PLoS ONE: Dereguleret Angivelse af Aurora-kinaser er ikke prognostisk Biomarkør i Papillær kræft i skjoldbruskkirtlen patienter

Abstrakt

En række rapporter viste, at Aurora-A eller Aurora-B overekspression repræsenterede en negativ prognostisk faktor i flere humane maligniteter. I kræft i skjoldbruskkirtlen væv et dereguleret udtryk for Aurora kinaser er også blevet påvist, butno oplysninger om sin mulige prognostisk rolle i differentieret kræft i skjoldbruskkirtlen er tilgængelig. Her weevaluated Aurora-A og Aurora-B mRNA-ekspression og dens prognostisk relevans i en serie af 87 papillære skjoldbruskkirtelkræft (PTC), med en median opfølgning på 63 måneder. Analysen af ​​Aurora-A og Aurora-B mRNA-niveauer i PTC væv, sammenlignet med normale matchede væv, viste, at deres ekspression var enten op- eller ned-regulatedin størstedelen af ​​cancervæv. Især blev Aurora-A og Aurora-B mRNA-niveauer ændres i henholdsvis 55 (63,2%) og 79 (90,8%) ud af 87 PTC analyzed.A signifikant positiv korrelation mellem Aurora-A og Aurora-B mRNAswas observeret (p = 0,001). Den ekspression af begge Aurora gener blev ikke påvirket af BRAF

V600E mutation. Univariate, multivariate og Kaplan-Mayer analyser dokumenteret den manglende sammenhæng mellem Aurora-A eller Aurora-B-ekspression og klinisk-patologisk parameterssuch som køn, alder, tumorstørrelse, histologi, TNM stadie, lymfeknude metastaser og BRAF status samt asdisease gentagelser eller sygdom -fri interval. Kun Aurora-B-mRNA var signifikant højere i T (3-4) væv, med hensyn til t (1-2) PTC væv. De her rapporterede data viser, at ekspressionen af ​​Aurora-kinaser er dereguleret i størstedelen af ​​PTC væv, sandsynligvis bidrager til PTC progression. Men anderledes end andre humane faste cancerformer, påvisning af Aurora-A eller Aurora-B mRNA er ikke en prognostisk biomarkør inPTC patienter

Henvisning:. Baldini E, Tuccilli C, Prinzi N, Sorrenti S, Falvo L, de Vito C, et al. (2015) Dereguleret ekspression af Aurora-kinaser er ikke prognostisk Biomarkør i Papillær kræft i skjoldbruskkirtlen patienter. PLoS ONE 10 (3): e0121514. doi: 10,1371 /journal.pone.0121514

Academic Redaktør: Adriano Angelucci, University of L’Aquila, Italien

Modtaget: 9. december 2014 Accepteret: 2 februar 2015; Udgivet: 25 Mar 2015

Copyright: © 2015 Baldini et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde var støtte af en bevilling (PRIN 2010BX2SNA_007) af Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

forekomsten af ​​differentierede skjoldbruskkirtelkræft (DTC) har været stigende i de seneste årtier, hovedsageligt på grund af den voksende evne til at diagnosticere malign transformation i små ikke-håndgribelige knuder [1-4]. DTC omfatter to vigtigste histologiske enheder, den sjældne follikulært skjoldbruskkirtlen karcinom (FTC) og themore fælles papillær skjoldbruskkirtlen karcinom (PTC). Efter dedifferentiering antages DTCare at generere dårligt DTC (PDTC) og meget aggressive anaplastisk thyroidcarcinomer (ATC) [5-6]. Relevante molekylære ændringer forekommer i kræft i skjoldbruskkirtlen progression omfatter gen omlejringer af tyrosinkinase-receptorer, såsom RET /PTC og NTRK1, aktiverende punktmutationer af ras og BRAF generne, og den onkogene fusionsprotein PAX8-PPARy [7].

prognosen for DTC patienter er som regel gunstige, med en 10-årig overlevelsesrate for ca. 90% af dem. Ikke desto mindre, omkring 20% ​​af patienterne står sygdomstilbagefald og DTC-relaterede dødsfald [8]. Lagdeling og prognose af DTC patienter afhængige klinisk-patologiske variabler som patientens alder, tumorstørrelse, histologi lymfe nodal eller fjernmetastaser [8-11]. Disse parametre er imidlertid i stand til at levere kun et groft forudsigelse af resultatet sygdom, placere patienter med meget forskellige sygdomsspecifikke progression og overlevelse gange inden for samme risikogruppe. Tilsvarende de undlader at forudsige risikoen for kræft tilbagefald. Derfor er identifikation af nye prognostiske molekylære biomarkører i stand til at vidne tumor aggressivitet kræves [11-17].

