PLoS ONE: Tab af promyelocytleukæmi Protein i Gastric Cancer: Konsekvenser for IP-10 Expression og tumorinfiltrerende lymfocytter

Abstrakt

mavekræft er en af ​​de mest almindelige årsager til kræft dødelighed på verdensplan. Ekspression af tumor suppressor, promyelocytleukæmi (PML) protein, nedsættes eller afskaffes i gastriske carcinomer i samarbejde med et forhøjet niveau af lymfatisk invasion, udvikling af højere pTNM iscenesættelse, og ugunstige prognose. Heri undersøgte vi forholdet mellem omfanget af tumor-infiltrerende lymfocytter og status for PML proteinekspression i fremskreden gastrisk carcinoma. Vi observerede højere antal infiltrerende T-celler i gastriske carcinoma væv, hvori PML ekspression blev reduceret eller afskaffet, sammenlignet med væv positive for PML. Omfanget af T-celle-migrering til kultursupernatanter opnået fra interferon-gamma (IFN-γ-stimulerede gastrisk karcinom cellelinjer blev yderligere påvirket af ekspression af PML

in vitro

. Interferon-gamma-inducerbare protein 10 (IP -10 /CXCL10) ekspression blev øget i gastriske carcinoma væv udviser reducerede PML-niveauer. Desuden har både

Pml

knockout og knockdown celler udviste forbedret IP-10 mRNA og proteinekspression i nærvær af IFN-γ. PML knockdown øget IFN-γ-medieret Signal Transducer og Activator of transcription-1 (STAT-1) binding til IP-10-promotoren, resulterer i forhøjet transkription af undersøgelsesperioden-10-genet. Omvendt PML IV proteinekspression undertrykkes IP-10 promotoraktivering . Baseret på disse resultater, foreslår vi, at tabet af PML proteinekspression i gastriske cancerceller bidrager til øget IP-10 transkription

via

forøgelse af STAT-1-aktivitet, hvilket på sin side fremmer lymfocyttrafik inden tumor-regioner .

Henvisning: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) Tab af promyelocytleukæmi Protein i Gastric Cancer: Konsekvenser for IP-10 Expression og tumorinfiltrerende lymfocytter. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10,1371 /journal.pone.0026264

Redaktør: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), USA

Modtaget: April 21, 2011; Accepteret: September 23, 2011; Udgivet: 12 oktober 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Research Program Basic Science gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (2010 til 0.015.506) til Y-HC, af National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Korea regering (MEST) (2010 til 0.029.353) til JLK og ved RO1 NS50665 til ENB. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de hyppigste årsager til cancerrelaterede dødsfald på verdensplan. Nylige fremskridt i genetik har lettet detektion af hændelser, der opstår under forløbet af gastrisk carcinogenese, herunder aktivering af onkogener, silencing af tumorsuppressorgener, og mutation af gener involveret i DNA-reparation [1]. Blandt disse genetiske begivenheder, er det kendt, at tumor suppressor promyelocytisk leukæmi (PML) proteinekspression nedsættes eller afskaffes i gastrisk cancer, og at dette er forbundet med mere omfattende lymfatisk invasion, højere pTNM mellemstationer, og ugunstig prognose, hvilket antyder, at PML tab er knyttet til carcinogenese og gastrisk karcinom progression [2]. Tidligere undersøgelser impliceret

Pml

dysfunktion i progressionen af ​​en række forskellige cancertyper, og reduceret eller afskaffet ekspression af PML er blevet rapporteret i prostata, bryst, CNS, tyktarms-, lunge- og gastriske cancere [2], [3] .

Pml

genet blev oprindeligt identificeret ved fusion med retinoinsyrereceptor involveret i t (15; 17) kromosomal translokation forbundet med akut promyelocytisk leukæmi (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML er en tumor suppressor protein, der regulerer cellecyklusprogression, gentranskription, transformation undertrykkelse, og apoptose.

