres i forskellige kropsvæsker, herunder serum og plasma [10], [11]. Cirkulerende miRNA som nye stabile biomarkører ville være en af ​​de mest lovende middel til diagnose, fordi plasma og serum er nemme at få adgang til og noninvasiv at opnå. For nylig er der blevet identificeret flere lovende serum eller plasma miRNA-biomarkører for GC detektion [12], [13].

At udforske den roman plasma miRNA signaturer kan skelne patienter med GC (især den tidlige fase GC) fra raske kontroller, udvalgte vi fire miRNA (MIR-223, miR-218, MIR-25 og MIR-21), som var blevet indberettet som ofte dysreguleret i GC væv og tæt korreleret med tumorgenese eller metastase af GC [14] – [21] . Vi formodede, at plasmaniveauerne af de tre miRNA (miR-223, miR-218 og MIR-25) var afvigende i GC patienter samt de af miR-21, som foreslog, at denne signatur kan tjene som en biomarkør for GC detektion [12]. Imidlertid har plasmaniveauerne af MIR-21 i GC patienter på forskellige stadier TNM ikke blevet identificeret. I denne undersøgelse, vi sammenlignet plasmaniveauerne af de fire miRNA i GC patienter til raske kontrolpersoner, og vurderet mulighederne for de fire miRNA som nye invasive biomarkører for GC detektion.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

Alle prøver blev indsamlet fra samtykkende individer ifølge protokollerne er godkendt af den etiske Review Board på Third Military Medical University. I alt blev 70 patienter med GC før eventuelle behandlinger og 70 raske kontrolpersoner fra Southwest Hospital (Chongqing, Kina) inkluderet i vores studie mellem 2010 og 2011. For de 70 GC patienter, vi analyserede histologi af GC væv, herunder 56 adenocarcinom, 13 mucinøs adenocarcinom og en Signet-ring celle karcinom, og bestemt tumor steder, herunder 34 i Gastric krop, 24 i Gastric antrum, 8 i Gastric Cardia og 4 i andre (Upper mave, Gastric vinkel, Gastric stump). De GC patienter blev klassificeret i henhold til de kliniske TNM stadier, herunder 12 trin I (median alder, 53 år [interval, 36-70 år] 8 mandlige, 4 kvinder), 11 fase II (median alder, 61 år [interval, 36-77 år] 7 mænd, 4 kvinder), 36 fase III (median alder, 55 år [interval, 30-71 år] 26 mænd, 10 kvinder), og 11 fase IV (median alder, 53 år [interval , 46-66 år]; 9 mandlige, 2 kvindelige) .Den status af Hp-infektion blev testet ved hjælp af anti-HP antistoffer ELISA Diagnostic Kits (S20010005), (BEIJING BEIER Bioteknik CO, LTD), som viser 43 GC patienter med Hp-infektion. og 27 uden. For de 70 raske kontrolpersoner, blev 44 mandlige og 26 kvindelige inkluderet, og den mediane alder var 51 år [range, 26-75 år]. Resultaterne af Hp-infektion test viste 31 raske kontrolpersoner med Hp-infektion og 39 uden. (Tabel 1).

Cellefri plasma blev isoleret fra alle blodprøver inden 2 timer for indsamling under anvendelse af en totrins-protokol (1.500 rpm i 10 min, 12.000 rpm i 2 min) for at forhindre forurening med cellulære nukleinsyrer. Plasma blev overført til et frisk rør, hvilket efterlader en fast højde på 0,5 cm plasma supernatant over pelleten at undgå at forstyrre pelleten [11]. Det blev opbevaret ved -80 ° C i 450 pi prøver. Otte par vævsprøver blev indsamlet fra otte GC patienter med højere plasma MIR-223 og MIR-21, og lavere niveauer af plasma MIR-218 end raske kontroller efter kirurgisk resektion, og ca. skåret til 1 mm kvadrater og straks frosset i flydende nitrogen.

