PLoS ONE: Overekspression af TRIM24 korrelerer med Tumor Progression i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Formålet med den aktuelle undersøgelse var at undersøge udtrykket mønster og klinisk-patologisk betydning af TRIM24 hos patienter med non-small celle lungecancer (NSCLC). Udtrykket profil TRIM24 i NSCLC væv og tilstødende noncancerous lungevæv blev påvist ved immunhistokemi. TRIM24 viste sig at være overudtrykt i 81 ud af 113 (71,7%) humant lunge cancer prøver og korreleres med p-TNM fase (p = 0,0006), dårlig differentiering (p = 0,004), Ki67 indeks (p 0,0001), cyclin D1 ( p = 0,0096) og p-Rb ekspression (p = 0,0318). Desuden nedbryder TRIM24 ekspression ved små interfererende RNA hæmmet vækst og invasion i lunge cellelinier. Desuden TRIM24 udtømning fremkaldt standsning af cellecyklus ved G1 /S grænsen og induceret apoptose. Western blotting-analyse viste, at knockdown af TRIM24 reducerede proteinniveauer af cyklin A, cyklin B, cyklin D1, cyclin E og p-RB og øget P27 ekspression. Disse resultater indikerer, at TRIM24 spiller en vigtig rolle i NSCLC progression

Henvisning:. Li H, Sun L, Tang Z, Fu L, Xu Y, Li Z, et al. (2012) Overekspression af TRIM24 korrelerer med Tumor Progression i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 7 (5): e37657. doi: 10,1371 /journal.pone.0037657

Redaktør: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, Indien

Modtaget: Januar 2, 2012; Accepteret: April 23, 2012; Udgivet: 30. maj 2012 |

Copyright: © 2012 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de førende årsager til alle cancerrelaterede dødsfald på verdensplan og forekomsten af ​​lungekræft stiger [1], [2]. Størstedelen af ​​de diagnosticerede tilfælde lungekræft er ikke-småcellet kræft (NSCLCs). Selvom tre terapeutiske modaliteter (kirurgisk resektion, kemoterapi, og strålebehandling) er blevet oprettet, langsigtede overlevelse for patienter med lungecancer er stadig generelt dårlig [3]. En række komplekse genetiske, epigenetiske og microenvironmental faktorer spiller en vigtig rolle i overlevelsen og kolonisering af tumorceller på nye placeringer [4], [5]. En forbedring i forståelsen af ​​molekylære processer involveret i pulmonal carcinogenese har ført til nye behandlingsmuligheder med målrettede små molekyler og vacciner demonstrerer opmuntrende potentiale. Derfor bedre definere patogenesen af ​​lungekræft, på udkig efter brugbare biomarkører, og udforske nye terapeutiske mål er krævende opgaver.

TRIM24 blev oprindeligt navngivet transskription mellemled faktor 1-alfa (TIF1α), der blev identificeret som en co -regulator af retinoid signalering [6] – [8]. Afvigende ekspression af TRIM24 kunne fremme tumor udvikling ved flere mekanismer. TRIM24 er et mål for kromosomale translokationer at danne onkogene fusionsproteiner i akut promyelocytleukæmi, papillær skjoldbruskkirtlen carcinom og myeloproliferative syndrom [9] – [11]. TRIM24 kunne ubiquitylate og negativt regulere p53 niveauer, hvilket gjorde TRIM24 en terapeutisk mål at genoprette tumor undertrykkelse af p53 [12]. TRIM24 binder også chromatin og østrogenreceptor at aktivere østrogen-afhængige gener, der var forbundet med cellulær proliferation og tumorudvikling [13], [14]. Forhøjet udtryk for TRIM24 kunne fremme udviklingen af ​​prostatakræft og negativt korreleret med overlevelsen af ​​brystkræftpatienter [14], [15]. Disse resultater tyder på, at TRIM24 var et onkogen i tumor udvikling. viste imidlertid seneste undersøgelser, at tab af TRIM24 i mus førte til hepatocellulært carcinom udvikling og TRIM24 interageret med TRIM28 og TRIM33 at danne regulatoriske komplekser, der undertrykte murine hepatocellulært carcinom, hvilket tyder på sin rolle som en tumor suppressor i heptocellular karcinom [16]. Desuden blev arterielle forkalkninger og ekspression af vitamin D-receptor-mål steg i mus, som mangler TRIM24, der viser, at TRIM24 kunne forhindre forkalkning af arterierne ved at nedsætte aktiviteten af ​​vitamin D-signalvejen [17].

