PLoS ONE: NPM1 Silencing Reducerer Tumor vækst og MAPK Signalering i Prostata Cancer Cells

Abstrakt

chaperone nucleophosmin (NPM1) er overudtrykt i epitel rum i prostata tumorer i forhold til tilstødende sunde epitel og kan repræsentere en af ​​de centrale aktører, der understøtter neoplastiske fænotype af prostataadenokarcinomceller. Men de mekanismer, der ligger til grund NPM1 medieret fænotype forbliver undvigende i prostata. For bedre at forstå NPM1 funktioner i prostata kræftceller, vi søgte at karakterisere dens indvirkning på prostatakræft celler adfærd og afkode de mekanismer, som den kan virke. Her viser vi, at NPM1 favoriserer prostata tumorcellemigration, invasion og kolonidannende. Desuden knockdown af NPM1 fører til et fald i væksten i LNCaP-afledte tumorer podet i nøgne mus

in vivo

. Sådanne onkogene-lignende egenskaber findes i forbindelse med en positiv regulering af NPM1 på ERK1 /2 (Ekstracellulær signal-Reguleret kinaser 1/2) kinase-phosphorylering som reaktion på EGF (epidermisvækstfaktor) stimulus, hvilket er kritisk for prostatakræft progression efter oprettelse af en selvstændig produktion af vækstfaktoren. NPM1 kunne så være et mål at slukke specifikt ERK1 /2-aktivering for at mindske eller hæmme kræft cellevækst og migration

Henvisning:. Loubeau G, Boudra R, Maquaire S, Lours-Calet C, Beaudoin C, Verrelle P, et al. (2014) NPM1 Silencing Reducerer Tumor vækst og MAPK Signalering i prostatacancerceller. PLoS ONE 9 (5): e96293. doi: 10,1371 /journal.pone.0096293

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA

Modtaget: 9 oktober, 2013; Accepteret: April 6, 2014; Udgivet: 5 maj 2014

Copyright: © 2014 Loubeau et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), og af regionen Auvergne. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

progression af prostatakræft er forbundet med ændringer af centrale gener, der styrer cellens homeostase, deres deregulering og /eller forstærkning fører til øget celledeling og invasive kapacitet. Vi har tidligere identificeret

NPM1

(nucleophosmin 1) som et af de gener, hvis ekspression er forøget betydeligt i prostata tumorceller sammenlignet med ikke-tumor tilstødende væv [1], hvilket indikerer, at NPM1 kunne virke som en forstærker af prostata cancer progression. NPM1 er et stort multifunktionelt phosphoprotein akkumuleret på højt niveau i den granulære region nucleolus og er i stand til at shuttle mellem nucleolus, den nukleoplasma og [2] cytoplasma. På grund af sin nucleolar lokalisering, dens iboende RNase, og dens forbindelse med modning pre-ribosomale ribonucleoproteiner har NPM1 været først foreslået at regulere ribosomale RNA transskription og forarbejdning. Imidlertid NPM1 blevet mere for nylig vist at vise chaperone aktiviteter. Det binder til histoner, begunstiger DNA-histon samling, medierer nukleosom dannelse og afslapper chromatin [3] og dermed styrer genekspression. NPM1 interagerer også med en bred vifte af maturating proteiner til at inducere deres korrekt foldning i den aktive tilstand. Blandt de proteiner, der er celle vækstregulatorer såsom oncoproteinet MDM2 (Mouse Double Minute 2-homolog). Endvidere NPM1 binder til og inhiberer tumor suppressor proteiner P53 og Rb (retinoblastom) [4] fremhæve, at NPM1 kunne have en rolle i onkogene processer. Nogle af de NPM1 specifikke interaktioner med cellecyklus regulatorer er allerede blevet klarlagt, men dens rolle i opførsel af faste tumorceller, samt dens integration i cellen signalosom er endnu ikke fastlagt. Her fat vi spørgsmålet om, hvorvidt NPM1 kan forstærke proliferation, migration og invasion kapacitet prostata kræftceller. I denne undersøgelse rapporterer vi, at niveauet af NPM1 i prostatacancerceller regulerer specifikt EGF ekspression og MAPK (mitogenaktiveret proteinkinaser) signalvejen. Vi viser også, at høje niveauer af NPM1 positiv indvirkning celledeling og celle migration, og dermed deltager i kontrollen af ​​tumorvækst.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle dyr blev opretholdt i et kontrolleret miljø og dyrs pleje blev gennemført i overensstemmelse med den nationale standard politikker (C 63 014.19). Alle forsøg blev godkendt Auvergne Regional etiske komité, Frankrig (protokol CE09-08).