RNA Extraction

Totale RNA’er blev ekstraheret fra 400 pi plasma under anvendelse af Mirvana PARIS Kit (Ambion) ifølge producentens protokol, og elueret med 105 pi forvarmet ( 95 ° C) elueringsopløsning. For at give mulighed for en normalisering af variation prøve-til-prøve i RNA isolation trin, 10 pi 0,05 pM syntetisk

C. elegans

MIR-39 (syntetisk RNA oligonucleotider syntetiseret ved GenePharma) blev tilsat til hver denatureret prøve efter at kombinere plasmaprøven med denaturerende opløsning [11]. For de frosne væv blev totalt RNA ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens protokol, og til sidst resuspenderet i 60 pi forvarmet (95 ° C) nuklease-frit vand.

Quantitative reverse transkriptase polymerasekædereaktion (QRT-PCR)

revers transcription reaktion blev udført under anvendelse af et Taqman MicroRNA Reverse transcription Kit (Applied Biosystems). cDNA blev syntetiseret i 5 pi volumener indeholdende 1,67 pi RNA-ekstrakt, 0,5 pi af 10 × revers transkription puffer, 0,05 pi 100 mM dNTP’er, 0,063 pi RNase Inhibitor (20 U il

-1), 0,33 pi Mutiscribe omvendt transkriptase (50 U il

-1), 0,5 pi gen-specifik primer og 1.887 pi nuclease-frit vand. Reaktionerne blev inkuberet ved 16 ° C i 30 minutter, efterfulgt af 42 ° C i 30 minutter, derefter 85 ° C i 5 minutter, inden de blev holdt ved 4 ° C. Det syntetiserede cDNA blev fortyndet 2 gange ved nuklear-frit vand. Kvantitative PCR-reaktioner blev udført ved anvendelse af 2 pi cDNA-opløsning, 5 pi TaqMan 2 × Perfekt Master Mix (Takara), 0,25 pi genspecifikke primere /probe (TaqMan® miRNA tests, Applied Biosystems. Tabel S1) og 2,75 pi af nuclease-frit vand i et slutvolumen på 10 pi, og køre på en Bio-Rad IQ5 (Bio-Rad Laboratories, Inc) thermocycler. Reaktionsblandingerne blev inkuberet ved 95 ° C i 2 min, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 30 s. Tærsklen cyklus (

C

t) værdier blev beregnet med Bio-Rad iQ5 2.1 Standard Edition Optical System Software 2.1.94.0617.

plasma miRNA-koncentrationer blev beregnet ved hjælp af en standard kurve konstrueres ved anvendelse af syntetiske miRNA [22]. Standardreferencepunkterne miRNA blev forstærket for hver reaktion. Imidlertid blev ekspressionen af ​​miRNA fra vævsprøver normaliseret ved hjælp af 2

-ΔΔ

C

t metode fra

C

t-værdier for miRNA af interesse i forhold til RNU6B.

Normalisering af Experimental QRT-PCR data fra plasma ved hjælp af syntetisk C. elegans miR-39

C. elegans

MIR-39, som mangler sekvens homologi til humane miRNA, blev udvalgt til at normalisere de eksperimentelle QRT-PCR data. Kendte mængder af syntetisk

C. elegans

miR-39 blev fortyndet til at producere

C

t-værdier inden for

C

t værdiintervaller af miRNA-standard kurver. Vi empirisk tilsat 10 pi 0,05 pM syntetisk

C. elegans

MIR-39 til 400 pi plasma efter at kombinere plasmaprøven med denaturerende opløsning.

C. elegans

MIR-39 blev amplificeret samt andre miRNA. Følgende formel blev brugt til justering af

C

t-værdier af miRNA (MIR-223, MIR-21, miR-218 og MIR-25) i alle plasmaprøver: Normalized_

C

t værdi for miRNA i prøven = Raw_

C

t-værdi – [(SpikeIn_ Average_

C

t-værdi for den givne prøve) – (Median_ SpikeIn_

C

t)] [11]. Den normalized_

C

t-værdi blev derefter anvendt til at beregne koncentrationen af ​​hvert miRNA.

