PLoS ONE: thiazol Antibiotika thiostrepton synergi med Bortezomib at inducere apoptose i cancerceller

Abstrakt

thiazol antibiotikum, blev thiostrepton nylig identificeret som proteasominhibitor. Vi undersøgte det terapeutiske potentiale af kombinationen af ​​thiostrepton og proteasominhibitor bortezomib (Velcade) på forskellige humane tumorcellelinier. Kombination af subletale koncentrationer af thiostrepton og bortezomib induceret potent apoptose og inhibering af langsigtet kolonidannelse i en lang række humane cancercellelinier. Den synergistiske forhold mellem thiostrepton og bortezomib kombination blev også kvantitativt demonstreret ved at beregne deres kombination indeksværdier, som var meget lavere end 1 i alle undersøgte cellelinjer. Synergien mellem disse stoffer var baseret på deres proteasom inhibitoriske aktiviteter, fordi thiostrepton modifikation, thiostrepton methyl ester, som ikke har intakt quinaldinsyre ring og ikke hæmme proteasom aktivitet ikke kunne påvise nogen synergi i kombination med bortezomib.

Henvisning: Pandit B, Gartel AL (2011) thiazol antibiotika thiostrepton synergi med Bortezomib at inducere apoptose i kræftceller. PLoS ONE 6 (2): e17110. doi: 10,1371 /journal.pone.0017110

Redaktør: Joseph Bauer, Bauer Research Foundation, USA

Modtaget: September 30, 2010; Accepteret: 20 Januar 2011; Udgivet: 18 februar, 2011

Copyright: © 2011 Pandit, Gartel. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var tilvejebragt af National Institutes of Health giver 1RO1CA1294414 og 1R21CA134615 (AL Gartel). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kombination af målrettede lægemidler /agenter har modtaget en konsensus som et levedygtigt potentiel strategi til behandling af malignitet. Behandling med en forbindelse af midler, der er målrettet nøgle cellulære mekanisme eller proteiner kritiske for forskellige cancerformer bliver undersøgt mod en række tumorer. Kombination af lægemidler tillader deres anvendelse ved subtoxiske koncentrationer og nedsætter sandsynligheden for udvikling af resistente kræftceller.

proteasomet er et proteinkompleks, der er målrettet ubiquitin-mærkede proteiner til nedbrydning i en ATP-afhængig måde. Nylige fremskridt i forståelsen af ​​mekanismerne i proteasomaktivitet ført til udviklingen af ​​proteasominhibitorer som effektive lægemidler mod human cancer [1]. Da visse kræftformer er afhængige af en funktionel proteasom for vækst, vil hæmning af proteasom aktivitet selektivt at dræbe disse tumorer. Bortezomib (Velcade) er en af ​​de første i klassen proteasominhibitorer der inhiberer 26S proteasom ved binding til N-terminalen threoninrester i det aktive site af proteasomet katalytiske region. Det er godkendt til klinisk brug i tilfælde af recidiverende myelomatose, men har vist lidt at ingen aktivitet til behandling af solide tumorer som et enkelt middel. Men ved at hæmme proteasomet vej og efterfølgende effekt af vigtige veje, bortezomib viser, synergistisk forhold, når de kombineres med andre anti-cancer medicin og øger effektiviteten af ​​lægemidler mod malignitet.

I vores tidligere undersøgelser viste vi, at thiazolderivater antibiotika Siomycin A og thiostrepton inducere apoptose i humane cancerceller [2], [3] og virke som proteasominhibitorer [4]. Det er blevet påvist inden denne kombination af to proteasominhibitorer lactacystin og MG132 synergieffekt mod prostatacancerceller in vitro [5]. Derudover synergi blev påvist ved at kombinere bortezomib med curcumin (som demonstrerer proteasomalaktivitet inhiberende aktivitet foruden andre effekter) mod multiple myelomaceller [6]. Ligeledes har vi vist, at kombinationen af ​​thiostrepton og bortezomib viste stærk synergi mod prostatakræft [7]. I denne undersøgelse bekræftede vi, at co-behandling af forskellige tumorcellelinjer af forskellig oprindelse med subletale koncentrationer af proteasominhibitorer thiostrepton og bortezomib afslører en stærk synergi som påvist ved induktion af apoptose kombination indeksværdier og langsigtede klonogene assay.

