PLoS ONE: Vurdering af Hypoxi Inducerbar Factor Niveauer i kræftceller upon Hypoxic Induction Brug en Novel Reporter Construct

Abstrakte

Hypoxi Inducerbar Factor (HIF) signalvejen er vigtigt for tumorceller med begrænsede ilttilførsel, som det er vist at være involveret i processen med spredning og angiogenese. På grund af sin centrale rolle i cancer biologi, robuste analyser for sporing ændringer i HIF udtryk er nødvendige for at forstå dens regulering i kræft samt udvikle behandlinger, der er målrettet HIF signalering. Her rapporterer vi en hidtil ukendt HIF reporterkonstruktion indeholdende tandemgentagelser af minimum HIF-bindingssteder opstrøms for EYFP kodende sekvens. Vi viser, at reporterkonstruktet har en fremragende signal til baggrund-forhold og reporter aktiviteten er HIF afhængig og direkte korrelerer med HIF proteinniveauer. Ved at udnytte denne nye konstruktion, vi analyseret HIF aktivitetsniveauer i forskellige cancercellelinier dyrket i forskellige grader af hypoxi. Denne analyse afslører en overraskende cancercellelinie specifik variation af HIF-aktivitet i den samme grad af hypoxi. Vi viser desuden, at i to cervikale cancercellelinier, ME180 og HeLa, de forskellige HIF aktivitetsniveauer iagttaget korrelerer med niveauerne af hsp90, en cofaktor, der beskytter HIF mod VHL-uafhængig nedbrydning. Denne roman HIF reporter konstrukt tjener som et redskab til hurtigt at definere HIF aktivitetsniveau og dermed den terapeutiske kapacitet potentielle HIF repressorer i de enkelte kræftformer

Henvisning:. Zhou W, Dosey TL, Biechele T, Moon RT, Horwitz MS , Ruohola-Baker H (2011) Vurdering af Hypoxi Inducerbar Factor Niveauer i kræftceller upon Hypoxic Induction Brug en Novel Reporter Construct. PLoS ONE 6 (11): e27460. doi: 10,1371 /journal.pone.0027460

Redaktør: Gangjian Qin, Northwestern University, USA

Modtaget: Maj 4, 2011; Accepteret: 17 okt 2011; Udgivet: 23 November, 2011

Copyright: © 2011 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af R01GM083867-01, R01GM097372-01, og 1P01GM081619 fra National Institute of General Medical Sciences og en Breast Cancer Research Program Pilotprojekt tilskud til HR-B. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hypoxi er velkendt for fundamentalt at regulere mange aspekter af cellebiologi. De fleste af følgerne af hypoxi involverer hypoxi inducerbar faktor (HIF), en stærkt bevaret og afgørende oxygen reguleres heterodimere transskriptionsfaktor sammensat af en alpha (α) og en beta (β) underenhed. Begge disse underenheder tilhører PER-Arnt-SIM (PAS) gruppe i basic-helix-loop-helix (bHLH) familie af transkriptionsfaktorer [1]. To gener, der koder mammale HIFα subunits (HIF1α, HIF2α) er godt undersøgt: HIF1α udtrykkes ubikvitært henviser HIF2α udviser mere begrænset vævsfordeling [2]. I normoxi, HIFα undergår prolyl hydroxylering og binder til en ubiquitin E3-ligase, von Hippel-Lindau (VHL) protein, som fører til polyubiquitination og hurtig proteosomal nedbrydning af HIFα [3], [4]. Under hypoxi, er HIFα hydroxylering hæmmes, hvilket resulterer i ophobning af HIFα og dannelse af HIFα-HIFβ heterodimerer. Heterodimererne yderligere komplekse med coaktivator p300, og binder til de promotorer af HIF målgener at inducere genekspression [5]. Foruden hypoxi, kan mange andre veje påvirke HIF stabilisering [6], [7]. Cofaktorer, såsom PACF P300 /CBP associeret faktor [8] og hsp90 [9], [10], også bidrage til at lette stabilisering HIF og forbedre HIF aktiviteter. Hsp90 har vist sig at beskytte HIFα mod VHL-uafhængig nedbrydning, der kan forekomme i hypoxi [11].

velundersøgt HIF målgener indbefatter dem, der er involveret i levering af oxygen og celleproliferation, såsom vaskulær endotelvækstfaktor faktor (