Den genetiske ustabilitet fører til celle aneuploidi og overgang til mere aggressive fænotyper repræsenterer kendetegnende for massive kræftformer, herunder skjoldbruskkirtlen karcinomer [18-22] .I virkeligheden, antallet og hyppigheden af ​​kromosomafvigelser observeret i skjoldbruskkirtelkræft stige fra DTC til PDTC og ATC [5, 20]. Forskellige mitotiske kinaser, hvis udtryk eller funktion er fundet ændret i kræftceller, er ansvarlig for tumor genetisk ustabilitet. Disse omfatter de tre Aurora kinase familiemedlemmer, Aurora-A, -B og -C, impliceret i reguleringen af ​​flere aspekter af kromosom adskillelse og cytokinese [23]. Under cellecyklussen, er deres ekspression nøje reguleret, er maksimal i G2 /M-fasen, mens deres hurtige nedbrydning i slutningen af ​​mitose af ubiquitinproteasomvejen nødvendig, for at cellen til at indgå i en ny celle cyklus [23 ]. Aurora-A-lokaliserer onto duplikerede centrosomer og er involveret i mitotisk indrejse, centrosom og spindel modning, mens Aurora-B associerer med kromatin hvor det danner den såkaldte kromosomal passager kompleks (CPC) med andre proteiner såsom INCENP, survivin og borealin , der deltager i kromosom kondens [23]. Desuden under overgangen fra anafase til telofase, Aurora-B spiller en rolle i mitosespindelen dynamik, tilslutninger af kromosomer til spindel mikrotubuli, og spaltning fure. Aurora-C udtrykkes hovedsageligt i testis og i lighed med aurora-B, har det vist sig at deltage i CPC i mitotiske celler [23]. I betragtning af de afgørende opgaver Aurora-kinaser i alle mitotiske stadier, deres dysfunktion og /eller dysregulering holdes ansvarlig, i det mindste delvis, for de unormale celledelinger og aneuploidi observeret i maligne celler. Efter aftale med dette, har overekspression af Aurora-A og /eller Aurora-B vist sig at associere med en dårlig prognose i flere humane maligniteter, herunder bryst-, mave-, prostata-, hoved og hals, blære, æggestokke, tyktarm, adrenokortikalt og lunge kræftformer [24-31].

data fra vores egen og andre forskergrupper, som tidligere viste en ændret udtryk for Aurora-kinaser i forskellige kræft i skjoldbruskkirtlen afledte cellelinjer og væv [32-35]. Selv om disse kinaser nu dukker op som lovende nye terapeutiske mål for kræft i skjoldbruskkirtlen behandling, har ingen forsøg været madeso langt for at vurdere den mulige prognostiske værdi af Aurora-kinaser i PTC patienter [23, 36-39]. I den foreliggende studywe evalueret ved hjælp af kvantitativ RT-PCR, ekspressionsniveauet af Aurora-A og Aurora-B i et casestudie af 87 PTC væv matchet mod normalt væv. Data blev derefter korreleret med de klinisk-patologiske parametre og med sygdomsfrit interval af patienterne. Eftersom BRAF

V600E mutation, den hyppigst forekommende ændring i PTC, blev for nylig vist at inducere ekspressionen af ​​Aurora-B i melanomceller, virkningerne af BRAF mutation på ekspressionen af ​​Aurora-kinaser i PTC væv blev også evalueret [40]