Cell kultur og stabil transfektion

LNCaP (lymfeknuder Carcinoma Prostata) celler blev dyrket i phenolrødt Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI 1640, Life Technologies, Saint-Aubin, Frankrig) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) og inkuberet i standardbetingelser (37 ° C, 5% CO

2).

Celler blev inficeret i henhold til producentens anvisninger med lentivirale partikler indeholdende enten tre målspecifikke konstruktioner (shNPM1) eller ubeslægtede sekvenser (shScr, srambled) (sc-29771-V, Santa Cruz, Heidelberg, Tyskland). Efter infektion puromycine (1 ug /ml) blev tilsat til dyrkningsmediet for at udvælge stabilt transducerede celler og til at udføre monoklonalt markering.

Sårheling migration assay Salg

Kontrol LNCaP-celler (shScr ) og NPM1 bankede-down LNCaP-celler (shNPM1) blev podet i 24-brøndsplader og dyrket til konfluens i 24 timer. Den monolagskultur blev derefter skrabe-såret med en steril mikropipette spids for at skabe et hul på konstant bredde. Cellerester blev vasket med phosphatbufret saltvand 1 × (PBS) (Life Technologies). Celler blev dernæst dyrket i RPMI 1640 10% FBS, der blev udskiftet 12 timer efter sårdannelse og derefter hver 24 timer. LNCaP celle migration blev fotograferet i den sårede område ved 24, 48 og 72 timer efter skrabning (100 × forstørrelse) og de resterende sår områder blev derefter kvantificeret med ImageJ gratis software.

Boyden Chamber invasion assay

i cellemigrationsassay, 3 × 10

5 shScr og shNPM1 LNCaP-celler dyrket i serumfrit RPMI 1640 blev podet i den øvre brønd i en Transwell kammer system. Medium indeholdende 10% FBS blev tilsat til det nederste kammer. Efter inkubation i 24 til 48 timer blev de ikke-migrerede celler fjernes med den øvre brønd. De celler, der migrerede til bunden insert overflade blev derefter fikseret med methanol og farvet med en 5% Giemsa opløsning. Fem tilfældige felter blev fotograferet (200 × forstørrelse) og celler blev kvantificeret med ImageJ gratis software som middelværdi ± SD af kolonier optalt pr felt.

Bløde agar kolonidannelse assays

Six-brønde plader blev fremstillet med 2 ml /brønd af en varm opløsning af 0,6% lavtsmeltende agarose (agarose Sea Plaque FMS produkt lavtsmeltende, 50101, Lonza, Ozyme, Montigny-le-Bretonneux, Frankrig) i RPMI 1640, 10% FBS. Efter størkning blev 5 × 10

3 i shScr eller shNPM1 LNCaP-celler udpladet pr brønd i en opløsning af 500 pi 0,3% agarose i RPMI 1640 medium indeholdende 10% FBS. Pladerne blev derefter inkuberet i RPMI 1640, 10% FBS-medium, der blev ændret hver 3-4 dage. Efter 2 uger blev kolonidannelse kvantificeret ved hjælp af ImageJ gratis software: kolonier blev fotograferet (100 × forstørrelse) på 5 forskellige områder, og den relative koloni nummer blev beregnet som gennemsnit ± SD af kolonierne talt pr felt

klongenicitetsassayet

1 × 10

4 shScr og shNPM1 LNCaP-celler blev podet i 6-brøndsplader i RMPI 1640, 10% FBS-medium. Medium blev ændret hver 3 dage. Efter 2 uger blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket med PBS 1 × derefter fikseret med methanol og farvet med en 5% Giemsa opløsning. Foci-dannelse blev evalueret og kolonidannelse blev kvantificeret under anvendelse af ImageJ free software: kolonier blev fotograferet (100 ganges forstørrelse) på 5 forskellige områder, og den relative koloni nummer blev beregnet som middelværdi ± SD af kolonierne optalt pr felt

Celleproliferationsassay

Celleproliferation blev bestemt under anvendelse Celleproliferation ELISA BrdU (bromdeoxyuridin) kolorimetrisk kit (Roche) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt 5 × 10

3 shScr eller shNPM1 LNCaP-celler per brønd blev podet i en 96-brøndplade. De blev dyrket i 24 timer i RPMI 1640 medium, 10% FBS i nærvær af fravær af EGF (E9644, Sigma). Derefter blev BrdU mærkning opløsning tilsat ved en endelig koncentration på 10 pM i 2,5 timer. Efter fiksering blev cellerne inkuberet med anti BrdU-POD-opløsning i 1 time, og absorbansen blev målt ved 655 nm.