VEGF

) [12], [13] og

p21

[14]. Desuden HIF letter tilpasning til iltmangel ved at regulere gener involveret i glukoseoptagelse og metabolisme, såsom carbonanhydrase (

CA9

) [15], som opretholder cellulær pH ​​

i homeostase under hypoxi. Det blev for nylig rapporteret, at HIF og dets målgen,

Oct4

, er ansvarlige for hypoxi induceret kræft stamcelle-fænotype, som menes at drive progression og aggressivitet i visse tumorer [16]. På grund af sin centrale rolle i angiogenese og tumor progression, HIF er en terapeutisk attraktivt mål og blokerer HIF, især når de kombineres med traditionelle behandlinger, har vist gavnlige virkninger [17], [18].

For at undersøge HIFs ‘tidsmæssig og rumlige udtryk i væv, er flere direkte og indirekte reporter systemer udviklet med henblik på at spore HIF proteinekspression

in vivo

. Enten fuld længde HIF cDNA eller et fragment under oxygen-afhængig regulering er blevet forbundet med fluorescerende protein [19], eller ildflueluciferase [20] til konstruktion HIF-fusionsproteiner. Alternativt eftersom HIF fusionsprotein undersøgelser ikke afslører, om HIF kompleks er transkriptionelt aktiv, promotor- baseret reportere er også blevet udviklet. Typisk 5-8 gentagelser af hypoxi responselementer (hres) (5′-GCCCTACGTGCTGTCTCACACAGC-3 ‘) fra 3’enhancer region af humant Epo-gen, eller HRE fra VEGF (5′-CACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCT-3′) er forbundet i tandem med en minimal promotor til at drive ekspressionen af ​​en nedstrøms reportergen [21], [22]. Det er værd at bemærke, at i disse konstruktioner, HRE indeholder ikke kun HIF-1α eller HIF2α konsensus bindingssteder (5’-CGTG-3 ‘og 5′-TRCGTG-3’, henholdsvis), men også

Epo

eller

VEGF

promoter specifikke sekvenser. For nylig

Oct4

har vist sig at blive induceret af HIF under hypoxi [16], men

Oct4

promotor indeholder kun tre gentagelser af CGTG, den faktiske HIF bindingssted men ikke HRE-sekvenser observeret enten i

Epo

eller

VEGF

promotor.

for at maksimere specificitet og følsomhed reporterkonstruktet, en strategi for at bruge den mest primitive transkriptionsfaktor bindingssted i tandem i en reporter er blevet udnyttet tidligere i tilfælde af Wnt-pathway analyse [23], [24]. I den foreliggende undersøgelse har vi anvendt en lignende strategi til at opbygge en promotor baseret reporter, som kun har en minimal HIF1α og HIF2α bindingssteder sammen (CGTGTACGTG) i tandem i promotoren. Vi viser, at denne nye HIF reporter med HIF bindende gentagelser (HBR) har et godt signal til baggrund forholdet og signal dynamik i iltsvind og reoxygenering. Vi viser også, at signalet er HIF afhængig som afsløret ved HIF RNAi undersøgelser, og det korrelerer med det cellulære HIF proteinniveauet i forskellige cellelinier. Ved at udnytte vores nye konstruktion, viser vi, at HIF aktivitetsniveauer varierer betydeligt i forskellige cancercellelinier dyrket i den samme grad af hypoxi. Vi afslører desuden, at i to cervikale cancercellelinier, forskellene i HIF aktivitetsniveauer korrelerer med niveauet af HIF cofaktor, Hsp90, som beskytter HIF mod VHL-uafhængig nedbrydning.

Resultater Salg

vi konstruerede en lentiviral plasmid, hvori ekspressionen af ​​et forstærket gult fluorescerende protein (EYFP) blev under regulering af tolv tandemgentagelser af minimale HIF-bindingssteder (CGTGTACGTG), efterfulgt af en minimal menneskelig thymidinkinase (TK) promotor (12U- HBR). Desuden blev en 770 bps af beta-globin intronsekvenser indarbejdet mellem TK promotoren og EYFP bedre transskription af EYFP (figur 1a, figur S1). For at undersøge konstruktionen funktion

in vitro

, vi transducerede virussen ind i HeLa-celler og dyrkes dem i enten normoxisk (20% O

2) eller hypoxiske (2% O

2) tilstand. Efter 24 timer observerede vi, at celler under hypoxi udtrykkes ensartet EYFP (-70% af EYFP positiv), mens dem under normoxi kun opnået fluorescens med stærkt reduceret intensitet (-6% af EYFP positiv, Figur 1b og figur S2).