Statistisk analyse

Mann-Whitney-test blev anvendt for at sammenligne forskellene i plasma miRNA koncentrationer og de miRNA forhold mellem kræft gruppen og sunde gruppe. En to-sidet χ

2 test blev anvendt til at sammenligne forskellene i køn, alder eller Hp-infektion status mellem GC patienter og raske kontroller. ANOVA-test blev anvendt til at analysere forholdet mellem niveauerne af MIR-223, MIR-21, MIR-218 og TNM stadier. Modtager-drift karakteristiske (ROC) kurver og arealet under ROC-kurven (AUC) blev anvendt til at vurdere mulighederne for at anvende plasmaniveauer af miRNA som diagnostiske værktøjer til påvisning GC. Den Youden indeks bruges til at vælge de optimale cutoff værdier. En

P

værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 13.0 software og grafer blev genereret ved hjælp af GraphPad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc., Caligornia).

Resultater

Karakteriserer af Emner

Et hundrede og fyrre emner, herunder 70 GC patienter og 70 raske kontrolpersoner, blev rekrutteret i denne undersøgelse. Der blev ikke fundet signifikante forskelle i køn eller alder mellem GC patienter og raske kontroller (

P

= 0,371,

P

= 0,398, χ

2 test, henholdsvis). Hp-infektion status var signifikant forskellig mellem GC patienter og raske kontroller (

P

= 0,042) (tabel 1).

Evaluering af kvantitativ RT-PCR til måling af miRNA i plasma

for at definere det dynamiske område og følsomhed af miRNA kvantificering af real-time PCR, de syntetiske enkeltstrengede miRNA blev seriefortyndet 10 gange fra koncentrationer på 0,1 til 0,000001 fmol for miR-223, miR-218, miR- 25, og miR-21 på anbefaling af GenePharma miRNA reference Panel. Den linearitet kvantitativ RT-PCR mellem de logaritmiske værdier af input miRNA og

C

t-værdier blev bekræftet for hver syntetisk miRNA, miR-223, miR-218, miR-25 og miR -21 (R

2 = 0,997, R

2 = 0,998, R

2 = 0,993 og R

2 = 0,999, henholdsvis) (Figur 1).

TEN fold seriefortynding af syntetisk miRNA blev anvendt til at generere standardkurver. Linearitet blev bekræftet i disse koncentrationer for MIR-21, MIR-223, MIR-218 og MIR-25 området fra 0,1 til 0,000001 fmol. (

miR-21

: y = -3.337x + 14,77 (R

2 = 0,999);

miR-223

: y = -3.121x + 17,37 (R

2 = 0,997);

miR-218

: y = -3.071x + 17,79 (R

2 = 0,998);

miR-25

: y = -3.114x + 17,47 ( R

2 = 0,993)).

Indledende Screening af Plasma-miRNA som kan overvåge GC

Fire miRNA, MIR-223, mir-218, MIR-25 og MIR -21, blev udtrykkes afvigende i GC væv. For at undersøge om niveauerne af fire miRNA foreliggende dysregulering i plasma fra patienter med GC, vi oprindeligt målt plasmaniveauerne af de fire miRNA i 10 GC-patienter og 10 raske kontroller. Som forventet, plasmaniveauerne af miR-223 og miR-21 var signifikant højere i GC patienter end hos raske kontroller (

P

0,001), hvorimod miR-218 var signifikant lavere (

P

0,001). Men plasmaniveauerne af miR-25 var ikke signifikant forskellig mellem GC patienter og raske kontroller (

P

= 0,970) (Figur 2 (A-D)). Det er blevet rapporteret, at niveauerne af miR-21 i GC plasma kunne afspejle dem i den primære GC væv [12]. For at undersøge om niveauerne af tre miRNA (MIR-223, MIR-218 og MIR-21) i GC plasma kan afspejle dem i primær GC væv, testede vi niveauerne af de tre miRNA i otte par GC væv og tilstødende normalt væv prøver fra de 8 GC patienter, hvis plasma niveauer af mIR-223, mIR-21 var signifikant højere, og mIR-218 var betydeligt lavere. Som vist i figur 2E, ekspressionsniveauerne af miR-223 var højere i primære GC væv end i kontrollerne i syv af de otte patienter analyseret (87,5%) og miR-21 i otte patienter (100%), hvorimod miR-218 var lavere i syv patienter (87,5%), hvilket tyder på, at niveauet af disse tre miRNA i GC plasma afspejler dem i den primære GC væv.