proteinekspression af TRIM24 i primær lungekræft og dets forhold til klinisk-patologiske faktorer er endnu ikke undersøgt. Desuden er de biologiske roller TRIM24 i lungekræft celler er stadig uklart. For at løse de ovenstående spørgsmål, vi undersøgte TRIM24 udtryk i ikke-små-cellet lungekræft væv ved immunhistokemi. Derudover har vi også udforskes sammenslutningen af ​​TRIM24 med spredning og invasion evne i flere lungekræft-cellelinjer.

Resultater

Overekspression af TRIM24 protein i ikke-småcellet lungekræft Væv

Vi analyserede udtryk for TRIM24 i 113 NSCLC prøver og deres tilsvarende normale væv ved immunhistokemi. TRIM24 ekspression blev observeret i nukleare rum i tumorcelle (Figur 1 C-G), mens den normale bronchial epitel og pneumocytter udviste negativ eller lav farvning (Figur 1 A, B). Farvningsintensiteten af ​​normal respiratorisk epitel støder op til tumor kan vurderes i flere sektioner, der indeholder maligne tumorer og normale væv i samme glas. Mens ingen til svag farvning for TRIM24 blev påvist i de normale lungevæv blev en stærk farvning af TRIM24 detekteret i tilstødende tumorceller (figur 1 C). Vi undersøgte forholdet mellem den samlede TRIM24 udtryk og de kliniske parametre. Som vist i tabel 1 blev ingen statistisk forskel mellem det TRIM24 overekspression og kendetegn for alder (p = 0,4697), køn (p = 0,1814), tumor status (p = 0,1812), nodal status (p = 0,0825) og tumor type (p = 0,6327). Men patienter med forhøjet TRIM24 udtryk viste dårlig differentiering (p = 0,004) og havde fremskredent stadium af NSCLC (I vs II + III + IV, p = 0,0006). Vi undersøgte ekspressionen af ​​Ki-67 at undersøge forholdet mellem TRIM24 positivitet og proliferativ aktivitet af cancervæv ved immunohistokemi. Sager, der havde høje niveauer af TRIM24 ekspression tendens til at have høj proliferationsindeks angivet med Ki-67 mærkning (p 0,0001). Dobbelt immunfluorescens analyse blev udført og co-lokalisering af Ki-67 og TRIM24 blev observeret (figur 2A, B). Immunfarvning for p53, retinsyrereceptor alfa (RARa), cyclin D1, p-Rb, og p27 blev også udført, og deres tilknytning til TRIM24 ekspression blev analyseret (figur 2 C-H). Som vist i tabel 1, TRIM24 overekspression korreleret med høj cyclin D1 (p = 0,0096) og p-Rb ekspression (p = 0,0318), mens ingen statistisk forskel blev fundet mellem TRIM24 overekspression og p53 (p = 0,9028), RARa (p = 0,1025), og p27 status (p = 0,6335).

A. Negativ farvning i normal bronkieepitel i ikke-kræft lungevæv. B. negativ farvning i normale pneumocytter i alveolerne i ikke-kræft lungevæv. C. TRIM24 immunfarvning var negativ i bronkieepitel støder op til lunge adenocarcinom. D. Negativ TRIM24 farvning i et tilfælde af Stagel, moderat differentieret planocellulært karcinom. E. Negativ farvning i Stagel, godt differentieret lunge adenocarcinom. F. Positiv TRIM24 farvning i en sag af fase II, dårligt differentieret planocellulært karcinom. G. Positiv TRIM24 farvning i en sag af fase III, moderat differentieret adenocarcinom. H. Negativ kontrol under anvendelse af kanin-immunglobulin.

Immunfluorescensfarvning viste co-lokalisering af TRIM24 og Ki-67 i adenocarcinom (A) og pladecellekræft (B). Immunohistokemisk farvning for TRIM24 (C) og RARa (D), cyclinD1 (E), p-Rb (F), p27 (G) og p53 (H) farvning i et tilfælde af NSCLC.

