PLoS ONE: CD44 ekspression i tarmepitel og kolorektal cancer er uafhængig af p53 Status

Abstrakt

CD44 mærker stamceller-lignende celler i en række tumortyper, herunder kolorektal cancer (CRC), mens afvigende CD44 udtryk formidler øget tumorigen, invasive, og metastatisk potentiale. Tidligere data indikerer, at CD44 er et direkte mål for p53-medieret transkriptionel repression i brystkræft. Siden inaktivere

p53

mutationer er hyppige genetiske begivenheder i CRC disse kunne udløse ekspressionen af ​​CD44. I den foreliggende undersøgelse har vi derfor undersøgt forholdet mellem

p53

mutationsstatus og CD44-ekspression i en kohorte af 90 lokaliserede primære CRCs og undersøgt effekten af ​​strålingsinduceret p53-aktivering på CD44-ekspression. Interessant vi observeret, at i modsætning til brystkræft, tab af funktion

p53 Salg mutationer var ikke associeret med forhøjet CD44-ekspression i colon cancer. Desuden gjorde DNA-skader induceret p53 aktivering ikke resultere i undertrykkelse af CD44-ekspression, hverken i kolon kræftceller heller ikke i normale intestinale epitelceller. Vores data viser, at CD44-ekspression i normale og maligne intestinale epitelceller ikke er reguleret af p53, hvilket indebærer, at reguleringen af ​​dette potentielt vigtige terapeutiske mål er væv og kræft-typespecifikke

Henvisning:. Zeilstra J, Joosten SPJ, Vermeulen L, Koster J, Medema JP, Versteeg R, et al. (2013) CD44 ekspression i tarmepitel og kolorektal cancer er uafhængig af p53 status. PLoS ONE 8 (8): e72849. doi: 10,1371 /journal.pone.0072849

Redaktør: Kanaga Sabapathy, National Cancer Centre, Singapore

Modtaget: Marts 1, 2013; Accepteret: 15 juli 2013; Udgivet: 29 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Zeilstra et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er blevet finansieret af det hollandske Cancer Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

CD44 består af en familie af celleadhæsion og signalmolekyler, der udøver pleiotrope virkninger på vigtige biologiske processer, herunder spredning, overlevelse, migration, epitelial til mesenkymale overgang (EMT), og cancer metastaser (gennemgået af Zöller [1]) . I tarmslimhinden, CD44 er en stor direkte mål for Wnt signalering og er tydeligt udtrykkes på intestinale stamceller [2] – [4]. Der er akkumulerende beviser, at CD44 er involveret i initiering og progression af intestinale tumorer og udvikling af metastaser [1], [3], [5] – [9]. Desuden fremtrædende ekspression af CD44 er et kendetegn for stærkt tumorogene CRC celler [10]. Derfor blev det for nylig påvist, at

CD44

er en del af en intestinal stamcelle gen signatur, forudsiger sygdom tilbagefald i CRC patienter [11]. Denne signatur er specielt forbundet med CRC celler udstyret med high-tumorfremkaldende potentiale såvel som lang sigt selvfornyelse kapacitet. Derfor CD44 udgør en potentiel terapeutisk mål for behandling af CRC, og det er derfor vigtigt at forstå de forskellige mekanismer, der ligger til grund for reguleringen af ​​CD44. I de fleste tilfælde af CRC, er ekspression af CD44 steget som følge af dysreguleret Wnt /β-catenin signalering [2], [12]. Men der er rigeligt med beviser for, at andre ikke-endnu identificerede veje og mekanismer bidrager til reguleringen af ​​Wnt /β-catenin target genekspression i intestinale tumorer [13]. Tumor suppressor protein p53 er en transkriptionsfaktor som spiller en kritisk rolle i suppression af cancer. Som reaktion på onkogene stress, såsom DNA-beskadigelse, aktiveret p53-protein binder til sekvens-specifikke DNA-sites for derved at regulere transkriptionen af ​​en lang række af target gener involveret i cellecykluskontrol og overlevelse signalering [14]. Mutations inaktivering af

p53

gen er en hyppig genetisk begivenhed i udviklingen af ​​mange typer af humane tumorer, herunder brystkræft og tyktarmskræft (CRC) [15]. Det blev for nylig vist, at p53 transkriptionelt undertrykker

CD44

udtryk i både normale og tumor-afledte mammae epitelceller ved direkte binding til