Scatter dot plots af plasmaniveauerne af fire miRNA i mavecancerpatienter (GC, n = 10) og raske kontrol (NC, n = 10). Scatter dot plots viser plasmaniveauerne af

miR-223 Hotel (A),

miR-21 Hotel (B),

miR-218 Hotel (C) og

mIR-25

(D). Linjerne i scatter dot plots betegne medianerne. (E) Bars af ekspressionsniveauerne af miR-223, miR-21 og miR-218 i ubearbejdet GC væv og parret normalt væv. Ekspressionsniveauerne af MIR-223 var højere i primære GC væv i syv af de otte patienter analyseres (87,5%) og MIR-21 i otte patienter (100%), hvorimod MIR-218 var lavere i syv patienter (87,5%) end i parrede normale væv. Alle analyser blev gentaget tre gange i dubletter.

plasmaniveauerne af miR-223, miR-21, miR-218 og miR-25 blev valideret i Large Scale

For at evaluere plasmaniveauerne af ovennævnte fire miRNA som diagnostiske markører for GC afsløring, yderligere 60 GC patienter og 60 raske kontrolpersoner blev tilsat i denne validering assay. Som vist i figur 3, niveauerne af MIR-223 og MIR-21 var signifikant højere i GC plasma end i kontrol (

P

0,001), mens MIR-218 var signifikant lavere (

P

0,001). Men plasmaniveauerne af miR-25 var ikke signifikant forskellig mellem GC patienter og raske kontroller (

P

= 0,082) (Figur S1). De koncentrationsgrænser værdier af de fire miRNA målt i plasmaet hos individer blev vist i tabel S2. ROC kurve analyser blev udført for at evaluere den diagnostiske værdi for de tre plasma miRNA og viste, at de tre plasma miRNA var værdifulde biomarkører til at skelne GC fra normale kontroller med AUC (områder under ROC-kurven) på 0,9089 (95% CI: ,8598-0,9580 ) for miR-223, 0,7944 (95% CI: 0,7211 til 0,8677) for miR-21 og 0,7432 (95% CI: 0,6628 til 0,8236) for miR-218. Ved den optimale cutoff værdi på 0,7286 med værdien af ​​følsomheden + specificitet-1 anses for at være maksimal for MIR-223, følsomheden og specificiteten var 84.29% og 88,57%; ved cutoff-værdien af ​​0,5000 for MIR-21, følsomheden og specificiteten var 74,29% og 75,71%, og ved afskæring på 0,3858 for MIR-218, følsomheden og specificiteten var 94.29% og 44.29%. At løfte diagnose værdi, analyser kombinationen ROC-kurve blev udført ved (MIR-223 multipliceret med MIR-21) divideret med MIR-218. Forholdet mellem (MIR-223 × MIR-21) /MIR-218 gav det højeste AUC værdi på 0,9531 (95% CI: 0,9222-0,9839) og det optimale cutoff værdi på 0,7715, følsomheden og specificiteten var 84.29% og 92,86% , hvilket indikerede, at kombinationen signatur har en stærk potentiel diagnose værdi for GC detektion.