TRIM24 Nedbrydning inhiberer proliferation, invasion og inducerer apoptose i Lung cancercellelinier

Ekspression af TRIM24 blev analyseret ved western blot i et panel af lungekræft cellelinier (figur 3). Vi fandt niveauet af TRIM24 ekspression i H1299 og A549-celler var højere end andre cellelinjer. Da rolle TRIM24 er tæt forbundet med p53 og RARa i nogle typer af tumor, undersøgte vi også p53-ekspression og RARa i lungekræft cellelinier. Der var ingen indlysende forbindelse mellem disse faktorer. For at udforske den biologiske funktion af TRIM24 i lungekræft, vi ansat siRNA til Knockdown TRIM24 udtryk i både H1299 og A549-cellelinjer. TRIM24-specifikke siRNA reduceres betydeligt både mRNA såvel som protein ekspressionsniveauer af TRIM24 efter 48 timers siRNA behandling (figur 3). Vores celledeling analyse viste, at udtømning af TRIM24 i H1299 og A549 celler førte til en betydelig reduktion af spredning sats (A549 39% reduktion på dag 5, p 0,05; H1299 23% reduktion på dag 5, p 0,05) og foci numre samt størrelser (A549 kontrol vs TRIM24si: 400 ± 38 vs 130 ± 20, s 0,05; H1299 kontrol vs TRIM24si: 235 ± 25 vs 85 ± 18, s 0,05), hvilket tyder på, at TRIM24 modulerer spredning af lungekræft celler (figur 4). Analyse af cellecyklus viste, at procentdelen af ​​S og G2 fase i TRIM24 knockdown-celler var meget lavere end kontrolceller og procentdelen af ​​G1-fasen blev forøget (figur 5A). Således TRIM24 knockdown hæmmede cellecyklusprogression.

A. Ekspressionsniveauer af TRIM24, p53 og RARa blev analyseret ved western blot i et panel af lungekræft cellelinier. B. Western blot af TRIM24 depletion effektivitet i cancerceller. C. Real-time PCR-analyser af TRIM24 udtømning effektivitet i kræftceller.

A. MTT-assayet blev udført efter TRIM24 siRNA behandling. En reduktion af absorbansen blev iagttaget (p 0,05 på dag 5 for både A549 og H1299). B. Vurdering af klonogene potentialer i TRIM24-udtømte cancerceller. Antal kolonier blev talt. Antallet af kolonier dannet af celler behandlet med TRIM24 siRNA var langt mindre end af kontrolceller (p 0,05). Kolonner, betyder; barer, SD. * P. 0,05

Den procentdel af G1 fase blev forøget i celler med TRIM24 knockdown (H1299 og A549, p 0,05), mens procentdele af S-fasen (H1299, s 0,05) og G2 fase (H1299 og A549, p 0,05) var nedsat i disse celler sammenlignet med kontrolceller (A). TRIM24 knockdown også induceret celle apoptose i både A549 og H1299 cellelinier (B, s 0,05). * P. 0,05

Desuden Annexin V kit blev anvendt til at karakterisere død funktion i H1299 og A549 celler med TRIM24 knockdown (figur 5B). Det er klart, en betydelig population af tidlig og sen apoptose (H1299: 7,22%; A549: 10,45%) blev observeret i celler med TRIM24 knockdown i forhold til kapløbet kontroller (H1299: 3,76%; A549: 8,43%), hvilket viser, at TRIM24 Knockdown resultater i apoptose af lunge kræftceller, især i H1299 celler, som har høj endogen TRIM24 udtryk.

for at bestemme om TRIM24 bidrager til invasionen af ​​ikke-småcellet lungekræft celler, vi gennemførte matrigel invasion assays. Som vist i figur 6A, TRIM24 knockdown hæmmet celleinvasion (A549 kontrol vs TRIM24si: 91 ± 15 vs 68 ± 11, s 0,05; H1299 kontrol vs TRIM24si: 62 ± 4 vs 38 ± 8, s 0,05).

TRIM24 siRNA behandling har en målbar blokerende effekt på celle invasion i begge cellelinier. Antal celler invaderer på den nedre overflade af filteret blev talt, blev en signifikant forskel observeret (A, p 0,05). Kolonner, betyder; barer, SD. Der var ingen signifikant ændring af MMP2 og MMP9 ekspressionsniveauer efter TRIM24 knockdown (B). * P. 0,05

For yderligere at udforske de mekanismer, som TRIM24 fremmer NSCLC celleinvasion, vi undersøgt ekspression af MMP-2 og MMP-9 udtryk før og efter transfektion af siRNA. Som vist i figur 6B, blev mRNA-niveauer af MMP-2, MMP-9 undersøgt ved kvantitativ real-time RT-PCR. Men vi ikke observere bemærkelsesværdige ændringer i deres udtryk.