CD44

promotor [16]. Denne p53-afhængig regulering af CD44 blev observeret i både humane og muse mælkekirtler, hvilket indikerer et evolutionært konserveret funktion. Vigtigere, blev nedregulering af CD44-ekspression sig at være en forudsætning for p53-afhængig vækstregulering og induktion af apoptose i brystepitel [16]. En lignende funktionel samspil mellem p53 og CD44 kan også finde sted i intestinale epitelceller og tumorer. At undersøge, om CD44-ekspression styres af p53 protein i CRC, vi analyserede en kohorte af primær coloncarcinomer for

p53

mutationsstatus og CD44-ekspression. Vores undersøgelse viser, at tab af p53-funktion ikke er forbundet med forhøjet CD44 ekspression i CRC. Endvidere viser vi, at aktivering af vildtype p53 kan ikke undertrykke CD44-ekspression i humane coloncancer-celler samt i primære kulturer af muse intestinale krypt-villus organoids.

Materialer og metoder

etisk Statement

undersøgelsen omfatter menneskelige biopsiprøver blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og godkendt af den lokale etiske komité af The University of Amsterdam, AIEC (Algemene Instellingsgebonden Ethische Commissie). Patienterne gav skriftligt informeret samtykke til prøvetagningen.

Tumorprøver, p53 Mutation Analyse og Gene Expression Assay

Undersøgelsen kohorte bestod af 90 AJCC stadie II CRC patienter, undergik vilje helbredende kirurgi i Academic Medical center (AMC) i Amsterdam, Holland, i årene 1997-2006 [17]. Repræsentant frisk frossen tumorvæv blev skåret i 20 um tykke sektioner, der straks blev placeret i TRIzol reagens (Invitrogen Life Technologies, Breda, Holland), hvorefter totalt RNA blev udtrukket. Tumor belastning blev undersøgt rutinemæssigt af en erfaren patolog.

p53

mutationsstatus blev bestemt ved anvendelse af RT-PCR. Kort sagt, 2 ug total RNA blev omvendt transskriberet i 25 pi reaktion lydstyrken med pdN6 (Amersham Biosciences, Roosendaal, Holland) og MMLV transkriptase (Gibco BRL, Breda, Holland). PCR blev udført på 1 pi cDNA template under anvendelse platin Taq polymerase (Invitrogen Life Technologies). Oligo-primere er listet i tabel 1. PCR-produkter blev amplificeret ved 35 cykler af 45 sekunder ved 95 ° C, 45 s ved 60 ° C, og 1 min og 30 s ved 72 ° C, og blev sekventeret direkte under anvendelse af Big Dye Terminator Kit (Amersham) sammen med enten sense- eller anti-sense-oligo primer. Sekvenser blev analyseret under anvendelse CodonCode Aligner software (CodonCode Corp., Dedham, MA). Gene ekspressionsniveauer i tumorerne blev vurderet ved hjælp af Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0-array platform (Affymetrix, Santa Clara, CA). Oprenset RNA blev behandlet, hybridiseret, og scannet ifølge fabrikantens protokol. Dataene blev analyseret ved hjælp af softwarepakken R2 (https://r2.amc.nl), en web-baseret microarray analyse applikation udviklet af J.K. Data var MAS5-normaliseret og ekspressions-værdier blev log2 transformeret. Statistisk signifikans blev vurderet ved anvendelse envejs variansanalyse (ANOVA). Probe sæt analyserede var:

CDKN1A

(

p21

), ID: 202284_s_at;

MDM2,

229711_s_at; og

CD44,

209835_x_at. Andre sonde sætter analyse

CD44

producerede lignende resultater, for eksempel; 204489_s_at,

P

0,01 og 210916_a_at,

P

. 0,01)

Immunhistokemi

Paraffin-indlejrede tumorvæv var plettet anvendelse af primære mAb muse-anti-humant p53 (Dako, Glostrup, Danmark) og den primære mAb muse-anti-humant CD44 (VFF18), som genkender CD44v6 [18]. Antistofbinding blev visualiseret under anvendelse af Powervision poly-HRP detektionssystem (ImmunoVision Technologies, Daly City, CA) og DAB + (Dako). Intensiteten (I) ifølge den farvning blev scoret på semikvantitative skalaer som følger: “0”, ingen reaktion; “1”, svag reaktion; “2”, moderat reaktion; og “3”, stærk reaktion. Omfanget af signalet blev scoret som procentdelen af ​​positive celler (P). Samlet farvning score blev beregnet ved at gange intensiteten af ​​procentdelen af ​​positive celler (Score = P * I; maksimum = 300). Fishers eksakte test blev anvendt til statistisk analyse (

P

0,001).