3, 6 eller 12 tandem enheder af HIF-bindende gentagelser (3U, 6U eller 12U-HBR) og en TK minimal promotor sammen regulere EYFP ekspression. b-c) Optimering af antallet af HIF-bindende gentagelser. b) 6U-HBR HeLa-celler slå EYFP indenfor 2%, men ikke i 20% oxygen. Lige så stor mængde af celler (5 x 10

4) blev udpladet i både dyrkningsskåle og mikroskopi og FACS-analyse blev udført efter 2 dage; c) signal-baggrund-forhold er repræsenteret ved FACS-analyse. HeLa-celler blev transduceret med HIF-HBR reporter lentivirale partikler i 24 timer og derefter dyrket under normoxi (20% O2) eller hypoksi (2% O2) i 48 timer før FACS-analyse. Nøgletal er af geometriske midler EYFP intensitet i 2% til 20% ilt.

For yderligere at optimere signalet til baggrunden ratio, vi reduceret antallet af HIF-bindingssteder, og derved skabe HIF-journalister med 3 tandem bindingssteder (3U-HBR) eller med 6 steder (6U-HBR) (figur 1a). Ved analyse i HeLa-celler, observerede vi, at 6U-HBR konstruktionen opnås et bedre signal-til-baggrund-forhold end 3U-HBR og 12U-HBR konstruktioner (33,4, 5,8 og 15,1, henholdsvis. Figur 1c). For at sammenligne specificiteten og følsomheden over for andre hypoxi reportere, vi specifikt opnået en af ​​den udbredte HIF reporter 5HRE_hCMV_Luc [25]. Efter transient transficeret 5HRE_hCMV_luc reporter i HeLa-celler observerede vi 50-100 gange større luciferaseaktivitet under 2% O

2 sammenlignet med celler, der vokser i 20% O

2, og som svarer til den oprindelige konstatering. Til sammenligning vores HBR_eYFP reporter viser omkring 30-40 gange stigning i 2% O

2, en stigning, der falder i en lignende skala, som set med 5HRE_hCMV_luc reporter. Med ligheden i signal intensitet, men de to HIF reporter-konstruktioner er ikke direkte sammenlignelige, da de har forskellige backbone-sekvenser, forskellige minimale initiativtagere og reportergener, som alle kunne gøre dem særskilt adfærd og dynamik under hypoxi. I denne undersøgelse blev 6U-HBR anvendt til yderligere optimering og karakterisering.

Vi næste kendetegnet dynamikken i konstruktionen i færd med deoxygenering og reoxygenering. Når de overføres fra normoxi for hypoxi (2%), 6U-HBR-HeLa-celler havde hurtig reaktion (figur 2a); men når overført fra hypoxia tilbage til normoxi, faldt fluorescensintensiteten langsomt (72 timer at nå det basale niveau, figur 2b). For en konstruktion med bedre evne til rettidigt reflektere omsætning HIF, vi modificeret EYFP og genererede en destabiliseret version ved fastgørelse muse ornithindecarboxylase 422-461 domæne, en region ansvarlig for hurtig nedbrydning af proteinet [26], til den C-terminale af EYFP derfor skabe konstruktionen af ​​6U-destabiliseret-HBR (6UD-HBR). Vi observerede, 6UD-HBR havde en reduceret fluorescens men lignende dynamik som set med 6U-HBR (figur 2a). Når føres tilbage til normoxi, det fluorescerende signal af 6UD-HBR celler viste dramatisk reduktion nåede det laveste niveau i 10 timer. Baseret på disse observationer, 6U-HBR er mere følsom i at detektere ændringer i processen med iltsvind mens 6UD-HBR bedre afspejler ændringer i processen med reoxygenering.

5 × 10

4 celler blev udsået på 35 mm plader og derefter dyrket under enten normoxi (20% O

2) eller hypoxi (2% O

2). På forskellige tidspunkter blev cellerne høstet og fikseret til FACS-analyse. Mean og fejl barer er fra tre biologiske gentagelser.