Western Blotting

Proteiner blev ekstraheret under anvendelse HEPES 20 mM, NaCl 0,42 M , MgCl

2 1,5 mM, EDTA 0,2 mM, og Nonidet P-40 1% suppleret med phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) 1 mM (Sigma), proteaseinhibitorer (Complete 1X, Roche), NaF 0,1 mM, og Na

3VO

4 0,1 mM (Sigma). Fyrre ug af totale proteiner blev derefter udsat for denaturering SDS-PAGE og overført til nitrocellulose Hybond-ECL-membran (GE Healthcare Life Sciences, Velizy-Villacoublay, Frankrig). Detekteringer blev udført under anvendelse af antistoffer dannet mod β-actin (A2066, Sigma), NPM1 (sc-6013-R, Santa Cruz, Heidelberg, Frankrig), EGFR (epidermal vækstfaktor receptor, NB100596, Novus), phospho-EGFR Tyr 1068 ( 2236S, Cell Signaling, Ozyme), ERK1 /2 (M5670, Sigma, Saint-Quentin Fallavier, Frankrig), phospho-ERK1 /2 P42 /44 (9101S, Cell Signaling, Ozyme) AKT (9272, Cell signalering, Ozyme), phospho-AKT Ser473 (2118-1 Epitomics) og afslørede med peroxidase-konjugeret anti-kanin IgG (Immunoglobulin G, PARIS, Compiegne, Frankrig) under anvendelse af en Western Lightning System kit (PerkinElmer, Villebon sur Yvette, Frankrig). Signal kvantificering blev udført ved hjælp Mængde One-software (Bio-Rad).

Promoter konstruere, transfektion og luciferaseassays

Initiativtageren menneskelige EGF fragment (-392 /+ 123) blev genereret med følgende primere: 5′-GATCAAGCTTGGGCTGAAGGTGAACTATCTTTAC-3 ‘(fremad) og 5′-GATCCTCGAGGACAGAGCAAGGCAAAGGCTTAGA-3’ (bagside), derefter klonet i HindIII /Xhol restriktionssteder i en pGL3-basic Vector (Promega, Charbonnieres, Frankrig). Den konstitutivt aktive MAP kinase kinase kinase1 (caMEKK1) ekspressionsplasmid var en venlig gave fra Dr. Dirck Bohmann (University of Rochester Medical Center, Rochester, USA). shScr og shNPM1 LNCaP-celler blev transficeret 24 timer efter podning med pGL3-hEGF og /eller caMEKK1 plasmider i OPTI-MEM hjælp Metafectene transfektant ifølge producentens instruktioner (Biontex, Martinsried-Planegg, Tyskland). Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne lyseret i Reporter lysisbuffer 1 × (Promega), og luciferaseaktiviteten blev målt ved anvendelse af Genofax A luciferaseassaykit (Yelen, opstå la Redonne, Frankrig).

Fremstilling af RNA og real-time kvantitativ PCR

Totalt cellulært RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRlzol-reagens (Life Technologies) og cDNA blev syntetiseret med 200 U Moloney murin leukæmivirus-revers transkriptase (Promega), 5 pmol vilkårlige primere ( C1181, Promega), 40 U RNAsin (Promega), og 2,5 mM deoxynukleotidtriphosphat. mRNA niveauer blev kvantificeret på en Mastercycler ep Realplex (MasterCycler2, Eppendorf, Le Pecq, Frankrig) med Mesagreen QPCR Mastermix Plus for SYBR (Promega). Sekvenser af primerne er følgende: NPM1, 5′-ATGGAAGATTCGATGGACATGG-3 ‘(Forward) og 5′-CGAGAAGAGACTTCCTCCACTGC -3 «(Reverse); PCNA, 5’-TGCCTTCTGGTGAATTTGCACGT-3 ‘(Forward) og 5’ACCGTTGAAGAGAGTGGAGTGGC-3′ (Reverse), Actin, 5’-CGCGAGAAGATGACCCAGATC-3 ‘(Forward) og 5’TCACCGGAGTCCATCACGA-3’ (Reverse) (Eurogentec, Angers , Frankrig). Til human EGF blev primere indkøbt fra Qiagen (PPH00137B-200, Qiagen, Courtaboeuf, Frankrig).