Udtømning af TRIM24 nedreguleret CyclinA, B, D1 og E Expression og opreguleret P27 i lungekræft Celler

cellecyklus analyser blev udført i cancerceller med eller uden TRIM24 knockdown, og fandt, at andelen af ​​G1-fasen blev forøget i celler med TRIM24 knockdown, hvorimod andelen af ​​S-fasen blev reduceret i disse celler sammenlignet med kontrolceller (figur 5). Disse resultater indikerer, at TRIM24 udtømning inducerer standsning af cellecyklus ved G1 /S grænsen. Desuden blev andelen af ​​G2-fase celler faldet. For at undersøge den mekanisme underliggende cellecyklusstandsningen, testede vi virkningen af ​​TRIM24 knockdown på cyklin A, cyklin B, cyklin D1, cyklin D3, cyclin E, CDK2, CDK4, CDK6, P-Rb, P21 og P27 niveauer. Som vist i figur 7A, Western blotting-analyse viste, at knockdown af TRIM24 reducerede proteinniveauer af cyklin A, B, D1, E, p-Rb og forøget P27-ekspression. Tilsammen tyder disse resultater på, at inhibering TRIM24 ekspression inducerer standsning af cellecyklus ved G1-S overgang og undertrykker lungecancer cellevækst. Til direkte at måle p53 transkriptionel aktivitet, blev en p53-responsiv luciferasereporterplasmid anvendes til at undersøge forholdet mellem TRIM24 og p53-aktivitet i lunge cancercellelinier. Der var ingen signifikant ændring af cellulær p53 aktivitet efter TRIM24 knockdown (figur 7B).

Western blot-analyse af en serie af cellecyklus relaterede faktorer viste proteinniveauer af cyklin A, B, D1, E og p- Rb reduceredes og P27-ekspression blev øget efter silencing TRIM24 i H1299 og A549-celler (A). Der var ingen signifikant ændring af p53 luciferase aktivitet efter siRNA behandling i begge cellelinier (B).

Diskussion

opregulering af TRIM24 udtryk havde været impliceret i flere humane kræftformer sådanne som akut promyelocytisk leukæmi, papillær skjoldbruskkirtlen carcinom og brystcancer [9] – [11], [14]. Desuden TRIM24 overekspression korreleret med overlevelsen af ​​brystkræftpatienter [14], [15]. Imidlertid ekspressionsmønsteret for TRIM24 samt dets korrelation med kliniske og patologiske faktorer er endnu ikke defineret, i human lungecancer. I denne undersøgelse har vi vist, at TRIM24 proteinekspression i lungekræft væv var højere end i tilsvarende normale lungevæv. Der var en tæt sammenhæng mellem TRIM24 opregulering og pTNM scenen og differentiering.

Tidligere forskning vedrørende sit udtryk mønster viste, at TRIM24 blev overudtrykt i brystkræft hos både mRNA og protein niveauer, og dens overekspression var korreleret med ER, PR status og dårlig prognose [15]. Vores undersøgelse viste en sammenhæng mellem TRIM24 overekspression og pTNM scenen og dårlig differentiering i lungekræft, som var i overensstemmelse med tidligere data, hvilket tyder TRIM24 kan spille en vigtig rolle i lungekræft progression. For at validere den potentielle rolle TRIM24 i udviklingen lungekræft, vi først kontrolleres sit udtryk niveau i flere cellelinjer og afhentes A549 og H1299 med relativt højt TRIM24 niveau til yderligere undersøgelse. Vi ansat siRNA til Knockdown TRIM24 udtryk i disse to cellelinjer. Vi fandt en svækket proliferation kapacitet og kolonidannelse evne både A549 og H1299 celler efter TRIM24 knockdown. Endvidere viste matrigel invasion assay faldt invaderende evne siRNA behandlede celler. Således er vores undersøgelse foreslået, at TRIM24 fungerede som et onkogen i udvikling lungekræft.