For at bekræfte HIF-afhængighed af reporter, vi udførte RNAi eksperimenter rettet mod HIFs under hypoxi. Når banker ned tre HIFs (HIF1α, HIF1β og HIF2α), havde 6U-HBR-HeLa celler under hypoxi stærkt reduceret fluorescens, tæt på niveauet ses under normoxi (Figur 3a-f, omtrent lige mange celler observeret i a-d) . Desuden viste vi, at overekspression af ikke-nedbrydeligt HIF1α eller HIF2α alene var tilstrækkelig til at aktivere ekspressionen af ​​konstruktionen (figur 4a og 4b). For at teste, om signalet induceret af HIFα overekspression (OE) var direkte forårsaget af den kanoniske aktivitet HIFα introducerede vi RNAi mod væsentlige cofaktor af HIFα, HIF1β, i HIFα OE celler. Vi viste, at når transficeret med HIF1β RNAi, den EYFP intensitet induceret af HIFα OE blev stærkt reduceret (figur 4b-d). Det er værd at bemærke, at i RNAi eksperimenter udført i et high-throughput platform, viste celler ækvivalent intensitet tværs brøndene i samme behandlingsgruppe (figur 4b-d). Disse eksperimenter viser anvendeligheden og følsomheden af ​​6U-HBR konstruktionen i en high-throughput platform. Følsomheden af ​​konstruktionen til både HIF1α og HIF2α blev yderligere bekræftet af resultaterne, når vælte individuel HIFα eller HIFs med forskellige kombinationer i HeLa-celler (Figur S3). Alt i alt, viser vi, at journalisten er direkte sensing HIF signalering i cellerne.

6U-HBR HeLa-celler transficeret med siRNA’er mod tre HIFs (HIF1α, HIF1β og HIF2α) er EYFP negativ under hypoxi, fra både mikroskopi (øvre panel a-d) og FACS resultater (nederste panel e og f). Lige mængde celler (5 × 10

4) blev udsået i kultur retter og mikroskopi og FACS-analyse blev udført efter 2 dage efter siRNA transfektion.

a) 6U-HBR konstruktionen i A549 er aktiveres enten med ndHIF1α eller ndHIF2α, men ikke med tom vektor konstruktion. b-d) HIF1β siRNA alene reducerer i høj grad fluorescerende signaler induceret af ndHIF1α /ndHF2α overekspression (ndHIFα OE) i HeLa-celler, hvilket indikerer, at EYFP signaler er reversible ved at manipulere niveauer af HIF faktorer. Begge mikroskopi billeder (b) og fluorescerende kvantificering (c og d) er vist.

I pattedyr embryogenese og udvikling, væv udvikle sig i en microenviroment med forskellige niveauer af ilt. Det er påvist, at hypoksi, på den ene side, er afgørende for hjerte dannelse [27], [28], [29] og endochondrial knogledannelse [30], [31], [32], [33]; Men på den anden side er det svækker fedtvæv udvikling [34], [35] og hud myofibroblastdifferentiering [36]. I betragtning af den kritiske rolle HIF signalering i hypoxi, et grundlæggende spørgsmål er, om celler få vævsspecifikke reaktioner på deres lave ilt miljø ved differentielt regulere HIF vej. For at bestemme, hvordan celler fra forskellige væv oprindelser reagerer på hypoxi i form af HIF niveauer og aktiviteter, vi undersøgte 5 6U-HBR karcinomer cellelinjer, nemlig 786 + VHL fra renal celle adenokarcinom, A549 fra lungekarcinom, ME180 fra epidermoid karcinom i livmoderhalsen , U251 fra gliom, og HeLa fra cervikal adenokarcinom. Celler blev inkuberet i forskellige oxygenniveauer (20%, 5%, 3%, 2%, 1% eller 0,3%) i 4 dage, og den gennemsnitlige 6U-HBR fluorescens blev bestemt ved FACS-analyse. Disse celler kunne forventes at opføre sig på samme måde under hypoxiske betingelser som følge af det faktum, at de har tilpasset dyrkningsbetingelser; Men bemærkede vi, at de reagerede tydeligt, under den samme grad af ilt. For eksempel, ME180 og HeLa begge havde lidt respons på 3% oxygen, men når oxygenniveauet var under 3%, ME180 udviste dramatisk stigning af signalet, mens HeLa havde relativt lav stigning (figur 5). På den anden side, signalet fra U251 steg langsomt ved 5% og 3% oxygen, mere dramatisk i 2% og 1% oxygen, og tydeligt fortsatte med at stige, selv i 0,3% oxygen (figur 5).