Pml

knockout mus er betydeligt mere følsomme over for tumordannelse efter udsættelse for kræftfremkaldende stoffer end er vildtype-kontroller, og

Pml

deficiente celler er mindre tilbøjelige til at undergå apoptose efter anvendelse af bestemte typer af cellulært stress [9]. Foruden, der fokuserer på tumorsuppressor rolle PML spiller, har flere undersøgelser bekræftet, at proteinet fungerer som en transskriptionel regulator,

via

associering med co-aktivator CREB-bindende protein; co-repressorer herunder HDAC, N-RU, og mSin3A; og transskription faktorer Nur77, AP-1, myc, p53, og STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].

Progressiv mutation af og genetiske ændringer i flere tumorsuppressorgener fremme tumorudvikling og progression [18]. Foruden genetiske ændringer inden tumorceller, både inflammatoriske celler og mediatorer bidrager til dannelsen af ​​bestemte tumor mikromiljøer [19], [20]. Tumorassocierede fibroblaster (TAF’er) og makrofager (TAM’er) er også involveret i modulering af tumormikromiljøet

via

produktionen af ​​cytokiner, kemokiner, interferoner og andre biologisk aktive faktorer [21], [22]. Cross-talk mellem tumorceller, TAF’er, TAM’er, og lymfocytter, er betydelig i tumor udvikling og progression, og bidrager til etablering af tumor mikromiljøer beriget i ekspression af en række biologisk aktive faktorer [23], [24], [25] , [26], [27].

TAM’er findes at korrelere med angiogenese og en ugunstig prognose i flere typer af kræft, herunder gastrisk kræft [22], [28]. Mastcelle producerer mange angiogene faktorer og en række cytokiner, og dens densitet er blevet rapporteret til stærkt korrelerer med omfanget af tumoren neoangiogenese og dårlig prognose [29], [30]. CD4

+ og CD8

+ -lymfocytter findes også i en række solide cancervæv. Indtil nu er de præcise molekylære mekanismer, som typen og antallet af tumorinfiltrerende celler er reguleret er stort set ukendte. Der er flere kontroversielle rapporter med hensyn til antallet og funktionen af ​​tumor-infiltrerende lymfocytter. Især CD8

+ T-lymfocytter, mens deres funktion er kendt for at eliminere vordende transformerede celler og bidrage til immunosurveillance [31], er det rapporteret, at CD8

+ tumorinfiltrerende T-celler er defekte i effektorfasen funktion ved kontakt med tumorceller [32], og deres infiltration er forbundet med ugunstig prognose i visse typer af cancer, såsom ikke-småcellet lungekræft og nasopharyngeal carcinom [33], [34]. Salg

Kemokiner udskilt af stromale celler eller tumor celler indflydelse tumorcellemigration, invasion, proliferation, angiogenese og immun celleinfiltration i tumormassen [35]. IFN-γ-inducerbart protein-10 (IP-10, CXCL10) er en af ​​de CXC chemokiner som spiller flere roller i inflammatoriske sygdomme og cancer [36], [37]. Da IP-10 præferentielt fremmer Th1 immunresponser ved robust tiltrækker NK og T-celler, foreslås det som en af ​​mulige mekanismer for T-celle-infiltration til tumorer.

Uanset om tab af tumorsuppressorgener i tumorceller inducerer rekruttering af lymfocytter og modulering af funktionerne af sådanne celler i tumor mikromiljøer er endnu uklart. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi PML funktion med hensyn til rekruttering af lymfocytter og modulering af ekspressionen af ​​tumorafledte faktorer. Ekspression af PML blev omvendt korreleret med omfanget af infiltration af CD8

+ T-celler i gastriske carcinomer. PML tab blev yderligere forbundet med forøget ekspression af IP-10, en af ​​de lymfocyt-tiltrækkende CXC chemokiner, i gastriske carcinomceller og væv. PML knockdown fremmes IFN-γ-medieret STAT-1-binding til IP-10-promotoren, resulterer i forøget transkription af undersøgelsesperioden-10-genet. Vore data understøtter den opfattelse, at PML er involveret i rekrutteringen af ​​lymfocytter til tumorer,

via

modulation af ekspressionsniveauerne af tumorafledte faktorer, herunder IP-10, hvilket giver yderligere beviser på, at tabet af tumorsuppressorgener i tumor celler deltager aktivt i etableringen af ​​tumor mikromiljøer.