In vivo

Nude mus tumor xenograftmodel

ShScr og shNPM1 LNCaP cellerne blev dyrket til sammenflydning og derefter resuspenderet i matrigel (BD matrigel basalmembranmatrix phenolrødtfrit, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Frankrig) til en koncentration på 9 x 10

6 celler /ml. Tre hundrede pi af cellesuspensionen (ca. 3 × 10

6 celler) blev injiceret subkutant i 6 uger gamle nøgne mus (Swiss nu /nu, Charles River, L’Arbresle, Frankrig). Sygdomsprogression blev overvåget dagligt, baseret på et sæt af generelle wellness kriterier, som dyret pleje udvalg og body mass blev registreret tre gange om ugen, indtil en forudbestemt slutpunkt blev nået. Endepunkter omfattede: dehydrering og /eller vægttab på over 10%, tegn på åndedrætsbesvær, kropsvægt stigning på over 5 g fra gennemsnittet. Tumorer blev målt tre gange om ugen ved anvendelse af en elektronisk skydelære siden tydelige tumorer kunne påvises. Mus blev aflivet ved cervikal dislokation under anæstesi gas. Xenotransplantater blev derefter fjernet, vejet og lynfrosset i flydende nitrogen til RNA og protein analyser.

Statistical Analysis

Alle assays blev udført i mindst 3 uafhængige forsøg. Standard fejl blev beregnet for hver middelværdi, og statistiske forskelle mellem grupper blev bestemt ved Students

t

testen eller ikke-parametrisk Mann Whitney U test anvendelse af Prism software. For langsgående analyser blev en random-effekt model (blandet model) anses for at studere faste effekter gruppen (NPM1 udtryk), tidspunkter og interaktion gruppe × tid under hensyntagen til mellem og inden emne variabilitet (tilfældige effekter hældning og skæringspunkt).

Resultater

NPM1 regulerer klonogene og proliferative kapacitet prostata tumorceller

for at analysere virkningen af ​​NPM1 på prostata tumorcelleproliferation, vi valgte en knockdown strategi og genererede LNCaP-celle underlinjer stabilt udtrykker kontrol (shScr) eller NPM1 specifik shRNA (shNPM1). Som vist i figur 1a, falder NPM1 mRNA-niveau på mere end 50% og NPM1 proteinekspression med mere end 30% i shNPM1 celler, men dette er ikke forbundet med ændringer i cellemorfologi. Imidlertid NPM1 knockdown ændrer evnen hos LNCaP-celler til at danne kolonier efter podning ved lav konfluens (figur 1b). Dette fald af klonogene kapacitet falder sammen med et fald i den celleproliferative potentiale (figur 1c). Faktisk nedregulering af NPM1 fører til et fald i BrdU-inkorporering 30% og dette er forbundet med et fald i mRNA-niveauet af PCNA (Prolifererende cellekerneantigen), en central markør for celleproliferation (figur 1d) 60%. Interessant nok NPM1 knockdown ikke ændre celleoverlevelse som vurderet af PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase) spaltning analyser ved western blotting (fig S1), hvilket viser, at dette fald i proliferationshastigheden ikke er forbundet med en forøgelse af apoptose. Disse resultater viser derfor, at NPM1 er involveret i stigningen i spredning og klonogene kapacitet prostata tumorceller.