Cell Culture, Immunoblotting og Real-time Reverse Transcription-PCR

RKO celler blev dyrket i McCoys 5A-medium supplementented med 10% FCS indtil subkonfluerende. Mus små tarm krypter blev isoleret i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af den lokale dyreetik udvalg Universitet Amsterdam, DEC (Dier Ethische Commissie) og dyrket i en uge, som beskrevet af

Sato et al

. [19]. Kulturer blev udsat for en enkelt dosis på 10 Gy fra en

137Cs γ-ray strålingskilde i en dosis på 0,8 Gy /min eller inkuberet med 500 ng /mL neocarzinostatin (NCS) enten i kombination med 10 pM nutlin eller ej . Celler blev høstet i lysepuffer i de angivne tidspunkter. Antistoffer anvendt til immunoblotting var anti-pan CD44 mAb Hermes-3 [20], anti-p21-mAb sx118 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), og anti-p53-mAb DO-1 (Santa Cruz Biotechnology). p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Samtidig blev total RNA isoleret ved hjælp af PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturus Bioscience, Mountain View, CA) og real-time QRT-PCR blev udført som beskrevet tidligere [3], [21]. En måde-variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til at bestemme væsentlige ændringer (

P

0,05). I gang

Resultater

tab af funktion mutation af p53 er Ikke forbundet med forhøjet CD44 Expression i Colon cancer

Den nylige identifikation af p53 som en transskriptionsrepressor af

CD44

i brystkræft og brystepiteliet [16], fik os til at undersøge, om en lignende funktionel relation eksisterer i koloncancer og tarmepitelet. Vi har derfor undersøgt forholdet mellem p53 mutationsstatus og

CD44

mRNA-niveauer i en kohorte af 90 kolorektale karcinomer. Alle tumorer inkluderet i denne undersøgelse var adenokarcinomer med invasion gennem muscularis propria, men uden lymfeknude eller fjernmetastaser (Dukes B, AJCC fase II). Mutationsstatus blev vurderet ved cDNA-sekventering af hele den kodende region af

p53

gen, der spænder over exonerne 1 til 11. Sekvensanalyse identificerede 25 tumorer (28%) med en mutation, hvilket resulterer i et transskriptionelt inaktivt p53 protein ifølge til definitionen af ​​Soussi et al. [22] (Tabel 2). Sammenligning mellem grupperne med vildtype og mutant

p53

afslørede en signifikant nedsat mRNA ekspressionen af ​​to kanoniske p53 transkriptionelle mål,

CDKN1A

(

p21

) (

P

0,01) [23] og

MDM2

(

P

0,001) [24] i tumorer med

p53

tab af funktion mutationer ( Figur 1A og B). Interessant, i modsætning til mamma tumorer, hvori blev fundet tab af p53-funktion at være signifikant korreleret med forhøjet

CD44

udtryk [16],

p53

mutation i tyktarmskarcinomer var korreleret med nedsat

CD44

mRNA ekspression niveauer (

P

0,01, figur 1C). Disse resultater antyder, at p53 ikke fungere som en transskriptionsrepressor af

CD44

udtryk i CRC.

Relativ genekspression niveauer i

p53

mutant og

p53

vildtype adenokarcinomer til (A)

CDKN1A

(

p21

) (**, P 0,01), (B)

MDM2 Hotel (***,

P

0,001), (C)

CD44,

(**,

P

. 0,01)

CD44 Protein Expression er ikke steget i tyktarmskarcinomer med

p53

Mutation

for at bekræfte, at

p53

mutationsstatus og mRNA-niveauer af

CD44

i primære tyktarmskræft prøver afspejler proteinniveauer undersøgte vi p53 og CD44-ekspression ved immunhistokemi i en delmængde af tumorer (n = 15 /gruppe). Mutationer i

p53

ofte resultere i en uhensigtsmæssig stabilisering af proteinet og kerneakkumulation [25]. I overensstemmelse, mens tumorer huser kun vildtype

p53

gensekvenser viste enten ingen farvning for p53 protein eller nukleare farvning i spredte celler, tumorer, der indeholder en

p53

mutant gen viste en stærk nuklear farvning af størstedelen af ​​de maligne celler (

P

0,001, figur 2A og B). CD44-ekspression blev observeret på cellemembranen for det store flertal tumorer med enten ikke-muteret

p53 Hotel (14 ud af 15) eller muteret

p53 Hotel (14 ud af 15) (fig. 2A). Vigtigere, var der ingen signifikant forskel i CD44-farvning score mellem tumorer i begge grupper (

P

0,05; Figur 2B). Disse resultater viser, at bortset i brystkræft, er tab af p53-funktion i tyktarmskræft ikke forbundet med øget CD44 proteinekspression.