Resultater

Tab af PML protein er forbundet med øget infiltration af CD8

+ T-celler i fremskreden gastrisk karcinom væv

Immunohistokemisk farvning for PML og CD8 blev udført for at undersøge, om omfanget af lymfocytinfiltrering var forbundet med PML ekspression status i fremskreden gastrisk cancer. CD8-immunpositive celler blev optalt som beskrevet i Materialer og Metoder. I alt 35 prøver (71,4%) viste delvis-til-fuldstændigt tab af PML i tumor cellekerner i fase IV avancerede gastriske carcinomer. Prøver fra 14 avancerede gastriske carcinoma patienter var diffust positive for PML, og indeholdt et gennemsnit på 32,7 CD8

+ T-celler pr felt (figur 1A). Vi identificerede 19 tilfælde af fremskreden gastrisk karcinom udviser omdrejningspunkt positivitet for PML, med et gennemsnit på 47,2 CD8

+ T-celler pr felt. Desuden blev fuldstændig tab af PML observeret i 16 avancerede gastrisk karcinom patienter; prøverne indeholdt et gennemsnitligt antal 52,8 CD8

+ T-celler pr. Prøver viser omdrejningspunkt positivitet eller fuldstændig tab for PML viste en mere markant stigning i CD8

+ T-celletal end prøver gjorde udstille diffus positivitet for PML. Repræsentative billeder er vist i figur 1B. Selvom PML proteinekspression blev reduceret eller afskaffet i tumorceller, alle normale gastriske mucosale kirtler, stromale væv og lymfoide celler, udviste diffus moderat til stærk nuklear immunopositivitet for PML.

(A) Immunohistokemisk farvning for PML protein og CD8 blev udført i 49 tilfælde af trin IV avancerede gastriske carcinomer. Immunopositivitet for PML-protein blev kategoriseret som diffus positivitet (DP, nuklear immunoreaktivitet i ≥50% af tumorcellerne, n = 14), fokal positivitet (FP, i ≥10%, men 50%, n = 19), eller fuldstændigt tab (Cl; i 10%, n = 16). Antallet af CD8 immunpositive celler i en høj effekt felt (HPF, x40) på 0,25 mm

2 til fem tilfældigt udvalgte tumor infiltrative grænser blev talt for hver prøve, efterfulgt af beregning af middelværdi og SD. (B) Repræsentative billeder, der viser PML proteinekspression og CD8

+ T-celle infiltration i avancerede gastrisk karcinom væv. Barer, SD. *

P

. 0,05

PML påvirkninger T-celle infiltration /migration

in vitro

I betragtning af tabet af PML proteinekspression og stigningen i infiltration af CD8

+ T-lymfocytter i avancerede gastriske carcinoma væv, vi hypotese, at PML bidrog til T-celleinfiltration /migration i gastrisk cancer. At undersøge, om PML niveau i gastriske cancerceller påvirket T-celle-migration, konditionerede medier fra SNU-638 celler transient transficeret med enten

Pml

siRNA eller PML IV ekspressionsvektor, derefter behandlet med IFN-γ blev anvendt i Transwell migration assays. SNU-638 gastriske cancerceller udtrykte høje niveauer af PML protein, i overensstemmelse med tidligere resultater [2], mens SNU-638-celler transficeret med

Pml

siRNA de viste reducerede niveauer af endogen PML udtryk (~46-56%) som bekræftet ved immunoblotting (figur 2A). IFN-γ inducerede en beskeden stigning i PML proteinekspression efter aftale med tidligere resultater [38]. Migration af Jurkat T-celler mod konditioneret medium fra

PML

siRNA-transficerede SNU-638-celler blev signifikant forøget, sammenlignet med den af ​​kontrol siRNA-transficerede celler, efter behandling med IFN-γ (figur 2B). Efter transfektion af SNU-638 med PML IV ekspressionsvektor, migration af Jurkat T-celler mod konditioneret medium fra PML IV overudtrykte celler var reduceret sammenlignet med den for tom vektor (figur 2C). Disse resultater antyder, at PML regulerer niveauerne af sekretoriske molekyler produceret af og frigivet fra IFN-γ-stimulerede gastriske cancerceller, og også påvirker migreringen af ​​T-lymfocytter. Salg