Resultater og diskussion

Vi viste tidligere, at proteasominhibitor thiostrepton hæmmede væksten af ​​forskellige cancercellelinier med IC

50 værdier af (1-5 pM /L) og induceret apoptose [2 ], [3]. Bortezomib er blevet påvist at inhibere levedygtighed tumorcellelinjer med IC

50 værdi på 10-100 nM /L. For at afgøre om thiostrepton kan virke synergistisk med bortezomib mod menneskelige kræftceller af forskellig oprindelse vi behandlet flere human cancer cellelinjer med enten sub-apoptotiske koncentrationer af thiostrepton eller bortezomib alene eller med kombinationer af de to i 24 timer og brugte caspase-3 til at tjene som indikator for apoptotisk celledød (figur 1). Mens behandling med thiostrepton eller bortezomib alene inducerede lille eller ingen caspase-3-spaltning i disse celler, behandling med kombinationen af ​​disse lægemidler viste potent caspase-3-spaltning i U2OS-C3 osteosarkom, MiaPaCa-2 pancreas, PA-1 ovarie, HCT116 colon og MDA-MB-231 brystcancerceller (figur 1), og niveauer af apoptose omvendt korreleret med FoxM1 ekspression (fig S1). Da vi etableret tidligere synergi mellem bortezomib og thiostrepton i prostata kræftceller [7], vores nuværende data tyder på, at denne virkning kan have generel betydning for kræftbehandling.

A. Osteosarcom, U2OS-C3, B. MiaPaCa-2 pancreas, C. PA-1 ovarie, D. HCT-116 colon, E. MDA-MB-231 brystcancerceller blev behandlet med sub-apoptotiske koncentrationer af thiostrepton, bortezomib eller begge som vist i 24 timer, blev de samlede cellelysater udvindes og immunoblottedes med antistoffer for kløvet caspase-3 og β-actin.

for yderligere at demonstrere, at kombinationsbehandling thiostrepton og bortezomib inducerer synergistisk apoptose, vi farves disse celler (DMSO behandles, thiostrepton behandles, bortezomib behandlet og behandles sammen med de to lægemidler) med annexin V-PE /7AAD og analyseret dem ved flowcytometri. Som vist i figur 2A, behandling af HCT-116 celler med 0,75 uM thiostrepton eller 10 nM bortezomib induceret apoptose af kun 6,1% og 6,9% i forhold til kontrollen, mens behandling med begge lægemidler i samme doser forårsagede 35,2% af cellerne til at undergå apoptose . Tilsvarende synergistiske virkning af thiostrepton /bortezomib kombination blev observeret ved annexin-VPE-7AAD farvning i MDA-MB231 bryst- og MiaPaCa-2 bugspytkirtelkræftceller (Figur 2B og C).

A. HCT-116, colon, B. MDA-MB-231, bryst og C. MiaPaCa-2, pancreascancer celler behandlet med sub-apoptotiske koncentrationer af thiostrepton, bortezomib og thiostrepton /bortezomib kombination for 24 timer, farvet med AnnexinV-PE og 7-AAD og analyseret ved flowcytometri.

for at kvantitativt validere synergistiske karakter af samspillet mellem thiostrepton og bortezomib, vi undersøgte cellernes levedygtighed efter enkelt og kombination medicinsk behandling ved hjælp af Chou-Talalay median virkning ligning metode [8]. CI værdier under 1 indikerer en synergistisk anti-proliferativ effekt, og CI range værdier for de kombinerede behandlinger med thiostrepton /bortezomib HCT-116, Mia-Paca-2, MDA-MB231 og PA-1 menneskelige kræftceller var 0,1 til 0,8 (figur 3A, B, C, D) til fraktioneret effekt svarende til 0,3 til 0,9, hvilket antyder en stærk synergistisk virkning. De langsigtede virkninger af kombinationsbehandling med thiostrepton og bortezomib blev vurderet ved klonogene assay. Vi fandt, at kolonidannelse i HCT-116 colon og MDA-MB 231 brystcancerceller behandlet med kombination af disse lægemidler i 24 timer blev undertrykt 5- til 10-fold (figur 4A og B).

kombinationsindeks diagram for kombinationen thiostrepton /bortezomib lægemiddel blev afbildet med CI på y-aksen og fraktioneret effekt (FI) på x-aksen. Procent hæmning af proliferation blev bestemt efter behandling med en enkelt agent eller thiostrepton /bortezomib kombination. Kombinationsindeks (CI) værdier af de to midler afbildet for HCT-116 (A), MiaPaCa-2 (B), MDA-MB231 (C) og PA-1 ovarieceller (D).

A. Klonogen assay af HCT-116 celler behandlet med DMSO eller thiostrepton /bortezomib kombination for 24 timer som detaljeret; et fotografi af petriskåle i et repræsentativt forsøg er vist. B. Klonogen assay af MDA-MB231-celler behandlet med DMSO eller thiostrepton /bortezomib kombinationer i 24 timer.