(A) Serielle sektioner af et kolon carcinom uden og med et p53 tab af funktion mutation (

dvs

., R175H, tabel 2), farvet for p53 og CD44-protein (søjler angiver 50 um). (B). Immunhistokemi (IHC) score på p53 og CD44 proteinekspression henholdsvis (***,

P

0,001, ns = ikke signifikant).

p53 ikke undertrykke

CD44

i Colon Cancer Cells og normal tarmepitelet

de ovennævnte resultater ikke udelukker muligheden for, at vildtype p53 kan (delvist) undertrykker CD44-ekspression i normalt og neoplastisk tarm epitel ved aktivering af genotoksisk stress . For at løse denne mulighed, vi bestemt effekten af ​​DNA-skader-induceret p53-aktivering på CD44 i menneskelige RKO kolon kræftceller. Disse celler udtrykker vildtype p53 og K-Ras, og er diploid [26]. Af særlig interesse, RKO celler indeholder også vildtype

APC

og

CTNNB1

gener og mangler konstitutive β-catenin /TCF-4-medieret transkription [27]. Dette er af betydning, da den transkriptionelle regulering af

CD44

efter p53 kan være maskeret af konstitutiv Wnt pathway aktivering, hvilket fører til p-catenin /TCF-4-medieret

CD44

ekspression. RKO celler blev udsat for 10 Gy af γ-stråling, hvorefter udtryk for

CDKN1A

(

p21)

CD44

og blev analyseret ved real-time QRT-PCR. Ekspression af

c-MYC

blev en direkte Wnt målgen [28], [29] også analyseret for at kontrollere for opretholdelse af en konstant tilstand af β-catenin /TCF-4-drevet transkriptionel aktivitet. Desuden blev p53, p21 og CD44 proteinniveauer analyseret ved immunblotting. Som forventet, ioniserende stråling-induceret DNA-skader resulterede i p53 stabilisering (figur 3A) og blev observeret den deraf transaktivering af p21 på alle tidspunkter (figur 3A og B). Men

CD44

genekspression og CD44 protein niveauer ikke falde over tid (figur 3A og B), mens

c-myc

mRNA niveauer forblev stabil (figur 3B). Disse data indikerer, at p53 ikke er i stand til at undertrykke

CD44

ekspression i humane coloncancer-celler.

(A) Immunblotting analyse af p53, p21 og CD44 proteinniveauer i RKO colon cancerceller behandlet med ioniserende stråling. Actin blev anvendt som indlæsning kontrol. (B) QRT-PCR-resultater viser relativ genekspression niveauer for

CDKN1

A (

p21

),

CD44,

c-myc

. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM af dobbelte eksperimenter;. (*,

P

0,05 sammenlignet med t = 0).

For at udvide vores observationer til normal tarm epitel, vi næste undersøgte CD44 respons på p53-aktivering i epitelceller, der beklæder krypten-villus akse mus tyndtarmen. Til dette formål, vi beskæftigede

in vitro

dyrkede mus tarm epitel krypter-villus organoids [19]. Organoids omfatter multiple crypt domæner (figur 4A) blev udsat for 10 Gy af γ-stråling efter hvilken

Cdkn1a

,

CD44

, og

c-Myc

mRNA ekspressionsniveauer var analyseret af real-time QRT-PCR. Svarende til RKO-celler,

Cdkn1a

mRNA-niveauer blev forøget i de organoids som reaktion på ioniserende stråling (figur 4B). Disse resultater stemmer overens med tidligere undersøgelser af strålingsinduceret p53 aktivering i muse krypt rum [30].

CD44

mRNA ekspression blev ikke ændret sig væsentligt efter stråling, mens ekspressionsniveauerne

c-myc

forblev stabil (figur 4B). Tilsvarende kemisk induktion af p53-aktivering ved hjælp af NCS resulterede også i øgede niveauer af

Cdkn1a

mRNA. Samtidig inkubation med p53 stabiliserende middel nutlin yderligere forhøjet

Cdkn1a

mRNA-niveauer. I begge betingelser

blev CD44

mRNA-ekspression ikke signifikant ændret, mens

c-myc

ekspressionsniveauerne forblev stabil (Figur 4C) .Disse resultater bekræfter vores resultater i humane RKO celler og i den primære tyktarm karcinomer, og vise, at

CD44

genekspression er ikke reguleret af p53 i både normale og transformerede intestinale epitelceller.