(A) SNU-638 gastriske cancerceller blev transient transficeret med

Pml

siRNA eller kontrol siRNA. To dage efter transfektion blev celler behandlet med eller uden interferon-gamma (IFN-γ (10 ng /ml) i 8 timer og lyseret og analyseret ved immunblotting. Effektiv siRNA-medieret suppression af PML-protein-ekspression blev verificeret for hvert assay ved immunoblotting . (B) Jurkat celler og kultursupernatanter fra SNU-638 celler, som transient transficeret med enten kontrol siRNA eller

Pml

siRNA blev analyseret ved en transwell migration assay. efter transfektion SNU-638 celler blev inkuberet med IFN -γ (10 ng /ml) i 8 timer eller venstre ubehandlet, og de opsamlede supernatanter blev anbragt i de nedre kamre. de øvre kamre modtog 5 × 10

5 Jurkat-celler i et volumen på 100 pi og Transwell migration enheder blev inkuberet ved 37 ° C i 2 timer. migration af Jurkat-celler fra det øvre til nedre kammer blev analyseret ved at undersøge celler høstet fra de nedre kamre af fluorescerende count-bead medierede tælling på et flowcytometer. Relativ cellemigrering blev bestemt med antallet af migrerede celler normaliseret til antallet af celler migrerer til supernatanter fra SNU-638 celler transient transficeret med kontrol siRNA uden IFN-γ, og værdien fra parentale celler blev arbitrært fastsat til 1. (C) SNU-638 gastriske cancerceller blev forbigående transficeret med enten tom vektor (Mock) eller PML IV ekspressionsvektor (PML IV). Dag efter transfektion blev celler behandlet med eller uden IFN-γ (10 ng /ml) i 8 timer og kultursupernatanter blev opnået og underkastet Transwell migration assay som beskrevet i B. PML-proteinekspression blev bekræftet for hver analyse ved immunoblotting. De viste data er repræsentative for mindst tre forsøg. Barer, SD. *

P

. 0,05

Tab af PML øger IFN-γ-induceret IP-10-ekspression

kemokiner, en familie af kemotaktiske cytokiner, fremme migration af cirkulerende leukocytter /lymfocytter til steder med inflammation og skade. At undersøge, om kemokinniveauer påvirket af

Pml

genetiske status, blev chemokin genekspression undersøgt ved hjælp af beskyttelse ribonuclease assay (RPA).

Pml

+ /+ og

Pml

– /- mus embryonale fibroblast (MEF) celler blev inkuberet i fravær eller tilstedeværelse af IFN-γ for 0-24 timer , totalt mRNA blev opsamlet på forskellige tidspunkter, og underkastet RPA. I

Pml

– /- MEF’er, IP-10 mRNA niveauer steg 1,5 gange ved 2 timer, og blev markant forhøjet (8 gange) med 4 timer (figur 3A). RANTES mRNA niveauer blev forøget 3,2-fold ved 0,5 time, og forblev forhøjede, men i mindre grad (1,3 gange), 8 timer efter IFN-γ behandling i

PML Salg

– /- MEF’er . Andre chemokin gener, herunder MIP-1, MIP-2, og MCP-1, blev ikke påviseligt udtrykt i

Pml

+ /+ eller

Pml

– /- MEF’er (data ikke vist). STAT-1-ekspression blev øget efter udsættelse for IFN-γ i begge celletyper, men ingen forskel var tydelig, når IFN-y-niveauer blev sammenlignet mellem

Pml

+ /+ og

Pml

– /- celler. Som transskription af IP-10-genet væsentligt blev forhøjet i IFN-γ-stimuleret

Pml

– /- MEF’er, vi målte relevante protein niveauer i dyrkningssupernatanter af

Pml

+ /+ og

Pml

– /- MEF’er, under anvendelse af et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA). I overensstemmelse med RPA resultater, højere niveauer af IP-10-protein var tydelige i konditioneret medium fra IFN-γ-behandlede

Pml

– /- MEF’er (figur 3B). Også, IP-10 mRNA-ekspression i

PML

siRNA-transficerede NIH3T3-celler blev forøget, sammenlignet med den af ​​kontrol siRNA-transficerede celler, efter IFN-γ behandling (figur 3C). Reduktionen i ekspressionen af ​​PML protein i