Materialer og metoder

Vævsprøver, histologi og patientens iscenesættelse

casestudiet omfattede 87 konsekutive patienter.; normale og matchede tumor skjoldbruskkirtlen væv blev opnået fra kirurgiske prøver af 19 mænd og 68 kvinder (alder range 11-83 yrs, median 44.21yrs), der gennemgik total thyreoidektomi for PTC i Kirurgisk Afdeling Sciences, “Sapienza” universitetet i Rom (n = 31), eller i afdelingen for medicinske og kirurgiske Sciences, University of Padua, Italien (n = 56) .Alle patienter gav deres skriftligt informeret samtykke. For tre mindreårige patienter blev opnået skriftligt informeret samtykke fra deres forældre. Undersøgelsen blev godkendt af Policlinico Umberto I hospitalet etiske komité (Ref. 2615). Vævsprøver blev opsamlet, frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. Af de 87 PTC patienterne, 76 udstillede den klassiske, 10 den follikulære, og en den høje celle variant. To forskellige histopathologists gjorde de histologiske diagnoser uafhængigt i henhold til World Health Organization klassifikation og i blinde måde i forhold til Aurora kinase udtryk [41]. På tidspunktet for kirurgi blev der lymfeknudemetastaser fundet i 38 patienter. Efter TNM mellemstationer blev 54 patienter identificeret som værende i fase I, 1 på trin II, 25 ved stadium III og 7 på trin IV. Fyrre til halvtreds dage efter operationen, alle patienter undergik radioiod terapi og den efterfølgende hele kroppen scanning (WBS) viste fravær af metastaser. Patienter så begyndte thyreoideahormon substitutionsterapi. For at sikre deres sygdomsfri tilstand, 4 til 5 måneder senere alle patienter undergik hals ultralyd og serum thyroglobulin (Tg) måling. Tilbagefald blev diagnosticeret med bøde-nål aspiration (FNA) cytologi,

131I WBS eller histologiske analyse efter kirurgisk resektion af læsionen. Af de 87 patienter, opfølgning (median 63 måneder, rækkevidde 8-133months) var til rådighed for 78 (18 mænd og 60 kvinder med en gennemsnitsalder på 44yr), 52of hvem var på TNM stadie I-II, og de resterende 26 på stadie III-IV. Den nedre grænse for gange-til-tilbagefald startede på 6 måneder. Under de opfølgende 21 gentagelser blev registreret, 17 er cervikale lymfeknuder, diagnosticeret af FNA cytologi, og 4 lungemetastaser, diagnosticeret af WBS.

Bestemmelse af BRAF

V600E mutation

genomisk DNA blev ekstraheret fra de frosne væv ved hjælp af DNeasy blod og væv kit ifølge producentens protokol. BRAF status exon 15 blev vurderet ved både direkte sekventering og mutant allel-specifik PCR-amplifikation for T til A substitution i nukleotid 1799 (V600E), ved anvendelse af fremgangsmåden tidligere describedand i blinde måde i forhold til Aurora kinase-ekspression [42].

PCCL3 cellekultur

Den godt differentieret, ikke-transformerede rotte skjoldbruskkirtel epitelial cellelinje PCCL3 var en gave fra Dr. JA Fagin (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York). Cellerne blev opformeret i H4 komplet medium bestående af Coon medium /F12 høj zink suppleret med 5% føtalt bovint serum, 0,3 mg /ml L-glutamin, 1 mIU /ml TSH, 10 ug /ml insulin, 5 pg /ml Apo transferrin, 10 nM hydrocortison, og penicillin /streptomycin. Disse celler konditionelt udtrykker BRAF

V600E i en doxycyclin-afhængig måde [43]. Den BRAF

V600E induktion blev opnået ved at tilsætte til H4 komplette medium doxycyclin 1 mg /ml, og inkubere cellerne i 48 timer.