(A) Crypt-villus organoide efter en uges kultur. Pile angiver krypt-lignende rum (B) QRT-PCR-resultater viser relative genekspressionsniveauer efter strålebehandling for

Cdkn1a

,

CD44,

c-myc.

Data repræsenterer middelværdi ± SEM af dobbeltforsøg; (*,

P

0,05 sammenlignet med t = 0). (C) QRT-PCR resultater, der viser relative genekspressionsniveauer efter behandling med NCS alene eller NCS plus nutlin for

Cdkn1a

,

CD44

c-myc

(*,

P

0,05, **,

P

. 0,01 sammenlignet med t = 0)

diskussion

identifikation af p53 som en transkriptionel repressor af CD44-ekspression i brystcancer [16] fik os til at undersøge forholdet mellem

p53

mutationsstatus og CD44-ekspression i colon cancer. Vi viser, at bortset i brystkræft,

CD44

mRNA og protein niveauer er ikke steget i tyktarmskarcinomer med tab af funktionel p53, sammenlignet med tumorer uden

p53

mutationer (figur 1C, 2B ). Desuden

CD44

ekspression i både normalt og neoplastisk tarmepitelet blev ikke påvirket af kemisk eller stråling-medieret aktivering af p53, hvilket indikerer, at p53 fungerer ikke som en transkriptionel repressor af

CD44

i intestinale epitelceller.

den observerede vævsspecifik forskel mellem bryst og tyktarm i transkriptionel regulering af

CD44

kan forklares ved kompleksiteten af ​​p53-funktion. Mindst to funktioner i p53-proteinet er nødvendige for dets gen regulerende funktion: p53 skal genkende og binde et specifikt DNA-sekvenser i promotoren af ​​målgenet og p53 skal ansætte flere transkriptionelle co-regulatorer (gennemgået af Laptenko og Prives [14 ]).

CD44

promotor indeholder en ikke-kanonisk p53 bindende sekvens [16], men flere interaktioner med co-aktivatorer og co-repressorer samt med komponenterne i den generelle transkriptionelle maskineri diktere dens evne til at dirigere promotor aktivering [14]. For eksempel, interaktioner med ASPP1, BRCA1 eller PTEN, eller koordineret aktivitet af både P63 og P73, er blevet identificeret som determinanter, at direkte specifikke svar [14], [31]. Forskelle i ekspressionen og aktiviteten af ​​disse co-regulatorer mellem bryst og intestinale epitel kunne derfor bidrage til en divergent rolle for p53 i transkriptionel kontrol af

CD44

gen i bryst og tyktarm epitel og cancerceller. Desuden kan p53 undergå flere typer af post-translationel modifikation, herunder phosphorylering, acetylering og ubiquitinering [32], som kan dirigere promotor udvælgelse [33]. Derfor p53 funktion afhænger af en kompleks og stram regulering, og celle-specifikke ændringer eller interaktioner kan forklare dens manglende evne til at undertrykke CD44 i intestinale epitelceller. Vores konstateringen af, at CD44-ekspression i normale tarm epitel og coloncarcinomer er uafhængig af p53-ekspression og p53 mutationsstatus har betydning for forståelsen af ​​patogenesen af ​​CRC og kan have vigtige terapeutiske implikationer. Afvigende CD44 udtryk er fordelagtigt for vækst, overlevelse og udbredelse af tumorceller [1]. I CRC disse biologiske funktioner af CD44 strække sig ud over dens evne til at antagonisere de pro-apoptotiske og cytostatiske funktioner af p53 [16], [34]. Dette kan i det mindste delvis forklare den begrænsede rolle af p53 i modulering umiddelbar fænotype af nydannede intestinale adenomer [35]. Endvidere har flere undersøgelser vist, at CD44 er en robust markør med funktionel betydning for tyktarmskræft stamceller [10], [11], [36] – [38]. Disse celler menes at være relativt resistente over for behandling og ansvarlig for tumor-formering, som gør CD44 et attraktivt mål for cancer stamceller rettet behandling, uafhængig af p53.