PML

siRNA-transficerede NIH3T3 celler blev bekræftet ved immunoblotting

-. /- MEF’er forhold til

Pml

+ /+ Salg vildtypeceller. (A) RNA fra

Pml

+ /+ og Pml

– /- MEF’er behandlet med IFN-γ (10 ng /ml) i 0-24 timer blev underkastet ribonuklease beskyttelse assay ( RPA). Kvantificering af IP-10, RANTES og STAT-1-mRNA (fold forøgelse) blev beregnet ved at dividere densitometrisk værdi af hver bane med den tilsvarende GAPDH værdi. (B)

Pml

+ /+

Pml

– /- MEF’er celler blev inkuberet i fravær eller nærvær af IFN-γ (10 ng /ml) i 12 timer. IP-10-proteinet fra kultursupernatanterne blev analyseret ved ELISA og normaliseret ved koncentration cellens protein. Den relative koncentration blev beregnet som den normaliserede mængde divideret med den normaliserede værdi af ubehandlet

Pml

– /- MEF’er celler. (C) NIH3T3 fibroblaster blev transient transficeret med enten

Pml

siRNA eller kontrol siRNA. To dage efter transfektion blev celler behandlet med eller uden IFN-γ for 0-24 timer og analyseret ved immunoblotting til detektering af PML proteinekspression og RT-PCR for IP-10 mRNA. Kvantificering (Quant) af IP-10 mRNA blev beregnet ved at dividere densitometrisk værdi af hver bane med den tilsvarende actin mRNA værdi. De viste data er repræsentative for mindst tre forsøg. Barer, SD. *

P

. 0,01

Reduceret PML udtryk er omvendt korreleret med IP-10 protein niveauer i mavekræft væv og SNU-638 celler

Næste, vi undersøgte sammenhængen mellem IP-10 og PML proteinekspression i avanceret gastrisk karcinom væv. Cancervæv blev immunhistokemisk farvet for PML og IP-10, og intensiteten af ​​IP-10 immunopositivitet blev målt som beskrevet i Materialer og Metoder. Den gennemsnitlige intensitet IP-10 var 1,2 i 14 prøver, der viser diffuse positivitet (DP) for PML, 2,2 i 19 tilfælde af fokal positivitet (FP), og 2,0 i 16 prøver, hvor der var fuldstændig tab (CL) af PML udtryk ( Figur 4A, venstre panel). Betydelige stigninger i IP-10-ekspression blev observeret i prøver viser omdrejningspunkt positivitet for PML (

P

= 0,034) sammenlignet med dem, der viser diffus positive PML udtryk. En stigning i IP-10 ekspression blev observeret, når fuldstændig tab af PML var tydelig, sammenlignet med, hvad der blev bemærket, da PML var diffust udtryk; dog har denne forskel ikke statistisk signifikans. Repræsentative eksempler på variationer i PML protein status, korreleret med forskellige IP-10 ekspressionsniveauer i tumorceller fra avancerede gastriske carcinomer er vist (figur 4A, højre). For yderligere at undersøge forholdet mellem IP-10 og PML proteinekspression i gastrisk karcinom cellelinjer, IP-10 protein niveauer er målt i dyrkningssupernatanter fra SNU-638 celler forbigående transficeret med enten

Pml

siRNA eller PML IV exression vektor. Celler blev dyrket i fravær eller nærvær af IFN-γ i 8 timer, supernatanterne opsamlet, og IP-10 niveauer kvantificeres deri (ved ELISA). IFN-γ-induceret IP-10-sekretion blev signifikant forøget i SNU-638-

PML

siRNA-transficerede celler, sammenlignet med den for SNU-638-celler transficeret med kontrol siRNA (figur 4B). Transfektion af SNU-638 med PML IV ekspressionsvektor undertrykte IFN-γ-induceret IP-10-sekretion (figur 4C). Resultaterne viser klart, at sekretion af IP-10 fra gastriske cancerceller forøges, når PML ekspression reduceres.