Efter demonstration af synergi mellem thiostrepton og bortezomib kombination, betydningen af ​​proteasomalaktivitet hæmmende aktivitet thiostrepton udnyttet i kombination blev undersøgt. Aktiviteten af ​​kombinationen af ​​thiostrepton methylester (åben ring inaktiv strukturel analog af thiostrepton) og bortezomib kombination blev sammenlignet med thiostrepton og bortezomib. Det blev demonstreret tidligere, at en intakt quinaldinsyre makrocyklus ring i thiostrepton er påkrævet for proteasom inhiberende aktivitet af thiazol- antibiotika [9]. Fravær af denne ring eller tilstedeværelsen af ​​en åben ring gjort molekylet inaktiv [10]. I modsætning til kombination af thiostrepton /bortezomib, bortezomib og thiostrepton methylester ikke kunne påvise induktion af apoptose, hvilket bekræfter betydningen af ​​proteasom inhiberende aktivitet af thiostrepton anvendes i kombination lægemiddel (figur 5). Nogle undersøgelser har vist en synergi efter samtidig behandling med proteasominhibitorer, lactacystin og MG132 [5], botezomib og curcumin [6] mod kræft. I denne undersøgelse under anvendelse af forskellige metoder rapporterer vi at thiostrepton synergistisk med bortezomib efter samtidig behandling med subletale koncentrationer af de to midler, hvilket antyder, at kombinationen af ​​to proteasominhibitorer at være af potentiel værdi som en generel strategi mod cancer.

Behandling med kombinationen af ​​thiostrepton /bortezomib resulterer i fremkomsten af ​​sub-G

0 top, som reducerer fluorescensintensiteten i HCT-116-celler i modsætning til ubehandlede kontrolceller på grund af opsplitning af kromatin. Skiftet af FI var sammenlignelig med den positive kontrol leveres i sættet (Staurosporin, data ikke vist). Thiostrepton-methyl ester med åben B ring påvirker ikke fluorescensintensitet i modsætning til ubehandlede (kontrol) celler.

Materialer og metoder

Cellelinjer og reagenser

U2OS-C3 osteosarkom, HCT116 colon, PA1 ovarie og MiaPaCa-2 bugspytkirtelkræftceller blev dyrket i DMEM-medium (Invitrogen). MDA-MB231-celler blev dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen). Medierne blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals) og 1% penicillin-streptomycin (GIBCO), og cellerne blev holdt ved 37 ° C i 5% CO

2. Cellelinier blev testet for forurening med mycoplasma hjælp MycoAlert Mycoplasma afsløring kit (Lonza Rockland) og blev fundet negativ. Thiostrepton blev købt fra Sigma, bortezomib blev venligst stillet til rådighed af Millennium Pharmaceuticals /Takeda. Åben ring analog af thiostrepton, blev thiostrepton methylester stillet til rådighed af Drs. Walsh og Bowers (Harvard University).

kombinationsindeks assay

MTT-assay blev udført for at måle levedygtigheden af ​​celler efter behandling med enkelte midler eller en kombination af thiostrepton og bortezomib. Hvert forsøg involverede behandling med forskellige koncentrationer af thiostrepton, bortezomib, en kombination af thiostrepton og bortezomib og en ingen lægemiddelbehandling. Derudover blev de højeste koncentrationer af thiostrepton, bortezomib og kombinationen narkotika testet i fravær af celler og viste ikke nogen indblanding med MTT assay reagenser.

3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl ) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev indkøbt fra Sigma. Celler blev udpladet ved en densitet på 1 x 10

4 per brønd i 200 pi komplet dyrkningsmedium og behandlet med thiostrepton alene, bortezomib alene og kombinationen af ​​thiostrepton og bortezomib i 96-brønds mikro-titer-plader. Efter inkubation i 72 timer ved 37 ° C i en fugtig inkubator, 10 pi MTT (5 mg /ml i PBS) blev tilsat til hver brønd, hvorefter pladen blev centrifugeret kort. Efter omhyggelig fjernelse af mediet, blev 0,1 ml pufret DMSO tilsat til hver brønd. Absorbansen blev registreret på et mikropladelæser ved en bølgelængde på 540 nm. I vores eksperimenter, IC

30, IC

50, IC

70, IC

80, og IC

90 værdier (dvs. at stoffet koncentration nødvendig forårsage 30%, 50% , 70%, 80% og 90% reduktioner af cellelevedygtighed) blev valgt til sammenligning.

for at evaluere effekten af ​​kombinationsbehandling med thiostrepton og bortezomib, kombinationen indeks (Cl) isobologram fremgangsmåde til Chou og Talalay blev anvendt [8]. Denne metode indebærer plotting dosis-effekt-kurverne for hvert middel og kombinationer i multiple fortyndede koncentrationer ved brug af medianen-effekt-ligningen og kombinationen indeks ligning. Kombination indeksværdier på 1, 1, og 1 indikerer en additiv effekt, synergisme og antagonisme, hhv. Kombinationsindekset værdierne blev bestemt ved forskellige effektniveauer, og isobologrammer plottet.