(a) NPM1 knockdown ændrer ikke LNCaP celler morfologi. LNCaP celler blev stabilt transficeret med kontrol shRNA (shScr) eller specifik NPM1 shRNA (shNPM1). NPM1 mRNA og proteinniveauer blev analyseret ved RT-qPCR og western blotting hhv. Morfologi af celler blev observeret af inverteret mikroskopi og fotograferet. (B) NPM1 knockdown inhiberer LNCaP-celler clonogenicity. Celler blev podet ved lav konfluens mere end en uge, derefter fikseret med methanol og farvet med 5% Giemsa blue før mikroskopisk observation. Billeder er repræsentative for tre uafhængige forsøg med ensartede resultater. Grafen viser antallet af cellekloner ( 50 celler) i shNPM1 tilstand, beregnet som middelværdien ± SD af antallet af kloner optalt pr marken på 5 tilfældige områder, ved hjælp af ImageJ gratis software og udtrykt relativt til antallet af kloner talt i kontrolgruppen tilstand. (C, d) NPM1 kontrol proliferation af prostatacancerceller. Fem tusinde celler blev podet per brønd i en 96 brønde plade og dyrket i 48 timer. (C) Celler blev derefter inkuberet med en BrdU mærkning opløsning i 2,5 timer og BrdU-inkorporering blev målt ved densitometrisk analyse på 655 nm. (D) Proliferation blev også analyseret ved RT-qPCR assay ved at vurdere PCNA relative mRNA-niveau akkumulering normaliseret under anvendelse β-actin mRNA-niveau. Alle data er repræsentative for mindst tre uafhængige tredobbeltforsøg og BrdU inkorporering som gennemsnit af tredobbeltforsøg af 96 point hver. Data udtrykkes som middelværdien ± SD.

NPM1 indvirkning på proliferation er forbundet med kontrol af migration, invasion, tre-dimensionelle vækst kapacitet prostata kræftceller og tumorvækst

de ovenstående resultater viser, at NPM1 udøver en kontrol på det klonogene kapacitet prostatacancerceller og foreslår, at ud over dets virkning på den celleproliferative sats, kan det også bidrage til både tumorvækst og aggressivitet. For yderligere at evaluere rolle NPM1, vi undersøgte invasion og migration kapacitet shNPM1 LNCaP celler. Knockdown af NPM1 faldt betydeligt invasionen af ​​LNCaP-celler gennem Matrigelcoatede filtre med 40% (figur 2a). Vi vurderes yderligere LNCaP migration celler evne ved fysisk sårede celler udpladet på celledyrkningspladerne. Som vist i figur 2b, efter 72 timer efter at være blevet skrubbet, shNPM1 celler var ude af stand til at rekolonisere blottede zone som hurtigere som gjorde kontrolceller. For at teste, om faldet i migrations- og invasion kapacitet er ledsaget af et fald i de tredimensionale vækst evner shNPM1 LNCaP celler,

in vitro

tests i blød agar blev udført (figur 2c). Fald i NPM1 i LNCaP celler næsten ophæver deres evne til at danne 3-D kolonier. Disse resultater fra

in vitro

analyser tyder på, at NPM1 regulerer vandrende og invasive egenskaber af prostata kræftceller.

(a) NPM1 styrer migration kapacitet LNCaP celler. Celler blev podet ved konfluens for at skabe et sår 24 timer senere. Viklet rekolonisering blev observeret efter 72 timers dyrkning ved inverteret mikroskopi og fotograferet. Histogrammer viser sår område kvantificering ved hjælp af ImageJ og billederne er repræsentative for tre uafhængige forsøg med ensartede resultater. (B) NPM1 knockdown hæmmer invasive potentiale prostatacancerceller. shScr og shNPM1 LNCaP-celler blev podet ved konfluens i RPMI 1640 serumfrit medium på matrigel coated mikroporøs membran. 48 timer senere, migrerede celler til stede på den modsatte side af membranen blev fikseret og farvet med 5% Giemsa blå og observeret ved mikroskop (200 x forstørrelse). Grafen viser antallet af celler i shNPM1 tilstand, beregnet som middelværdien ± SD af antallet af talte celler pr marken på 5 tilfældige områder, ved hjælp af ImageJ gratis software og udtrykt relativt til antallet af celler tælles i kontrolgruppen tilstand . (C) NPM1 virkninger tredimensionale vækst af prostatacancerceller. Kontrol eller NPM1 slået ned celler blev podet ved lav konfluens på agarose /RPMI 1640 10% FBS i 2 uger. Antal og størrelse af de nye kloner blev derefter observeret under omvendt mikroskop (x100) og fotograferet. Grafen viser antallet af cellekloner ( 50 celler) i shNPM1 tilstand, beregnet som middelværdien ± SD af antallet af kloner optalt pr marken på 5 tilfældige områder, ved hjælp af ImageJ gratis software og udtrykt relativt til antallet af kloner talt i kontrolgruppen tilstand. (D, e, f, g) NPM1 knock-down ophæver tumorigenicitet af LNCaP-celler, når de injiceres i nøgne mus. shScr (n = 14) og shNPM1 (n = 14) LNCaP-celler blev subkutant podet på nøgne mus og tumorvolumen blev målt hver 2 dage efter indpodning (d). Grafen i (e) er den kvantificering af shScr og shNPM1-afledte tumorer volumen på dag 24 efter injektion. NPM1 relative ekspressionsniveau blev bedømt ved western blotting i tumorer når musene blev aflivet (f) og tumorvægt blev målt (g). De data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg, og er udtrykt som middelværdi ± SD.