Fem cancercellelinier inficeret med 6U-HBR lentivirus blev dyrket under forskellige grad af hypoxi, herunder 20%, 5%, 3%, 2%, 1% og 0,3% af O

2. bestemtes deres EYFP intensiteter efter 4 dage i kultur ved FACS-analyse. De grader af hypoxi præsenteres som log af relativ O

2-niveau til normoxi (20% O

2).

Vi yderligere bekræftet, at 6U-HBR signaler i disse cellelinjer korreleret med intracellulære HIF proteinniveauer. Siden 1% ilt miljø udstillet den største forskel i 6U-HBR signaler blandt ME180, U251 og HeLa-celler, vi brugte dette niveau af ilt til at analysere HIF mRNA og protein. Mens HIF1α mRNA niveauer var ens blandt disse cellelinier, HIF2α mRNA-niveauer varierede (figur S4), som var i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse [2]. For proteinniveauet, først viste vi, at fire timer i hypoxi induceret højere HIF1α proteinniveauer i ME180, U251 og A549 end i HeLa og 786-O + VHL (figur 6a-b). Da det tidligere er blevet rapporteret, at i langvarig hypoksi, HIF1α protein nedbrydes mens HIF2α udviser minimal ændring [37], vi hypotese, at ikke kun de samlede HIF proteinniveauer men også stabilisering dynamik proteinerne er ansvarlige for forskellige 6U-HBR reporter aktiviteter i disse cellelinier. Vi analyserede derfor forskellene i nedbrydningskinetik af HIFα proteiner i alle de fem cancercellelinier i 1% oxygen. Denne analyse viste, at HIF1α i HeLa-celler er mindre stabil under langvarig hypoxi end i nogen andre celletyper analyseres (figur 6c og d). Når man sammenligner HIF2α niveauer i 1% hypoxi versus normaxia, er forskellen mellem disse fem cellelinjer formindsket i forhold til det samlede protein niveauer og nedbrydningsprodukter mønstre (Figur S5). Men selv om ingen HIF1α protein blev observeret i 786-O + VHL-celler, blev HIF2α protein induceret i hypoxi i denne cellelinier, explaning reaktionsevne denne cellelinje til 6U-HBR reporter (fig S5, figur 5). Alt i alt viser dataene, at højere niveauer af mere stabile HIFα proteiner observeres i ME180, A549 og U251 i forhold til HeLa og 786-O + VHL celler, støtter resultaterne afsløret af 6U-HBR reporter, at disse fem cellelinjer vise forskellige HIF aktiviteter i samme grad af hypoxi.

a) HIF1α i ME180, U251, A549, HeLa og 786-O + VHL celler under 1% O

2 i 4 timer. b) Kvantificering for HIF1α protein vist i a). Kvantificering blev udført på scannede filmbilleder opnået fra separate western blots. c) HIF1α niveauer og d) kvantificering i ME180, U251, A549, HeLa og 786-O + VHL celler under 1% O

2 ved tre tidspunkter: 4 timer, 12 timer og 48 timer, sammenlignet med niveauerne under 20% O

2 som kontroller.

Vi valgte HeLa og ME180 til yderligere undersøgelse, da de er både livmoderhalskræft cellelinjer, der udviser meget tydelige reaktioner på hypoxi. For at forstå reguleringen af ​​HIFα i disse to livmoderhalskræft cellelinjer, analyserede vi mRNA microarray data, der tidligere er udført i disse cellelinjer i 2% hypoxi [38]. Interessant vi identificeret Hsp90 mRNA differentielt udtrykte mellem HeLa og ME180. Vi først valideret denne konstatering af real-time PCR-analyse og viste, at ME180 har højere niveauer af hsp90 både normoxi og hypoxi (figur 7). For at bestemme om højere niveauer af hsp90 i ME180 kunne være kausal for højere HIF-aktivitet, vi reduceret hsp90 binding til HIF1α i ME180 ved at inkubere celler med 17-allylamino-demethoxygeldamycin (17-AAG) i 2% hypoxiske betingelser. 17-AAG inhiberer ATP-binding til hsp90 og derved forhindre interaktionen af ​​hsp90 og dets målprotein [39]. Da hsp90 interaktion med HIF1α er vist at forøge HIF1 stabilitet i hypoxi [11], bør 17-AAG reducere hsp90 afhængig HIF1 aktivitet. Derfor 6U-HBR ME180 inkuberet med 17-AAG viste lavere niveauer af 6U-HBR reporter aktivitet end observeret i kontrollerne (figur 8a). Endvidere blev mRNA-ekspression af HIF1α målgen CA9 signifikant reduceret (figur 8b), hvilket antyder, at HIF-aktivitet blev reduceret i ME180 når hsp90 blev gjort inaktiv. Disse data understøtter den hypotese, at forskellen i Hsp90-niveauer er kausal for forskellen i HIF-aktivitet observeret i de to cervikale cancercellelinier. Vi udelukkede muligheden for reduktion af HIF aktiviteter forårsaget af generel transkriptionel regulering i cellerne ved at vise stabil ekspression af et andet endogent housekeeping-gen i begge celletyper (WYHAZ, figur 8c).