Udvinding og analyse af mRNA

De skjoldbruskkirtlen væv var homogeniseret med ultra-turrax, og total RNA blev ekstraheret fra væv eller PCCL3 celler anvender syreguanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform-metoden [44]. Den første cDNA streng blev syntetiseret ud fra 5 ug RNA med M-MLV revers transkriptase og forankret oligo (dT) 23-primere (Sigma Chemicals Co.). Parallelle kontroller for DNA-kontaminering blev udført udelade revers transkriptase. De opnåede templates blev anvendt til kvantitativ PCR-amplifikationer af Aurora kinaser og husholdningsgener anvender LightCycler instrument (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), SYBR Premix Ex Taq II (TliRNase H Plus) (Takara, Otsu, Shiga, Japan) og specifikke primere, der er opført i tabel 1. amplikon specificiteter blev kontrolleret ved automatiseret DNA-sekventering (Primm, San Raffaele Biomedical Science Park, Milano, Italien) og evaluering af smeltetemperaturer, og /eller elektroforese på 2% agarosegel indeholdende ethidiumbromid. Standardkurver for alle gener blev opnået med fem gange fortyndinger af PCCL3 celler eller blandet humant thyreoideavæv cDNA. Beregning af data for humane skjoldbruskkirtlen væv blev udført af den relative ekspression Software Tool (REST 2009) ved hjælp af en normalisering faktor (NF) beregnes som det geometriske medier af 3 referencepunkter gener (GAPDH, RPL13A og SDHA), som tidligere beskrevet [45, 46 ]. Den fold ændring af Aurora kinase udtryk for hver tumor prøve blev henvist til sin normale modstykke. Denne analyse blev performedin blind måde i forhold til histologiske og kliniske data for patienter. Fold variationer mellem 0,8 og 1,2 blev anset uændret. Beregninger af dataene for forsøg med PCCL3 celler blev udført under anvendelse af LightCycler relative kvantificering software 1.0 (Roche Diagnostics), og folden ekspression af Aurora-kinaser for doxycyclin-behandlede PCCL3 celler blev normaliseret mod ikke-behandlede celler. Alle resultater rapporteres som middelværdi ± SEM og medianværdier.

Statistisk analyse

Den ikke-parametriske Mann Whitney test blev anvendt til at beregne den statistiske signifikans af forskelle i ekspressionsniveauerne af Aurora-kinaser i PTC med dereguleret udtryk versus PTC med uændrede mRNA-niveauer, og i vildtype versus muterede BRAF prøver. Desuden associering af ekspressionen af ​​Aurora-kinaser med køn, histologi lymfeknudemetastase, TNM stadie eller tilbagefald blev vurderet ved Mann Whitney testen. Analyserne af sammenhængen mellem Aurora-A og Aurora-B mRNA’er niveauer, samt mellem disse og alder blev udført under anvendelse af Rho Spearman testen. For at vurdere den uafhængige sammenslutning af Aurora-kinaser med DFI, blev Cox regression tekst anvendes. Virkningen af ​​Aurora kinase udtryk på sygdomsfrit interval (DFI) blev vurderet ved hjælp af Kaplan-Meier analyse kombineret med Mantel-Cox log-rank. På Kaplan-Meier-analyse blev Aurora kinase værdier inddelt i tre grupper baseret på øget, uændret eller nedsat kinase-ekspression. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af version 8.0 af Stata software (Stata Corporation 2003, College Station, TX). Resultaterne blev betragtet væsentligt anderledes, hvis p-værdier var lavere end 0,05.

Resultater

Angivelse af Aurora-kinaser i papillær kræft i skjoldbruskkirtlen (PTC) væv

Analyserne af Aurora-A og Aurora-B-mRNA-niveauer i PTC væv sammenlignet med deres normale matchede væv, afslørede, at Aurora-a-mRNA levelswere dereguleret i 55 (63,2%) ud af 87 PTC prøver, med en stigning i 30 og et fald i 25 (fig. 1A). Aurora-B-mRNA-niveauer blev ændret i 79 (90,8%) ud af 87 prøver, er opreguleret i 57 og nedreguleret i 22 (fig. 1B) af tilfældene. Som rapporteret i fig. 1C, mRNA niveauer af Aurora-A og Aurora-B blev positivt korreleret med hinanden (p = 0,001).