For yderligere at fastlægge den rolle, NPM1 i prostatakræft, vi analyserede tumorudvikling af shNPM1 LNCaP og shScr LNCaP prostata cancer cellelinjer

in vivo

efter subkutan injektion i flanken af ​​mandlige nøgne mus. ShNPM1 celler producerer mindre tumorer (figur 2d, e) og i modsætning til shScr LNCaP-celler, er mere tilbøjelige til at producere nogen tumor overhovedet når podet (figur 2e). I detaljer, tumorer initieret fra LNCaP kontrolceller vises 22 dage efter injektion henviser tumorer med oprindelse fra LNCaP shNPM1 celler er mærkbare kun på 24 dage efter injektion. Endvidere vækstkurver aldrig få parallel selv efter 29 dage (figur 2D). Således tumorer initieret fra NPM1 bankede-down celler forblev mindre end kontrol- tumorer med 85% fald i det gennemsnitlige tumorvolumen (figur 2e). Denne vigtige fald i tumorvolumen resulterer i en formindskelse på 95% af tumorvægt fra LNCaP shNPM1 celler (figur 2g). Dette fald er usandsynlig på grund af et tab af udtryk for den anti-NPM1 shRNA da alle shNPM1 tumorer bevare et fald i NPM1 akkumulation (figur 2f) 90%. Tilsammen disse data viser tydeligt, at NPM1 er involveret i prostata tumorvækst

in vitro

in vivo

.

NPM1 er involveret i kontrollen af ​​EGF udtryk

for bedre at forstå, hvordan NPM1 kan fremme prostatacancer celle adfærd, udførte vi en qPCR Array analyse (RT2 ProfilerTM array, PAH’er-121A-2, Qiagen) og bestemmes arten af ​​gener, hvis transskription niveauer moduleres af den knockdown af NPM1 (data ikke vist). Blandt de 84 gener plettet på arrayet, epidermal vækstfaktor (EGF) mRNA akkumulering var den mest signifikant reduceret i LNCaP shNPM1 celler. Denne modulation af EGF udtryk resulterer ikke fra et globalt hæmmende effekt på genekspression som de fleste af generne er upåvirkede eller opreguleret når NPM1 reduceres (data ikke vist). Dette resultat blev bekræftet ved RT-qPCR assays som EGF-mRNA akkumulering faldt med 40% i LNCaP shNPM1 celler (figur 3a). Desuden, for at teste den relative aktivitet af EGF initiativtagerens genaktivitet i LNCaP shSCR og shNPM1 celler, transficerede vi disse celler med en phEGF-luciferasereporterplasmid. Knockdown af NPM1 inducerer et fald i EGF promotoraktivitet, hvilket viser, at effekten af ​​NPM1 sandsynligvis blive udøvet på det transskriptionelle niveau (figur 3b). Disse resultater antyder, at NPM1 direkte eller indirekte kontrollerer EGF ekspression. Som EGF er kendt for specifikt at aktivere EGF-receptoren (EGFR), undersøgte vi, om aktiveringen af ​​EGFR-komplekset samt aktiveringen af ​​dens nedstrømseffektorer, ERK1 /2 og AKT, moduleres ved NPM1 ekspressionsniveauet. På baggrund af analysen af ​​deres fosforylering status, viser vi, at aktivering af EGFR (pEGFR) og ERK1 /2 (pErk1 /2) er faldet drastisk eller næsten afskaffet, når ekspressionen af ​​NPM1 hæmmes (figur 3c). Interessant, AKT phosphorylering er mindre følsom over for en sådan inhibering, hvilket antyder, at NPM1 specifikt påvirker MAPK-vejen (figur 3c). Disse virkninger af NPM1 på EGF udtryk og ERK1 /2 vej tyder på, at NPM1 kunne inddrages i fastsættelsen af ​​EGF selvregulering loop.