Celler blev enten inkuberet under 1% hypoxi eller 20% normoxi i 48 timer før kvantificering af hsp90 mRNA niveau ved real-time PCR. Fejlsøjlerne præsenteres som prøve på middelværdien (SEM) ud fra tre uafhængige biologiske eksperimenter.

Resultater af tre uafhængige forsøg er opsummeret og fejlsøjlerne præsenteres som prøve på middelværdien (SEM ). a) Fluorescensintensiteter af HeLa i DMSO, ME180 i DMSO og ME180 i 100 nM 17-AAG i 2% hypoxi normaliseres til, at der i 20% normoxi. b) De fold ændringer i CA9 mRNA niveauer normaliseret til 20% normoxi i de celler tyder på, at forskellen i form af HIF-aktivitet, reduceres i nærværelse af 17-AAG. c) Den stabile ekspression af en anden housekeeping-gen, tyrosin 3-monooxygenase /tryptophan 5-monooxygenase aktiverede protein, zeta-polypeptid (YWHAZ), demonstrerer generelt normale transkriptionelle aktiviteter i disse celler behandlet enten med DMSO eller 17-AAG.

diskussion

Her opretter og karakterisere en roman HIF reporter konstruktion, hvor EYFP udtryk er reguleret af tandemgentagelser af minimal HIF1α og HIF2α bindingssteder vi. Ved at anvende celler, der er inficeret med lentivirus af HIF-HBR konstrukt, viser vi, at celler med 6 tandemgentagelser som promotoren i konstruktionen (6U-HBR) giver bedre signal-til-baggrund-forhold end dem med 3 eller 12 gentagelser. Også med hensyn til reporter kinetik, den 6U-HBR konstruktionen opnår en stærkere signal i processen med deoxygenering, mens celler med 6U-destabiliseret-HBR konstruktionen mere præcist afspejler reduktionen af ​​HIF-niveauer i processen med reoxygenering. Desuden gennem siRNA studier mod HIF1α, HIF2α og HIF1β samt over-udtryk studier af ndHIF1α og ndHIF2α, viser vi, at konstruktionen er HIF specifik og er i stand til at reagere på både HIF1α og HIF2α. Udnytte 5 forskellige cancer cellelinjer inficeret med 6U-HBR konstruktion, observere vi at forskellige cancer cellelinjer har forskellige EYFP signaler under samme iltindhold, der korrelerer med det samlede beløb for HIF1 α og HIF2 a proteiner i disse cellelinjer.