A og B) Variationer i ekspressionen af ​​Aurora-A og Aurora-B i papillær thyreoideacancer væv. De fold ændringer blev beregnet overvejer Aurora-A eller Aurora-B mRNA’er niveauet i normal matchede væv i skjoldbruskkirtlen lig med 1. statistisk vurdering af data blev udført usingthe ikke-parametrisk Mann-Whitney test. De små barer i grafen angiver medianværdier. C) Korrelation analyse af Aurora-A og Aurora-B mRNA’er i PTC væv. Dataene blev evalueret ved at anvende Rho Spearman testen.

BRAF

V600E mutation og Aurora kinase udtryk i PTC væv

For at vurdere effekten af ​​BRAF

V600E mutation på ekspressionen af ​​Aurora-A og Aurora-B vi først analyseret mRNA-niveauet af begge gener i BRAF

V600E PTC tumorer (n = 37), sammenlignet med dem, der huser vildtypeproteinet (n = 38) (fig. 2A). Resultaterne viste, at thepresence af BRAF

V600Emutation ikke påvirkede ekspressionsniveauerne for Aurora-A eller Aurora-B i PTC væv, sammenlignet med vildtype BRAF PTC væv. For at underbygge disse

in vivo

observationer, vi udførte

in vitro

eksperimenter på godt differentieret, ikke-transformerede rotte epitelial cellelinje PCCL3, kendetegnet ved en doxycyclin-afhængig BRAF

V600E ekspressionssystem [50]. I disse celler BRAF

V600E ekspression og efterfølgende induktion af MEK /ERK-phosphorylering pathway optrådte 12 timer efter tilsætning af doxycyclin, og den totale BRAF ekspression (endogent vildtype + induceret V600E mutant) ved 48 timer blev anslået til være 2 gange større end kontrollen. Som rapporteret i fig. 2B, behandling af PCCL3 med doxycyclin (1 ug /ml i 48 timer) påvirkede ikke Aurora kinase mRNA-niveauer.

A) Ekspression af Aurora-A og Aurora-B i papillære kræft i skjoldbruskkirtlen væv med vildtype (n = 38) eller muteret BRAF (n = 37). De fold ændringer blev beregnet overvejer Aurora-A eller Aurora-B mRNA niveau observeret i normalt matchede væv i skjoldbruskkirtlen lig med 1. Den statistiske evaluering af data blev udført ved at anvende den ikke-parametriske Mann Withney test. De små barer i grafen angiver medianværdier. B) Effekt af BRAF

V600E på Aurora kinaser mRNA i PCCL3 celler. Sidstnævnte blev tilskyndet til at udtrykke BRAF

V600E i en doxycyclin-afhængig måde. De fold ændringer i Aurora kinase mRNA blev normaliseret mod de ikke-behandlede celler.

Prognostisk relevans af Aurora kinase udtryk i PTC patienter

Variationer i ekspressionen af ​​Aurora-A ikke associere med nogen af ​​de klinisk-patologiske parametre analyserede (tabel 2), mens apositive korrelation (p 0,001) blev fundet mellem Aurora-B mRNA-niveauer og tumorstørrelse (tabel 2) .Den Kaplan-Meier analyse viste ingen sammenhæng mellem patienternes sygdomsfri interval og Aurora kinase op- eller nedregulering (fig. 3). Multivariate analyse viste, at forøget eller reduceret ekspression af Aurora-A eller Aurora-B, TNM stadie, alder eller BRAF

V600E mutation undladt at forudsige sygdom udfald (tabel 3). Kun kvinder viste en statistisk signifikant reduktion af hazard ratio (HR 0,286) for sygdom gentagelser (tabel 3).

Kaplan-Meier analyse kombineret med Mantel-Cox log-rank statistisk test udført på 75 PTC patienter var fulgt op fra 8 til 133 måneder. Vejviser

diskussion

i tidligere undersøgelser, vores og andre forskergrupper demonstreret en dereguleret udtryk for Aurora-kinaser i differentieret og anaplastisk thyroidea cancervæv [23]. Dette blev bekræftet i den foreliggende undersøgelse hvor Aurora-A og Aurora-B-genekspression blev fundet enten opreguleret eller nedreguleret (63,2% og 90,8%, henholdsvis) i størstedelen af ​​den papillære thyreoideacancer (PTC) analyserede væv, sammenlignet med deres normale matchede skjoldbruskkirtlen væv. Det er værd at nævne, at enten opregulering eller nedregulering af Aurora-kinaser kan vise sig proliferatively fordelagtigt at skjoldbruskkirtlen kræftceller. Faktisk forskellige rapporter viste, at mængden af ​​Aurora-A proteinin den centrosom er kritisk for dets replikation og mitose funktioner, og at enten en mangel på eller overskud af Aurora-AKAN fører til unormal mitose og til kromosom adskillelse og cytokinese defekter [ ,,,0],47].