Box plots viser plasmakoncentrationen af ​​miR-223 (a), miR-21 (B), miR-218 (C) og (mIR-223 × mIR-21) /mIR-218 (D) i GC patienter (GC, n = 70) og raske kontroller (NC, n = 70). Linjerne inde kasserne betegne medianerne. De whiskers af kassediagrammer: Min til Max. Grafer af receiver driftsegenskaber (ROC) kurve viser arealet under kurverne (AUC) af miR-223 (E), miR-21 (F), miR-218 (G) og (miR-223 × miR-21) /miR-218 (H) for at adskille GC patienter fra raske kontrolpersoner. Intervallet mellem 5

th og 95

th percentiler betegner konfidensniveau og rapporten resultaterne viser som Fraction. Alle analyser blev gentaget tre gange i dubletter.

plasmaniveauerne af miR-223, miR-218 og miR-21 i GC Patienter med forskellig klinisk status

plasmaniveauerne for disse tre miRNA i GC patienter på forskellige TNM stadier (12 med i, 11 med II, 36 med III eller 11 med IV) blev analyseret for at bestemme, om de tre plasma miRNA kan opdage tidlige fase GC. Som vist i figur 4A, plasmaniveauerne af de tre miRNA var ikke signifikant forskellige på tværs af fire faser (MIR-223,

P

= 0,244; miR-218,

P

= 0,664; miR -21,

P

= 0,596), men hver af de fire faser, herunder fase i-patienter havde signifikant forhøjede plasma miR-223 og miR-21 sammenlignet med de raske kontroller (P 0,01), og miR -218 blev signifikant nedsat i fase II, III og IV (

P

0,01), hvorimod miR-218 var ikke signifikant forskellige mellem trin i patienter og raske kontroller (

P

= 0,071). Endvidere sammenlignede vi niveauerne af de tre miRNA i plasma fra GC patienter med metastase til dem uden. Som vist i figur 4B, plasmaniveauerne af de tre miRNA havde nogen signifikante forskelle mellem GC patienter med metastaser og dem uden (miR-223,

P

= 0,320; miR-218,

P

= 0,979;. miR-21,

P

= 0,310)

(A) Box plots af plasmakoncentrationen af ​​miR-223 (venstre panel), miR-21 (midterste panel ) og mIR-218 (højre panel) i raske kontroller (NC, n = 70) og gastrisk cancer (GC, n = 70) patienter på forskellige TNM stadier (12 med i, 11 med II, 36 med III og 11 med IV ). (B) Box plots af plasmakoncentrationen af ​​miR-223 (venstre panel), miR-21 (midterste panel) og miR-218 (højre panel) i GC patienter med eller uden metastaser. Linjerne inde kasserne betegne medianerne. De whiskers af kassediagrammer: Min til Max

Forholdet mellem plasmaniveauerne af miR-223, miR-21, miR-218 og Hp Infektion status Emner

Ud. testede vi status Hp-infektion i de 140 forsøgspersoner, som beskrevet ovenfor, og analyseret plasmaniveauerne af de tre miRNA i 70 GC patienter (43 med Hp-infektion og 27 uden) og de 70 raske kontrolpersoner (31 med Hp-infektion og 39 uden) at vurdere forholdet mellem plasmaniveauerne af de tre miRNA og Hp-infektion status af emnerne. Som vist i figur 5, plasmaniveauerne af miR-21 (

P

= 0,875,

P

= 0,527) og miR-218 (

P

= 0,097,

P

= 0,539) var ikke signifikant forskellig mellem GC patienter med Hp-infektion og dem uden, og mellem de raske kontrolpersoner med Hp-infektion og dem uden, hhv. , MiR-223 var imidlertid betydeligt højere i GC patienter med Hp-infektion end dem uden (

P

= 0,014), og væsentligt højere i de raske kontrolpersoner med Hp-infektion end dem uden (

P

= 0,016). Plasmaniveauerne af miR-223 (

P

0,001) og miR-21 (

P

0,001) var signifikant forhøjet i GC patienter med Hp-infektion eller hvis uden sammenlignet med raske kontrolpersoner med Hp-infektion, eller hvis uden, hvorimod miR-218 var signifikant lavere (

P

0,05). Disse data giver stærke beviser, at de tre miRNA signaturer kan skelne GC patienter med eller uden Hp-infektion fra raske kontroller.