Forrige rapport viste, at TRIM24 kan direkte ubiquitinere p53 og negativt regulere protein niveau af P53 i brystkræft cellelinier, hvilket indebærer sine roller i proliferation og apoptose [12]. De fleste af de proliferative faktorer påvirker cellevækst ved at påvirke cellecyklusprogression. Så vi anvendte cellecyklusanalyse og fandt, at TRIM24 knockdown-celler viste højere niveauer af G1-fasen og lavere S-fasen end kontrolcellerne. Så TRIM24 knockdown hæmmet G1 til S overgang i cellecyklusprogression, som kunne forklare mekanismen for TRIM24 om lungekræft celleproliferation. TRIM24 knockdown også induceret apoptose i H1299 og A549 celler, der kan delvis skyldes blokering af G1 /S overgang. Desuden viste vi, at TRIM24 siRNA blokerede celle invasion. For yderligere at undersøge mekanismen, udforskede vi udtryk for invasionen-relaterede MMP2 og MMP9. Vi har ikke observere bemærkelsesværdige ændringer i disse molekyler. Man kunne hævde, at der er andre funktionelle aspekter af TRIM24 bidrager til forordningen, der har behov for yderligere undersøgelser.

For at finde ud af den potentielle mekanisme for TRIM24 på cellecyklusregulering undersøgte vi effekten af ​​TRIM24 knockdown på en antal celle-cyklus beslægtede molekyler. Vi kontrollerede ekspressionen af ​​cyclinA, B, D1, D2, D3, E, H, CDK2 /4/6, p-Rb, p21 og P27. Vi fandt, at niveauerne af cyclinA, B, D1, E og p-Rb blev nedsat efter TRIM24 knockdown, mens niveauet af P27-ekspression var forhøjet. Cyclin D1 interagerer med Cdk4 /6 for at danne et kompleks phosphorylerende Rb, der regulerer celleproliferation ved at styre progression gennem begrænsningen punkt inden for G1-fasen af ​​cellecyklussen [18]. Cyclin D1 er overudtrykt i en række forskellige cancere og i forbindelse med cancer celleproliferation [19] – [21]. Cyclin A er påkrævet for celler at fremskridt gennem S-fasen [22]. Cyclin B er et mitotisk cyclin og ophobning kun findes ved G2-M overgang [23]. Tumor suppressor protein p27 virker som en inhibitor af cellecyklusprogression. I tilknytning til CDK2-komplekser, P27 tjener til at inhibere kinaseaktivitet og blokere progression gennem G1 /S [24], [25]. Således vores resultater viste reduceret niveau af cyclin A, B, D1, E, p-Rb og forøget p27-protein forbindelse med den kendsgerning af nedsat niveau af S og G2-fase celler og øget G1-fase celler efter TRIM24 knockdown, hvilket tyder TRIM24 spiller en vigtig rolle i cellecyklus kontrol over lungecancerceller. Endvidere blev TRIM24 overekspression forbundet med høje niveauer af cyclin D1 og p-Rb i lungekræft prøver.

Nogle data viste, at den rolle TRIM24 var forbundet med p53 og retinsyrereceptor alfa. Vi undersøgte disse to faktorer i kliniske prøver og cellelinier. Men vi fandt ikke signifikant sammenhæng mellem TRIM24 og disse faktorer. Endvidere iagttoges ingen tydelig ændring af cellulær p53 aktivitet efter TRIM24 knockdown i A549 (vildtype p53) og H1299 (p53 null) cellelinjer under anvendelse luciferase reporter-system, hvilket tyder rolle TRIM24 på cellecyklusregulering var uafhængig af p53-aktivitet.

Som konklusion nærværende undersøgelse undersøgte udtrykket mønster og klinisk-patologisk betydning af TRIM24 i NSCLC og behandlet den biologiske rolle og potentiale mekanisme TRIM24 i lungekræft progression.