Påvisning af apoptose

AnnexinV-PE-farvning kit (Roche Diagnostic Corp.) blev anvendt til påvisning af apoptotiske organer efter leverandørens protokol. Dette kit anvender et dobbelt-farvning protokol, hvor cellerne viser fluorescens af Annexin V (apoptotiske celler) og fluorescensen af ​​7AAD (nekrotiske celler eller sent apoptotiske celler). Kort fortalt tumorcellerne blev dyrket ved en densitet på 50% sammenløb i 100-mm dyrkningsskåle og blev behandlet med forskellige koncentrationer af lægemidlerne i 24 timer. Cellerne blev trypsiniseret, vasket med PBS, og blev bearbejdet til mærkning med annexinV-7AAD. De mærkede celler blev analyseret ved flowcytometri.

immunblotting

Aktivt delende celler blev podet i en 100 mm plade ved en tæthed på 7,5 x 10

5-celler. Celler blev behandlet med bortezomib alene, thiostrepton alene og kombinationen af ​​thiostrepton og bortezomib i 24 timer, hvorefter cellerne blev lyseret. Celler blev lyseret i IP-buffer (20 mM HEPES, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM Na

4P

2O

7, 1 mM natriumorthovanadat, blev 0,2 mM PMSF tilsat proteaseinhibitortablet (Roche Applied Sciences) og proteinkoncentrationen bestemt ved anvendelse af Bio-Rad-protein-assayreagens. Halvtreds mikrogram cellelysaterne blev adskilt ved elektroforese på SDS-polyacrylamid mini gel og overført til PVDF-membran. Immunoblotting blev udført med specifikke antistoffer for kløvet caspase-3 (9664 cellesignalering), FoxM1 (venlig gave fra Dr. Costas lab) og β-actin (A5441, Sigma).

NUCLEAR ID Green chromatinkondensation afsløring

Celler blev farvet ved hjælp af

in vitro

apoptose afsløring kit (Cat # ENZ-51021-K200 Enzo Life Sciences), i henhold til producentens anbefalinger. Kort 3-4 × 10

5-celler blev udpladet i 60 mm dyrkningsskåle og lodes vokse natten over. celler blev behandlet med subletale koncentrationer af thiostrepton, bortezomib eller thiostrepton methylester eller en kombination af thiostrepton og bortezomib og thiostrepton-methylester og bortezomib. Efter inkubering natten af ​​narkotika celler blev trypsiniseret og fremlagt til flowcytometri analyse. Analysen blev udført ved anvendelse af FL-1 kanal af flowcytometer med excitationsbølgelængde på 488 nm. Staurosporin, tilvejebragt i kittet blev anvendt som en positiv kontrol.

Klonogen overlevelse assay

HCT-116 og MDA-MB231-celler blev udpladet til medium plader ved 3 × 10

5-celler konfluens og behandlet med kombination af thiostrepton og bortezomib i 24 timer. Cellerne blev derefter trypsiniseret, resuspenderes i medierne og talt. Cellerne blev igen udsået (750 celler pr medium plade) og inkuberes i 10 dage. Frisk medium blev tilsat på femtedagen. På den tiende dag blev mediet fjernet fra skålene og vasket en gang med iskold PBS. Kolonierne blev farvet med 2 ml hver af 0,25% 1, 9-dimethyl-methylenblåt i 50% ethanol i 45 minutter på en vippende platform. Skålene blev skyllet tre gange med PBS og lufttørret, og kolonierne blev talt.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført med Microsoft Excel ved hjælp af Student

t

prøve.

P

værdier af 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Støtte oplysninger

figur S1..

Relative niveauer af FoxM1 kan påvirke følsomheden over for thiostrepton /bortezomib kombinationsbehandling i humane cancerceller. U2OS-C3 osteosarkom og MIA PaCa-2 bugspytkirtelkræftceller blev behandlet med DMSO eller angivne koncentrationer af thiostrepton og borteozomib sammen i 24 timer. Cellelysater blev immunoblottedes for FoxM1, kløvet caspase-3 og β-actin som lastning kontrol

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0017110.s001

(TIF)

Tak

Vi vil gerne takke Dr. Albert Bowers og Dr. Christopher Walsh for venligt at give thiostrepton methyl ester anvendt i dette dokument.