(a) NPM1 kontrollerer EGF udtryk. Relative EGF-mRNA-niveauer i forhold til p-actin blev analyseret ved RT-qPCR i LNCaP-celler, der udtrykker kontrol (shScr) eller NPM1 specifik shRNA (shNPM1). (B) EGF promotor NPM1 kontrolaktivitet. shScr og shNPM1 LNCaP-celler blev transficeret med phEGF-luciferasereporterplasmid. EGF-promotor-aktivitet blev evalueret ved måling af luciferaseaktiviteten 24 timer senere. Resultaterne af assayet blev standardiseret under anvendelse af CMV-promotoren som kontrol og udtrykt som fold-induktion i kontrolceller (shScr). (C) NPM1 styrer aktivering af EGF /EGFR pathway nedstrømseffektorer. Proteiner, ekstraheret fra shScr og shNPM1 LNCaP-celler dyrket i RPMI 1640 10% FBS, blev underkastet elektroforese ved SDS-PAGE. Overførte membraner blev immunoblottedes med viste antistoffer. Histogrammer viser bandet kvantificering rapporteres til β-actin niveau. Blots er repræsentative for tre uafhængige forsøg med konsistente resultater. Data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg, og er udtrykt som middelværdi ± SD.

NPM1 specifikt potenserer MAPK pathway aktivitet for at fremme spredning og migration kapacitet prostatacancerceller

de ovenstående data demonstrerer, at NPM1 er involveret i kontrollen af ​​EGF-ekspression, en vækstfaktor, som styrer MAPK-vejen og fremmer tumorigene opførsel af prostatacancerceller. Så spekulerede vi hvis det var grunden til, at shNPM1 LNCaP celler viser formindsket tumorigen adfærd. Vi undersøgte således, om en eksogen indtagelse af EGF kunne redde aktiveringen af ​​EGF /EGFR pathway effektorer og efterfølgende øge LNCaP celler proliferation og migration. Kontrol (shScr) eller NPM1 slået ned (shNPM1) LNCaP celler blev udsultet for at slukke signalveje og derefter behandlet med EGF.

Western blot-analyser viser, at en eksogen tilskud EGF fører til fosforylering,

dvs

, aktivering af både EGF-receptoren, og en af ​​dens downstream mål, AKT, både shScr og shNPM1 celler. Tværtimod og mest interessant, phosphorylering af ERK1 /2 er specifikt nedsat i shNPM1 celler (figur 4a). I overensstemmelse med dette resultat, tilsætning af exogent EGF kan ikke genskabe migration og invasion kapacitet shNPM1 LNCaP-celler i de tilsvarende assays (figur 4b, c). Disse resultater viser klart, at NPM1 specielt kræves for aktiveringen af ​​MAPK-signalvejen, og at potensering af denne transduktion pathway er involveret i kontrollen af ​​proliferation og migrering kapacitet prostatacancerceller.

(a) NPM1 nedregulering hæmmer EGF inducerede ERK1 /2 pathway aktivitet. shScr og shNPM1 LNCaP celler blev behandlet med 100 nM EGF og fosforylering af EGF /EGFR pathway effektorer blev analyseret ved hjælp af Western blotting. Histogrammer viser bandet kvantificering rapporteres til β-actin niveau. Blottet repræsenterer tre uafhængige forsøg med konsistente resultater. (B) På trods af behandling EGF, migration kapacitet LNCaP faldet for NPM1 ikke blev gendannet. Sårlukning blev analyseret 72 timer efter kontinuerlig behandling med 100 nM EGF. Celler blev observeret under omvendt mikroskop og fotograferes. Histogrammer viser sår område kvantificering hjælp ImageJ. (C) EGF behandling ikke redde proliferation af NPM1 knockdown LNCaP-celler. BrdU inkorporering assay blev udført i shScr og shNPM1 LNCaP 100 behandling 24 timer efter nM EGF. Densitometri blev målt ved 655 nm. Dataene er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg og er udtrykt som middelværdi ± SD.