Materialer og metoder

Patienter og Prøver

Denne undersøgelse blev foretaget med godkendelse af den lokale institutionelle gennemgang bord på Kina Medical University. 113 tilfælde af NSCLC prøver blev opnået fra den første Tilknyttede Hospital i Kina Medical University i perioden 2007 til 2009. histologisk diagnose og grad af differentiering af tumorerne blev defineret af evaluering af hematoxylin og eosin-farvede vævssnit, ifølge World Health Organization retningslinjer for klassificering. Alle 113 prøver blev revurderet med hensyn til deres histologiske undertyper, differentiering status, og tumor etaper. For NSCLC prøver blev Pladecellekræft og adenocarcinom identificeret i 42 og 71 af de 113 sager, hhv. Lymfeknudemetastaser blev observeret hos 46 patienter. Den p-TNM taging systemet af Den Internationale Union Against Cancer (7. udgave) blev anvendt til at klassificere prøver som trin I (n = 49), II (n = 35), III og IV (n = 29).

cellelinier

NHBE, A549, blev H1299, H157, H460, og H1299 cellelinjer opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). SPC, LTE, og LK2 cellelinjer blev indkøbt fra Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Science. BE1 cellelinje var en gave fra Dr. J. Zheng (Patologisk Institut, Peking University, Beijing). Cellerne blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) indeholdende 10% føtalt kalveserum (Invitrogen), 100 IU /ml penicillin (Sigma, St. Louis, MO, USA), og 100 pg /ml streptomycin ( Sigma). Celler blev dyrket på sterile vævsdyrkningsskåle og blev passeret hver 2 dage ved hjælp 0,25% trypsin (Invitrogen).

Immunhistokemi

Kirurgisk udskårne tumorprøver blev fikseret med 10% neutral formalin, indlejret i paraffin og 4 um tykke snit blev fremstillet. Immunfarvning blev udført under anvendelse af avidin-biotin-peroxidase-kompleks-metoden (Ultra Sensitive TM, Maixin, Fuzhou, Kina). Snittene blev afparaffiniseret i xylen, rehydreret i gradueret alkoholserie og kogt i 0,01 M citratpuffer (pH 6,0) i 2 minutter i en autoklave. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved anvendelse af hydrogenperoxid (0,3%), som blev efterfulgt af inkubation med normalt gedeserum for at reducere ikke-specifik binding. Vævssnit blev inkuberet med TRIM-24 polyklonalt kaninantistof (1:150 fortynding) (Proteintech, Chicago, IL, USA). Kaninimmunglobulin blev anvendt som en negativ kontrol. Immunohistokemiske farvninger for Ki67 (1:200 fortynding) (Maixin, Fuzhou, Kina), RARa (1:200 fortynding) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californien, USA), p53 (1:200 fortynding) (DO-7, Santa Cruz Biotechnology), cyklin D1 (1:100 fortynding) (Cell signalering teknologi, Boston, MA, USA), p-Rb (1:200 fortynding) (Cell signalering teknologi, Boston, MA, USA) og p27 (1: 150 fortynding) (Santa Cruz Biotechnology) blev også udført. Farvning for alle primære antistoffer blev udført ved stuetemperatur i 2 timer. Biotinyleret gede-anti-muse-serum-IgG, biotinyleret gede-anti-kanin-serum-IgG (klar-til-brug) (Maixin, Fuzhou, Kina) blev anvendt som det sekundære antistof. Efter vask blev sektionerne inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret streptavidin-biotin, efterfulgt af 3, 3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid at udvikle peroxidase reaktionen. Kontrastfarvning af sektionerne blev gjort med hæmatoxylin, som var så dehydreret i ethanol før montering.

To uafhængige efterforskere undersøgt alle tumor glider tilfældigt. Fem synspunkter blev undersøgt per dias, og blev observeret 100 celler per view på 400 × forstørrelse. Immunfarvning af TRIM24 blev scoret efter en semikvantitativ skala ved at evaluere i repræsentative tumorområder, intensiteten og procentdelen af ​​celler, der viser højere immunfarvning end kontrolcellerne. nuklear farvning af tumorcellerne blev betragtet som positiv immunfarvning. Intensiteten af ​​TRIM24 nuklear farvning blev også bedømt som 0 (ingen farvning), 1 (svag), 2 (mærket). Procent scoringer blev tildelt som 1- 1-25%, 2- 26-50%, 3- 51-75% og 4- 76-100%. De snesevis af hver tumor prøve blev ganget at give en endelig score fra 0 til 8 og den samlede udtryk for TRIM24 blev bestemt som enten negativ eller lav udtryk (-): score 4 eller overekspression (+): score ≥4. Den immunhistokemiske farvning for Ki-67 blev evalueret og afsluttet som procentdelen af ​​cancerceller med nuklear immunreaktivitet med i alt 500 tumorceller undersøgt pr objektglas. Medianværdien af ​​denne serie (35% af positive celler) blev anvendt som en tærskelværdi for at skelne tumorer med lav ( 35%) versus høj (≥35%) indeks for celleproliferation. Ifølge tidligere kriterier for evaluering af cyklin D1, p53, pRb udtryk, vi bestemt deres niveau så højt eller lavt /negativ udtryk [26]. p27-ekspression blev bestemt som positiv eller negativ i henhold til tidligere rapport [27]. Ifølge tidligere kriterier blev RARa-ekspression bestemt som høj ekspression eller lav ekspression [28].