Vi udnyttet reporter at udforske forskel i hypoksiske reaktion HeLa og ME180 cervikal cancer-cellelinjer. Vi observerede, at disse to cancercellelinier har distinkte 6U-HBR signaler, som korrelerer med mængden af ​​HIFα proteiner som reaktion på det samme niveau af hypoxi. Tilsvarende er de forskellige funktionsmåder mellem HeLa og ME180 under hypoxi også observeret i angiogen vækstfaktor-ekspression [40], [41] samt i proteasom, histon deacetylase [42] og Hsp90 indsats [43]. Blandt dem, Hsp90 er af særlig interesse. I overensstemmelse med tidligere analyse [43], viser vi, at ME180 har højere niveauer af Hsp90-mRNA end HeLa både under normoxi og hypoxi. Højere basale niveau af HIF cofaktor Hsp90 i ME180 kunne bidrage til den observerede højere HIF-aktivitet, eftersom hsp90 binding til HIF er blevet rapporteret at beskytte HIFα mod VHL-uafhængig nedbrydning [9], [11]. Lavt iltindhold inaktivere PHD /VHL afhængig nedbrydning af HIF, hvilket resulterer i stabiliseret og aktiv HIF transskription faktor. Dog er HIFα sidst nedbrydes i hypoxiske betingelser. Dette VHL-uafhængig nedbrydning af HIF1α har vist sig at være RACK1 afhængig [11]. Hsp90 konkurrerer med RACK1 binding til HIF1α og dermed beskytte HIF1α mod hypoxisk nedbrydning. I nærværende undersøgelse viser vi, at ME180 celler har højere niveauer af hsp90 og mere stabile HIFα proteiner sammenlignet med HeLa (figur 6). Vi viser endvidere, at reduktionen af ​​hsp90 i ME180 mindsker forskellen af ​​HIF niveau og aktivitet sammenlignet med HeLa. Disse data tyder på, at forskellige Hsp90 niveauer kunne kausale for de forskellige HIF aktivitetsniveauer iagttaget i de to cervikale cancercellelinier under samme grad af hypoxi. Det vil være interessant at teste i fremtiden, om ilt /PDH /VHL-uafhængig HIFα nedbrydning generelt nøglen regulator af HIF aktivitet forskelle observeret i kræftceller under det samme niveau af hypoxi.

Det er kendt, at cervicale cancerceller ofte er inficeret med et onkogent type human papillomavirus (HPV), og HeLa transformeres ved HPV18 mens ME180 ved HPV68. HPV forskellige typer varierer i udtryk og regulering af de to primære HPV onkogener, E6 og E7 [44], der er tilstrækkelig til at ændre HIF-1α niveau. HPV11 E6 og HPV31 E6 kan stimulere HIF-1α ekspression som følge af ubiquitin-afhængige nedbrydning af p53 [45], mens HPV16 E7 kan interagere med en cullin-2 ubiquitin ligase kompleks, der medierer VHL-afhængig HIFα nedbrydning [46]. Det vil være interessant at afsløre i fremtiden, om forskellige reaktioner på hypoxi observeret i HeLa og ME180 er forbundet med den type af onkogen HPV de er smittet med.

I denne undersøgelse rapporterer vi en roman HIF reporter konstruktion indeholdende tandem gentagelser af minimum HIF bindingssteder opstrøms for EYFP kodende sekvens. Vi viser, at signalet fra reporteren er HIF afhængige og korrelerer med de cellulære HIF-proteinniveauer i forskellige cellelinier. Ved at udnytte denne nye konstruktion, finder vi en overraskende variation af HIF-aktivitet i forskellige cancercellelinier under samme grad af hypoxi. Denne roman HIF reporter konstruktion kan tjene som et værktøj til hurtigt at definere HIF aktivitetsniveau og dermed terapeutiske kapacitet potentielle HIF repressorer i de enkelte kræftformer.

Materialer og metoder

Celler, vævskultur og hypoxi induktion

HeLa og ME180 (cervikalt carcinom), A549 (lungecarcinom), U251 (gliom) celler var fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). 786-O-celler transficeret med en vildtype VHL blev opnået fra Dr. William G. Kaelin Jr. (Dana-Farber Institute, Boston, MA). Cancerceller blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med penicillin, streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen, Carlsbad, CA). Cellerne blev bestået med trypsin /EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA), når de nåede 80% sammenløb.

Hypoxi induktion

Celler blev dyrket i multi-gas væksthuse (Sanyo, San Diego, Californien ). Nitrogengas blev tilført til kamrene for at inducere en kontrolleret reduceret procentdel af oxygen. For normoxi, celler blev dyrket i væksthuse, der indeholder 5% CO