(A) Immunohistokemisk farvning for PML og IP-10-proteinekspression blev udført i 49 tilfælde af trin IV advanced gastriske carcinomer. Immunopositivitet for PML protein blev kategoriseret som diffus positivitet (DP, nuklear immunoreaktivitet i ≥50% af tumorcellerne), fokal positivitet (FP, i ≥10%, men 50%), eller fuldstændig tab (CL, i 10% ). Til kvantitativ analyse af immunoreaktiviteten af ​​IP-10, positivt farvede områder blev målt ved anvendelse af et ImageJ software program som beskrevet i Materialer og Metoder. Repræsentative billeder viser PML og IP-10 protein-ekspression i avancerede gastrisk karcinom væv (til højre). (B) SNU-638 celler blev forbigående transficeret med

Pml

siRNA eller kontrollere siRNA. To dage efter transfektion blev celler inkuberet i fravær eller nærvær af IFN-γ (10 ng /ml) i 8 timer. IP-10-proteinet fra kultursupernatanterne blev analyseret ved ELISA og normaliseret ved koncentration cellens protein. Den relative koncentration blev beregnet som den normaliserede mængde divideret med den normaliserede værdi af SNU-638 celler, som transient transficeret med kontrol-siRNA i nærvær af IFN-γ, og koncentrationen fra parentale celler blev arbitrært sat til 100%. (C) SNU-638 gastriske cancerceller blev transient transficeret med enten tom vektor eller PML IV ekspressionsvektor. Dag efter transfektion blev celler behandlet med eller uden IFN-γ (10 ng /ml) i 8 timer og kultursupernatanter blev opnået og underkastet ELISA som beskrevet i B. PML-proteinekspression blev bekræftet for hver analyse ved immunoblotting. De viste data er repræsentative for mindst tre forsøg. Barer, SD. *

P

0,05, **

P

. 0,01

IP-10 neutralisering reducerer migration af T-celler

som SNU-638-

PML

siRNA-holdige celler, der udtrykker reducerede niveauer af PML-proteinet viste forøgelse af T-celle rekruttering og IP-10-sekretion i respons på IFN-γ (figur 2 og 4), vi næste undersøgt om en stigning i IP-10 niveauer lettet T-celle migrering til konditioneret medium fra SNU-638 gastriske kræftceller stimuleret af IFN-γ. SNU-638-

Pml

siRNA celler blev dyrket i fravær eller nærvær af IFN-γ i 8 timer, og de opsamlede supernatanter blev forbehandlet med et anti-IP-10-neutraliserende antistof eller kontrol-ikke-specifik IgG i 1 h før påbegyndelse af Transwell assay. Neutraliserende antistof eller IgG-holdige supernatanter blev anbragt i de nedre kamre, og migrationen af ​​Jurkat-celler fra øvre til nedre kamre blev analyseret ved at undersøge celler høstet fra de nedre kamre. Inklusion af IP-10-neutraliserende antistoffer inhiberede Jurkat T-celle-migrering til konditioneret medium fra SNU-638-

Pml

siRNA-celler (figur 5A). Disse resultater er i overensstemmelse med oplysningerne fra NIH3T3 celler; en IP-10-neutraliserende antistof inhiberede EL-4 T-celle migrering til konditioneret medium fra NIH3T3-

Pml

siRNA-celler (figur 5B).

(A) SNU-638-

PML

siRNA-celler blev dyrket i fravær eller nærvær af IFN-γ (10 ng /ml) i 8 timer, og supernatanten blev opsamlet og forbehandlet med IP-10 neutraliserende antistoffer (5 ug /ml) eller IgG (5 ug /ml) i 1 time før initiering af Transwell migration assay. Antallet af migrerende Jurkat celler opnået fra det nedre kammer blev analyseret ved fluorescerende count-bead medieret tælling på et flowcytometer. (B) Transwell migration af EL-4 celler til kultursupernatanter fra NIH3T3-celler transient transficeret med

Pml

siRNA i nærvær af neutraliserende IP-10-antistof eller IgG-kontrol. Relativ cellemigrering blev bestemt af antallet af de migrerede celler divideret med antallet af celler migrerer til supernatanter uden IFN-γ, og værdien fra parentale celler blev arbitrært fastsat til 1. viste data er repræsentative for mindst tre eksperimenter. Barer, SD. *