det er for nylig blevet vist, at ekspressionen af ​​Aurora-B og Wee1-lignende protein kinase i melanomceller induceres ved tilstedeværelsen af ​​BRAF

V600E [40]. Da BRAF

V600E mutation ofte er stødt på i PTC, vi også søgt at fastslå, om mutationen i skjoldbruskkirtlen cancerceller var forbundet til forøget ekspression af Aurora-kinaser. I vores serie, blev BRAF status vurderet i 75 PTC væv og BRAF

V600E blev fundet i 37 (49,3%) af dem. Imidlertid levelswas ingen forskel i Aurora-A eller Aurora-B-ekspression fundet mellem vildtype og BRAF

V600E PTC væv. Disse observationer var bekræftes af

in vitro

eksperimenter på rotter skjoldbruskkirtel PCCL3 celler, der udtrykker BRAF

V600E i en doxycyclin afhængig måde [43]. Faktisk gav behandling af disse celler med doxycyclin ikke påvirke ekspressionsniveauet af enten Aurora-A eller Aurora-B.

I det sidste årti, en række rapporter indikeret, at overekspression af Aurora-A eller aurora-B betegner en negativ prognostisk faktor i adskillige humane maligniteter, herunder bryst-, mave-, prostata-, hoved og hals, blære, ovarie, kolon, adrenocorticale og lungecancere [25-32]. Færre undersøgelser har imidlertid associeret overekspression af Aurora-A eller Aurora-B med en gunstig prognose i colorektal, mave- og ovariecarcinomer [48-50]. Til dato, er blevet indberettet oplysninger om den mulige prognostiske rolle Aurora kinaser i differentieret kræft i skjoldbruskkirtlen. I denne sammenhæng er vi her evalueret den prognostiske relevans af Aurora-A og Aurora-B-mRNA-niveauer i en serie af 78 PTC, med en median opfølgning på 63 måneder. Univariate analyser dokumenteret den manglende sammenhæng mellem Aurora-A udtryk og klinisk-patologiske parametre, herunder alder, køn, tumorstørrelse, lymfeknude metastaser, histologi, TNM, BRAF status og gentagelser. Tilsvarende havde Aurora-B-ekspression korrelerede ikke med nogen af ​​disse parametre med undtagelse af tumorstørrelse, hvori mRNA-niveauer var signifikant højere i T (3-4) væv, med hensyn til t (1-2) væv. Kaplan-Meyer og multivariate analyser bekræftet, at dereguleret udtryk for Aurora-kinaser er ikke en prognostisk biomarkør for papillære patienter kræft i skjoldbruskkirtlen. I multivariat analyse viste kvindelige køn en signifikant beskyttende virkning (Hazard Ratio 0,286, p = 0,021). Sidstnævnte er i overensstemmelse med to nylige undersøgelser udført på store sag serien viser beskyttende rolle af den kvindelige køn på sygdomsspecifikke overlevelse [51, 52] .Det skal nævnes, at en grænse på den foreliggende undersøgelse er den relative lave antal patienter analyseret som giver en statistisk styrke (1-β) på 0,63.

konklusioner

som konklusion, selv om de data, der indberettes hereneed skal bekræftes ved hjælp af større case-studier, de viste, at ekspressionen af ​​Aurora-kinaser er dereguleret i størstedelen af ​​PTC væv, og bidrager sandsynligvis til PTC progression og cancerceller aneuploidi. Men anderledes end andre humane faste cancerformer, Aurora-A eller Aurora-B-ekspression på mRNA-niveauet ikke er en prognostisk biomarkør i tilfælde af PTC-patienter.