Box plots af plasmakoncentrationen af ​​miR-223, miR-21 og miR-218 i GC patienter med

H. pylori

infektion (Med, n = 43) og dem uden (Uden, n = 27), og i raske kontrolpersoner med

H. pylori

infektion (Med, n = 31) og dem uden (Uden, n = 39). Bemærk: *,

P

0,05; **,

P

0,01. Box plots viser plasmaniveauerne af MIR-223 (A), MIR-21 (B) og MIR-218 (C). Linjerne inde kasserne betegne medianerne. De whiskers af kassediagrammer:. Min til Max

Diskussion

I denne undersøgelse niveauerne af fire miRNA (MIR-223, mir-218, MIR-21 og miR- 25) i plasma fra 70 GC-patienter og 70 raske kontroller analyseredes. I overensstemmelse med de tidligere undersøgelser af Tsujiura et al [12], vores assay viste også, at de væsentligt højere plasmaniveauer af MIR-21 i GC patienter. Vi fandt, at niveauerne af MIR-223 var signifikant højere i GC plasma end i kontrol, hvorimod MIR-218 var betydeligt lavere. Den kombinerede ROC-analyser afslørede en højeste AUC på 0,9531 med 84,29% følsomhed og 92,86% specificitet for forholdet mellem (miR-223 × miR-21) /miR-218 i diskriminere GC fra kontroller. Vi analyserede også plasmaniveauerne af miR-223, miR-21, miR-218 i GC patienter ved forskellige kliniske status (TNM stadie eller metastase) og forholdet mellem plasmaniveauerne af de tre miRNA og Hp-infektion status af emnerne.

Selvom mIR-223 er blevet rapporteret til at være næsten udelukkende udtrykkes i knoglemarv [23], er blevet observeret dets overekspression i mange typer af cancer, såsom esophageal carcinoma [16], hepatocellulært carcinom [24], og GC [14], [15]. For nylig Xiaohua Li rapporterede, at MIR-223 kun blev overudtrykt i metastatisk gastrisk cancerceller og stimuleret ikke-metastatisk gastrisk migration og invasion [25] cancerceller. Hvorfor plasmaniveauerne af miR-223 var signifikant højere hos patienter med tidlig-fase GC? I GC mikromiljø, mange tumorassocierede celler, såsom makrofager, myeloide celler, dendritiske celler og T-celler, har kapacitet til at frigive exosomer, som shuttle både mRNA og microRNA til andre celler eller omløb [26]. For tidlige fase GC, kan MIR-223 opreguleres i visse tumorassocierede celler og afgives til det perifere blod via exosmes. De seneste oplysninger viste, at miR-223 frigivet af makrofager blev sendt ind i brystkræftceller og reguleret invasiviteten af ​​brystkræftceller [27]. Det er blevet påvist, at restaureringen af ​​miR-218 undertrykker Robo1 udtryk og hæmmer mavekræft celle invasion og metastase

in vitro

in vivo

[17]. Overekspression af MIR-218 resulterede i en signifikant nedsat cellevækst aktivitet og celleinvasion af AGS-celler sammenlignet med kontrollen [20]. Gao C et al [21] rapporterede, at ekspressionsniveauerne af MIR-218 blev reduceret betydeligt i GC væv, i H. pylori-inficerede maveslimhinden, og i H. pylori-inficerede AGS-celler. I vores undersøgelse, plasmaniveauerne af miR-218 var ikke signifikant forskellig mellem GC patienter med Hp-infektion og dem uden, eller mellem raske kontrolpersoner med Hp-infektion og dem uden. Niveauerne af miRNA kan være forskellig mellem GC plasma og maveslimhinden. MIR-21 overudtrykkes i forskellige cancerformer, herunder brystcancer [28], lungecancer [29], tyktarmskræft [30], og GC [18], [19]. Selvom Tsujiura et al [12] rapporterede, at plasmaniveauerne af miR-21 var signifikant forhøjet i GC patienter, har sine niveauer i plasma fra GC patienter på forskellige TNM hjorte ikke blevet identificeret.