Immunofluorescens

4-um snit blev afparaffiniseret i xylen, rehydreret i graduerede alkoholserie og kogt i 0,01 M citratbuffer (pH 6,0) i 2 minutter i en autoklave. Dobbelt immunfluorescens-analyse blev udført ved anvendelse monoklonalt muse antistof mod Ki67 (Maixin), og kanin polyklonalt antistof mod TRIM24. Gede-anti-kanin (Alexa Fluor 488 mærket, Molecular Probes) og ged anti-mus (Alexa Fluor 594 mærket, Molecular Probes) blev anvendt som sekundære antistoffer. Fluorescenssignaler blev analyseret ved at registrere farvede billeder ved hjælp Olympus FV1000 Laser konfokalt.

kvantitativ real-time PCR (SYBR Green Method)

Kvantitativ realtids-PCR blev udført under anvendelse SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems) i et totalt volumen på 20 pi på 7900HT Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystems) som følger: 95 ° C i 30 sekunder, 40 cykler ved 95 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder . En dissociation trin blev udført for at fremskaffe en smeltekurve for at bekræfte specificiteten af ​​amplifikationen. β-actin blev anvendt som reference-genet. De relative niveauer af genekspression var repræsenteret ACt = Ct-gen-Ct reference, og folden ændring af genekspression blev beregnet med 2-ΔΔCt metode. Forsøg blev gentaget tre gange. Primersekvenserne er som følgere: TRIM24 fremadrettet, 5’CGCCACCCAAGTTGGAGT 3 ‘, TRIM24 reverse, 5’ GCTGGGAACCTCAGTAGTGTCCT 3 ‘; β-actin fremadrettet, 5’ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC 3 ‘, β-actin reverse, 5’ CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG 3 ‘. MMP2 fremad, 5’-TGTGTTCTTTGCAGGGAATGAAT-3 ‘; MMP2 omvendt, 5’-TGTCTTCTTGTTTTTGCTCCAGTTA-3 ‘; MMP9 fremad, 5’-CCTCTGGAGGTTCGACGTGA-3 ‘; MMP9 omvendt, 5’-TAGGCTTTCTCTCGGTACTGGAA-3 ‘;

Western blot analyse

I alt proteiner fra cellelinier blev udvundet i lysis buffer (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) og kvantificeret ved hjælp af Bradford metode. Halvtreds mikrogram protein blev separeret ved SDS-PAGE (12%). Efter overførsel, den polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA, USA) blev inkuberet natten over ved 4 ° C med de følgende antistoffer -TRIM24 (1:1000; Proteintech, Chicago, IL, USA), p53 (DO- 7, 1:500), RARa (1:500), beta-Actin (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), cyklin A (1:1000), cyklin B (1:1000), cyklin D1 (1:1000), cyclin D2 (1:1000), cyclin D3 (1:1000), cyclin E (1:800), CDK2 (1:1000), CDK4 (1:1000), CDK6 (1:1000) , p-Rb (1:2000), P21 (1:800), P27 (1:800) (cellesignalering teknologi, Boston, MA, USA). Efter inkubation med peroxidase-koblet anti-muse /kanin-IgG (Santa Cruz Biotechnology) ved 37 ° C i 2 timer blev bundne proteiner visualiseret under anvendelse af ECL (Thermo Fisher Scientific) og påvist under anvendelse Bioimaging Systems (UVP Inc., Upland, CA, USA). De relative protein niveauer blev beregnet på grundlag af β-actin som lastning kontrol.