2 og atmosfærisk koncentration af O

2, ca. 20% til 21% O

2. Gennem dette papir “normoxi” blev omtalt som 20% O2.

Lentiviral plasmid konstruktion

Vi genererede HIF reporter konstruere med HIF1α konsensus bindingssted CGTG fulgte HIF2α websted TACGTG sammen som en enhed af bindingssted for HIFα faktorer og gentog dem i tandem 12 gange (12U-HBR), med 5 basepar af nukleotider af forskellige kombinationer afstand mellem. Induktion element CACAG, et DNA-element er nødvendigt for hypoxisk induktion, blev jævnt indsat i de hele sekvenser tre gange for at hjælpe med induktion processen. De endelige HIF-bindende sekvenser blev direkte syntetiseret ved Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, Iowa (fig S1). TK minimal promotor efterfulgt af 770 bps β-globin intronsekvenser og EYFP blev amplificeret fra pBARL plasmid (høflighed af Dr. Randall Moon laboratorium, University of Washington, Seattle, WA) og knyttet til HIF-bindende sekvens ved fusion PCR. De HIF-TK-EYFP sekvenser blev yderligere ligeret ind i en lentiviral plasmid pRRL-cPPT-X-PRE-SIN [47] (høflighed af Dr. William Osborne laboratorium, University of Washington, Seattle, WA) mellem Clal- og XhoI sites. 6U-HBR og 3U-HBR blev konstrueret på samme måde, bortset HIF-bindende sekvenser kun indeholde seks bindende gentagelser (6U-HBr) eller tre gentagelser (3U-HBr). At opbygge 6U-HBR-destabiliseret udgave blev mus ornithindecarboxylase 422-461 domæne sekvenser først amplificeret fra plasmid M38 TOP-dGFP (høflighed af Dr. Randall Moon laboratorium) og derefter indsat i 6U-HBR konstruere gennem MluI sted efter 3 ‘i EYFP sekvens.

lentivirus produktion og stabil transduktion af cellelinjer

lentivirale plasmider blev transficeret ind FT293 cellelinier (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) ved calciumphosphat-transfektion til frembringelse af lentiviral partikler. Specifikt overføre plasmid (12U-HBR, 6U-HBR, 3U-HBR eller 6U-HBR-destabiliseret konstrukt), pakkende plasmid, VSVG plasmid og REV plasmid blev transficeret sammen ved 23:15:8:11.5 ratio, og 25 ug af blandede plasmider blev transficeret pr 150 mm plade med 1 ml 2X HBS og 0,1 ml 2,5 M CaCl

2. Efter transfektion blev medier skiftet efter 24 timer og virale supernatanter blev høstet og filtreret efter 72 timer. Til opnåelse koncentreret virus, blev de virale supernatanter yderligere centrifugeret ved 6100 rpm i 17 timer ved 4 ° C. Bundfaldet blev resuspenderet i 1X TBS (50 mM Tris-HCI, pH 7,4 og 150 mM NaCl) og opbevares derefter i -80 ° C før brug. At transducere cellelinier med virus, blev passende mængde virus direkte tilsat til mediet med tilstedeværelsen af ​​hexadimethrinbromid ved 4 ng /ml (polybren, Invitrogen Inc, Carlsbad, CA) og medium blev skiftet efter 24 timer.

Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) -analyse

Celler, der skal analyseres blev trypsinbehandlet fra plader, centrifugeret ned og derefter fikseret i 4% paraformaldehyd i mindst 30 minutter før analysen. Standard indstillinger blev anvendt i celle sortering med passende kanal spændinger og mindst 30.000 celler blev analyseret for hvert forsøg. FITC kanal blev anvendt til at detektere EYFP fluorescens. FlowJo (Tree stjerne, Inc. Ashland, OR) blev anvendt til at visualisere data og FITC værdier blev defineret som det geometriske gennemsnit af fluorescens intensitet EYFP positive population for hypoxiske prøver. For prøver inkuberet i 20% O

2, intensiteterne blev defineret som det geometriske gennemsnit af fluorescens intensitet EYFP af den samlede befolkning (EYFP negativ).

Ikke-nedbrydelige HIF (ndHIF) overekspression

for at opnå konstitutivt stabil ekspression HIFα protein, ndHIF overudtrykker plasmider (Addgene plasmid 19005 og 19006) blev anvendt, hvor to af Proline steder i HIF cDNA blev ændret til alanin som beskrevet tidligere [48]. Retrovirus fremstillet af disse plasmider blev inficeret ind i HeLa og A549-cellelinier i nærvær af hexadimethrinbromid ved 4 ng /ml (polybren, Invitrogen Inc. Carlsbad, CA) og medium blev skiftet efter 24 timer. Over-ekspressionen af ​​HIF1α og HIF2α blev bekræftet ved western blots som vist i figur S6.

siRNA mod HIF assay

siRNA’er mod HIF faktor var gave fra Dr. Zhan Zhang [38]. siRNA’er blev forbigående transficeret ind i celler på plade med 6 brønde med lipofectamin 2000 (Invitrogen Inc. Carlsbad, CA) følgende instruktion Lipofectamine 2000.