P

. 0,05

PML knockdown øger IP-10-promotor aktivering

Som IP-10-ekspression blev øget i PML knockdown celler, vi nærmere hvorvidt PML-proteinekspression påvirket IP-10-promotor-aktivitet. Det murine IP-10-promotoren indeholder et formodet GAS element ligger mellem nts -246 og -238 (TTN

5AA) (figur 6A). Vi har tidligere rapporteret, at PML negativt regulerer den transskriptionelle aktivitet af STAT-1 [17]. For at undersøge, om PML påvirkede IFN-γ-induceret IP-10 genekspression

via

en mekanisme, der involverer STAT-1, isolerede vi og genererede en reporter konstruktion begynder ved position -330 af det murine IP-10-promotor, der indeholder formodede GAS element, som beskrevet i Materialer og Metoder. IP-10-

luc

reporter indeholdende GAS element blev forbigående transficeret ind i NIH3T3-celler inkuberet med eller uden IFN-γ i 24 timer, og efterfølgende analyseret for luciferaseaktivitet. IFN-γ-induceret IP-10-promotor-aktivitet blev væsentligt forbedret i NIH3T3 celler transficeret med

Pml

siRNA, sammenlignet med celler, der modtager kontrol siRNA (figur 6B). Efter transfektion af NIH3T3-celler med PML IV ekspressionsvektoren, blev IFN-γ-induceret IP-10 promotoraktivering betydeligt undertrykt. Nedregulering af PML udtryk med

Pml

siRNA og overekspression af PML af PML IV ekspressionsvektoren blev verificeret ved immunoblotting. For at bestemme om der forekom den inhiberende virkning af PML på IFN-γ-induceret IP-10 promotoraktivitet i gastrisk cancer cellelinier udførte vi lignende forsøg med SNU-638 gastriske cancerceller. Mønstrene for stigning og fald i luciferaseaktiviteten i SNU-638 var svarende til den i NIH3T3-celler (Figur 6C). Niveauet af PML proteinekspression i SNU-638-celler transficeret med enten

Pml

siRNA eller PML IV ekspressionsvektoren blev bekræftet ved immunoblotting (data ikke vist).

(A) Det murine IP- 10-promotoren indeholder et formodet GAS element (understreget). (B) NIH3T3-celler blev co-transficeret med IP-10-luc reporter indeholder en gas element og /eller

Pml

siRNA, eller PML IV proteinekspressionsvektor. Celler var enten ubehandlede eller behandlet med murin IFN-γ (10 ng /ml) i 24 timer, og derefter luciferaseaktivitet blev bestemt. PCMV-β-galactosidase vektor blev indbefattet for at normalisere transfektionseffektiviteten. Luciferaseaktivitet er normaliseret til aktiviteten i fravær af IFN-γ og aktiviteten fra forældrenes celler blev arbitrært sat til 100% (RLA, relativ luciferaseaktivitet). Øget eller nedsat PML proteinekspression i cellelysater transficeret med enten PML IV ekspressionsvektor eller

Pml

siRNA blev bekræftet ved immunoblotting hhv. (C) SNU-638 gastriske cancerceller blev cotransficeret med IP-10-luc reporter indeholder en gas element og /eller

Pml

siRNA, eller PML IV protein ekspressionsvektor og analyseret som beskrevet i B. Værdier er middelværdien ± SD af tre separate forsøg. Barer, SD. *

P

0,05, **

P

. 0,001

PML knockdown stigninger IFN-γ-induceret STAT-1 DNA-binding til IP -10 promotor

effekten af ​​PML på IFN-γ-induceret STAT-1 DNA-binding til IP-10-promotor blev undersøgt yderligere. PML-protein-overekspression i NIH3T3-celler, efter transient transfektion med PML IV ekspressionsvektoren, delvist blokeret IFN-γ-induceret STAT-1-DNA-binding til IP-10-promotoren, herunder en sekvens på -246 til -238 (figur 7A, sammenlign bane 3 og 5). Konkurrence anvendelse af en 100-molært overskud af umærket oligonukleotid, der koder IP-10-promotoren ophævet kompleksdannelse (bane 6). Niveauerne af PML og STAT-1 protein-ekspression i helcellelysater (WCL) og omfanget af STAT-1-tyrosinphosphorylering i kerneekstrakter (NE) blev verificeret ved immunoblotting. Ved hjælp NE fra NIH3T3-