Små interfererende RNA Behandling

On-TargetPlus SMARTpool siRNA for TRIM24 (M-005387-03-0005) og ON -TARGETplus Non-targeting siRNA # 1 (D-001810-01-20) blev købt fra Dharmacon. For transfektioner blev celler podet i en 24-brønds plade 24 timer før forsøget. Cellerne blev transficeret med siRNA hjælp af DharmaFECT 1 (0,20 pl /brønd; ThermoFisher Scientific) ifølge fabrikantens protokol. Efter transfektion blev mRNA og protein niveauer vurderet 48 timer senere.

Cell Proliferation Test og kolonidannelse Assay

Celleproliferation assay blev udført under anvendelse af Cell Counting Kit-8-opløsning (Dojindo, Gaithersburg, MD) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev cellerne podet ved en koncentration på 5 × 10

3 celler /100 pl /brønd i 96-brønds dyrkningsplader og behandlet med 10 pl /brønd af Cell Counting Kit-8 løsning under de sidste 4 timer af kulturen . Optisk densitet af brøndene blev målt ved 450 nm under anvendelse af en mikropladelæser. For kolonidannelse assayet blev celler plantes i tre 6-cm celle dyrkningsskåle (1000 pr skål for A549 og H1299 cellelinier) og inkuberet i 12 dage. Pladerne blev vasket med PBS og farvet med Giemsa. Antallet af kolonier med mere end 50 celler blev talt.

Cell Cycle Analysis

Celler (500.000) blev podet i 6-cm vævskulturskåle. Tolv timer senere, blev celler transficeret med angivne mængder siRNA. Celler blev synkroniseret efter en 20 h serumudsultning og derefter tidspunkter taget 24 timer efter påføring af 10% serum medie at måle virkninger på cellecyklussen. Celler blev høstet, fikseret i 1% paraformaldehyd, vasket med phosphatpufret saltvand (PBS) og farvet i 5 mg /ml propidiumiodid i PBS suppleret med RNase A (Roche, Indianapolis, IN) i 30 minutter ved stuetemperatur. Data blev opsamlet under anvendelse af BD-systemer.

Matrigel Invasion Assay

Cell invasion assay blev udført under anvendelse af en 24-brønds Transwell kammer med en porestørrelse på 8 um (Costar, Cambridge, MA). Indsatsene blev overtrukket med 20 ul Matrigel (1:03 fortynding, BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne trypsiniseret og 3 × 10

5-celler i 100 pi serumfrit medium blev overført til den øvre Matrigel kammer og inkuberet i 16 timer. Medium suppleret med 10% FBS alene eller indeholdende 100 ng /ml EGF (Invitrogen, Carlsbad, Carlsbad, CA) blev tilsat til det nederste kammer som kemoattraktant. Efter inkubation blev ikke-besatte celler på den øvre membranoverfladen fjernes med en vatpind, og de celler, der passerede gennem filteret blev fikseret med 4% paraformaldehyd og farvet med hematoxylin. Antallet af invaderede celler blev talt i 10 tilfældigt udvalgte høj effekt felter under mikroskop. Dette eksperiment blev udført tre gange.

Apoptose Analyse

Til påvisning af apoptose blev adhærente celler både opsamlet og resuspenderet i kold PBS til analyse. Celler blev farvet med Annexin V-FITC Apoptose Kit (BD Pharmingen, USA) for at overvåge apoptose-celler og propidiumiodid (PI) til påvisning af døde celler. Data blev opsamlet under anvendelse af BD-systemer.

transient transfektion og Luciferase Reporter Assay

reportergen transfektion og luciferaseaktivitet assay celler i 80 sammenflydende vokser på en brøndsplader 24 blev co-transficeret med ildflueluciferase reporter af P53 indeholdende en TA-promotor (pp53-TA-luc, Beyotime Biotechnology, Kina) (0,2 ug) sammen med Renilla luciferase reporter (Promega Co.) (0,02 ug) i 12 h under anvendelse af en attractene reagens (QIAGEN) i overensstemmelse med protokollerne leveret af fabrikanterne.

luciferaseaktiviteten blev målt i de cellulære ekstrakter under anvendelse af en dobbelt luciferase rapporteret gen (Promega, CA, USA). Den relative aktivitet af reportergenet blev beregnet ved at dividere signaler af p53 luciferase reporter ved signaler opnået formular Renilla luciferase reporter.

Statistical Analysis

SPSS-version 16.0 for Windows blev anvendt til alle analyser.