Stigende antal papirer rapporterede at cirkulerende miRNA kan tjene som invasive biomarkører for GC detektion. For nylig Hanshao Liu rapporteret, at serum MIR-378 blev signifikant forhøjet i GC patienter med TNM trin I, antyder, at denne miRNA signatur kan tjene som en ny noninvasive biomarkør til tidlig opdagelse af GC [31]. Men infektion status Hp i GC patienter og raske kontrolpersoner blev ikke nævnt. Det er velkendt, at Hp-infektion er en af ​​de hyppigste årsager til GC, herunder gastrisk adenocarcinom, gastrisk MALT lymfom. Hvis plasma /serum niveauer af specifikke cirkulerende miRNA kun blev dysreguleret i GC patienter med Hp-infektion, men ikke i dem uden, kunne de miRNA tjene som biomarkører til detektering af patienter med Hp-infektion i stedet for påvisning af patienter med GC.

i denne undersøgelse, selv om vi analyserede plasmaniveauerne af miR-223, miR-21 og miR-218 i GC patienter på forskellige TNM stadier, at antallet af tidlige stadier GC prøver var beskeden. Antallet af plasma testes i træningssættet miRNA var begrænset. I fremtiden undersøgelse, kan vi få adgang til mere antallet af tidlige fase GC prøver at vurdere betydningen af ​​plasma miR-223, miR-21, miR-218 eller andre plasma miRNA forbundet med GC i tidlig påvisning af GC.

med henblik på at søge effektive blod-baserede biomarkører for GC detektion at forlænge overlevelsen af ​​patienter med tidlig GC, har mange forskere fokuseret på cirkulerende miRNA, der for nylig er rapporteret til at tjene som en effektiv og ikke-invasiv biomarkør til detektering forskellige kræftformer eller andre sygdomme [32] – [35]. Selvom sensitivitet og specificitet af cirkulerende miRNA-biomarkører for GC detektion er meget højere end de serum biomarkører (CA19-9 og CEA) i øjeblikket anvendes, det er en lang vej at gå, før cirkulerende miRNA som en klinisk diagnose bruges til at opdage GC , fordi niveauerne af en cirkulerende miRNA kan være væsentligt højere eller lavere i forskellige sygdomme. Fremtidige studier af cirkulerende miRNA-biomarkører kan fokusere på at kombinere udtrykket profiler af cirkulerende miRNA fra alle almindelige sygdomme for at opnå de specifikke biomarkører for unik afsløring sygdom. Selvom Jianning Song [36] anbefalede miR-16 og miR-93 som egnede referencematerialer gener for serum miRNA-analyse for GC patienter og raske kontrolpersoner, stikprøvestørrelsen er beskeden. Normaliseringsreferencerne metoder, der anvendes til at bestemme indholdet af cirkulerende miRNA skal forenet.

Som konklusion, vi identificeret, at tre plasma miRNA (MIR-223, MIR-21 og MIR-218) potentielt kan tjene som nye noninvasive biomarkører til GC detektion. Hvorvidt miR-223 og miR-21 har en evne til at opdage tidlige fase GC vil blive identificeret i fremtidige studier.

Støtte Information

Figur S1.

Validering af plasmaniveauerne for MIR-25 i GC-patienter og raske kontroller. Box plots af plasmakoncentrationen af ​​miR-25 i GC patienter (GC, n = 70) og raske kontroller (NC, n = 70). Linjerne inde kasserne betegne medianerne. De whiskers af kassediagrammer: Min til Max. Ingen signifikant forskel blev observeret mellem GC patienter og raske kontrolpersoner

doi:. 10,1371 /journal.pone.0041629.s001

(TIF)

tabel S1.

Den modne microRNAer og deres matchede primer /probe AB assay-id.

doi: 10,1371 /journal.pone.0041629.s002

(DOCX)

tabel S2.

Koncentrationsværdierne af de fire miRNA målt i plasma af emner.

doi:. 10,1371 /journal.pone.0041629.s003

(XLSX)

Tak

Vi takker Yun Zhao for teknisk support