Pml

siRNA-celler opnået efter 0,5 h af IFN-γ behandling, stærk binding til murine IP-10-promotoren blev observeret (figur 7B, øverste panel, bane 5), sammenlignet med binding set i NIH3T3-kontrol siRNA celler (bane 3). De samme NE blev udsat for STAT-1 konsensus oligonukleotid, og STAT-1 DNA-binding blev forbedret i NE fra NIH3T3-

Pml

siRNA-celler (Figur 7B, midterste panel, sammenligne banerne 3 og 5). Brug af SNU-638 gastriske kræftceller, vi fandt også, at STAT-1-DNA binding af

PML

siRNA-transficerede SNU-638-celler var forøget sammenlignet med den af ​​kontrol siRNA-transficerede celler, efter behandling med IFN-γ (figur 7C, sammenlign bane 3 og 5). Disse data indikerer, at PML delvist inhiberer STAT-1-binding til IP-10-promotoren, og at denne virkning er korreleret med øget IFN-γ-induceret IP-10 transkription i fravær af PML.

(A) nukleare ekstrakter (NE) fra NIH3T3-celler transient transficeret med PML IV protein ekspressionsvektor og behandlet med IFN-γ (10 ng /ml) i 30 min blev inkuberet i nærvær af en radioaktivt mærket DNA-probe indeholdende GAS element af IP-10-promotor, og underkastet elektroforetisk mobilitet (EMSA). Forskudte probe-protein-komplekser er angivet med pilen. Forøget PML proteinekspression i helcellelysater (WCL) transficeret med PML IV ekspressionsvektoren blev bekræftet ved immunoblotting. Mængden af ​​histon i NE er vist som en kontrol. (B) NE fra NIH3T3-celler transient transficeret med enten

Pml

siRNA eller kontrol siRNA og behandlet med IFN-γ (10 ng /ml) i 30 min blev inkuberet i nærvær af radiomærkede DNA-prober indeholdende gas- lignende element af undersøgelsesperioden-10-promotoren eller en STAT-1 konsensussekvensen, og derefter underkastet EMSA. Bindingsspecificiteten blev testet ved tilsætning af stigende koncentrationer af kold probe (konkurrent). Effektiv siRNA-medieret undertrykkelse af PML proteinekspression blev verificeret for hver analyse ved immunoblotting. (C) SNU-638 gastriske cancerceller blev transient transficeret med enten

Pml

siRNA eller kontrol siRNA og behandlet med IFN-γ (10 ng /ml) i 30 min. NE blev opnået, inkuberet i tilstedeværelsen af ​​radioaktivt mærkede DNA-prober, der indeholder en STAT-1 konsensus sekvens, og derefter analyseret for EMSA som beskrevet i B. Niveauerne af PML og STAT-1 protein-ekspression i WCL og omfanget af STAT-1 tyrosin fosforylering i NE blev verificeret ved immunoblotting. De viste data er repræsentative for mindst tre forsøg.

Diskussion

Histopatologiske undersøgelser har vist, at den inflammatoriske mikromiljø af tumorer er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​mononukleære celleinfiltrater, både i den understøttende stroma og tumor regioner. Men de præcise mekanismer, hvormed mononukleære celler infiltrere og vedvarende indenfor kræft væv er i øjeblikket ikke fuldt forstået. I den foreliggende undersøgelse, tilbyder vi bevis for, at tab af ekspression af tumor-suppressor protein, PML, bidrager til en forbedring af lymfocytinfiltrering i gastrisk cancer væv,

via

regulering af IP-10 ekspression.

Vi undersøgte funktionen af ​​PML med hensyn til lymfocyt rekruttering ved hjælp af humane gastrisk cancer vævsprøver,

Pml

+ /+ og

Pml

– /- MEF’er, og PML knockdown i både NIH3T3 og SNU-638 celler. Data fra både væv tests menneskelige og Transwell migration analyser viste, at tabet af PML fremmer lymfocyt menneskehandel; således, søgte vi mekanismer, der kunne muligvis forklare disse iagttagelser. Vi viser, at en stigning i IP-10 niveauer i cancerceller udtrykker lave niveauer af PML bidrager til lymfocyt rekruttering.