NPM1 virker opstrøms for MEK1 og nedstrøms for EGFR at aktivere MAPK-vejen, til styring af en EGF self -forordning løkke i prostatacancerceller

som phosphorylering af ERK1 /2 er specifikt nedsat hos shNPM1 celler selv i nærvær af EGF, antyder det, i MAPK-vejen, NPM1 virker opstrøms for ERK1 /2. For at identificere effektor (e) af EGFR-inducerede signalvej, som NPM1 kan handle, og at afgøre, om NPM1 handling er direkte eller ikke om Globaliseringsfonden genet, vi udførte transfektionsanalyser med en konstitutivt aktiv form af MEKK1 (caMEKK1) : caMEKK1 phosphorylerer ERK1 /2 kinase MEK1 /2, og derved, konstitutivt aktiverer ERK1 /2 i fravær af MEK1 /2-inhibering. I shScr LNCaP-celler, caMEKK1 transfektion inducerer phosphorylering af ERK1 /2. I shNPM1 LNCaP-celler caMEKK1 transfektion inducerer en lignende virkning, således redning EGFR-signalvejen (figur 5a). Dette resultat antyder, at NPM1 målretter MAPK-vejen nedstrøms for EGFR, men opstrøms for MEK1 /2 for at regulere ERK1 /2. Endvidere cotransfektion af caMEKK1 konstruktionen med en phEGF-luciferasereporterplasmid også redder EGF promotoraktiviteten (figur 5b) i LNCaP-celler slået ned for NPM1. Disse resultater viser, at 1- det usandsynligt, at NPM1 direkte transaktiverer promotoren EGF i prostatacancerceller. 2- NPM1 kan snarere stimulere MAPK signalvejen for at øge transkription af genet EGF. 3- Phosphorylering data om AKT og ERK1 /2 antyder kraftigt, at NPM1 virker på niveauet for MEKK1 eller Ras /Raf i denne pathway.

(a) ERK1 /2-aktivering reddes af caMEKK1. shScr og shNPM1 LNCaP-celler transficeres med en konstitutivt aktiveret konstrukt ifølge MEKK1 (caMEKK1) og ERK1 /2 phosphorylering niveau blev analyseret under anvendelse western blotting. (B) ERK1 /2-aktivering gendanner EGF promotoraktivitet i LNCaP-celler nedreguleret til NPM1. LNCaP shSCR og shNPM1 celler blev forbigående cotransficeret med phEGF-luc og caMEKK1. EGF-promotor-aktivitet blev evalueret ved måling af luciferaseaktiviteten 24 timer efter. Resultaterne af assayet blev standardiseret mod kontrol reporter aktivitet CMV-Luc og udtrykt som fold-induktion i kontrolceller (shScr). Data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg, og er udtrykt som middelværdi ± SD.

Diskussion

NPM1 spiller en væsentlig rolle i cellevækst og proliferation. Blandt andet det favoriserer cellecyklusprogression, ribosom biogenese og centrosom dobbeltarbejde [5] – [7]. Følgelig har en sammenhæng mellem øget NPM1 ekspressionsniveauer og tumorprogression er etableret i en lang række faste tumorer i forskellige histologiske oprindelser såsom i gastric- [8], [9], colon [9], nyre [10] eller ovarie kræft [11]. Ikke desto mindre adskillige undersøgelser afslørede, at paradoksalt nok NPM1 er i stand til både fungere som en tumorsuppressor og som et proto-onkogen under tumorigenese [12]. På den ene side NPM1 deltager til opretholdelse af kromosom stabilitet og regulerer ARF aktivitet [13], og på den anden side NPM1 fremmer inhiberingen af ​​flere tumorsuppressorer herunder P53 eller Rb, og aktiveringen af ​​proto-oncogenet c-Myc at øge sin transformerende aktivitet [14]. Vores tidligere fund viste, at den molekylære chaperone NPM1 er overudtrykt i prostatacarcinom væv, sammenlignet med kontrol tilstødende væv, hvor det stimulerer androgen-afhængig transskription [1]. Vi ønskede nu at mere specifikt undersøge, om denne deregulering af NPM1 udtryk kan virke på prostata tumorceller invasive og migration kapacitet.