PLoS ONE: Nonlinear Optical mikroskopi for histologi af Fresh Normal og Kræft i bugspytkirtlen Tissues

Abstrakt

Baggrund

Kræft i bugspytkirtlen er en dødelig sygdom med en 5-års overlevelse på kun 1-5 %. Accelerationen af ​​intraoperativ histologisk undersøgelse ville være gavnligt for bedre forvaltning af kræft i bugspytkirtlen, hvilket tyder på en forbedret overlevelse. Ikke-lineære optiske metoder baseret på to-foton ophidset fluorescens (TPEF) og anden harmoniske generation (SHG) af iboende optiske biomarkører viser evnen til at visualisere morfologi af friske væv forbundet med histologi, hvilket er lovende for real-time intraoperativ evaluering af kræft i bugspytkirtlen .

Metode /vigtigste resultater

for at undersøge, om de ikke-lineære optiske billeddiagnostiske metoder har evnen til at karakterisere bugspytkirtlen histologi ved cellulær opløsning, vi studerede forskellige typer af pancreas væv ved hjælp af mærket-fri TPEF og SHG. Sammenlignet med andre rutinemæssige metoder til fremstilling af prøver, blev frisk væv uden behandling vist sig at være mest egnet til ikke-lineær optisk billeddannelse af pancreas væv. Den detaljerede morfologi af den normale rotte pancreas blev observeret og beslægtet med standard histologiske billeder. Relativt set, de indledende billeder af et lille antal kemiske-induceret bugspytkirtelkræft væv viste synlige neoplastiske forskelle i morfologi af celler og ekstracellulær matrix. De subkutane pancreatiske tumorxenografter blev yderligere observeret ved anvendelse af ikke-lineær optisk mikroskopi, hvilket viser, at de fleste celler er leukocytter på 5 dage efter implantation, tumorcellerne begynder at proliferere ved 10 dage efter implantation, og de ekstracellulære kollagenfibre bliver uorganiseret som xenotransplantater vokse.

konklusioner /Signifikans

i denne undersøgelse ikke-lineær optisk afbildning blev anvendt til at karakterisere de morfologiske detaljer af friske pancreas væv for første gang. Vi viser, at det er muligt at levere real-time histologisk vurdering af kræft i bugspytkirtlen ved lineære optiske metoder, der udgør en mulighed for karakterisering af udviklingen af ​​spontan bugspytkirtelkræft og yderligere anvendelse på en ikke-invasiv måde.

Henvisning: Hu W, Zhao G, Wang C, Zhang J, Fu L (2012) Ikke-lineær optisk mikroskopi for histologi af Fresh Normal og Kræft pancreas væv. PLoS ONE 7 (5): e37962. doi: 10,1371 /journal.pone.0037962

Redaktør: Irene Georgakoudi, Tufts University, USA

Modtaget: 24. februar, 2012; Accepteret: April 26, 2012; Udgivet: 24. maj 2012 |

Copyright: © 2012 Hu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Major Scientific Research Program Kina (nr 2011CB910401), National Natural Science Foundation of China (nr 61.178.077), Program for New Century Fremragende Talenter i University (nr NCET-08-0216), og for grundlæggende Forskning Midler til den centrale universiteter (HUST: 2011JC046). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i hele verden, med en samlet 5-års overlevelse på 1-5% [1]. Bedre behandling kan bidrage til en væsentlig forbedring i patientens overlevelse [2]. Intraoperativ høring, som hovedsagelig involverer undersøgelse af de kirurgiske udskårne eksemplar, er vigtig for kirurgen at fastlægge de mest hensigtsmæssige behandlingsmuligheder [3]. Det er imidlertid underlagt tidspres. En enkelt frossen sektion diagnose med stor nøjagtighed tager 20 minutter, og det er meget længere, når flere frosne snit skal udføre på et enkelt eksemplar [3]. Real-time histologi af friske eller levende væv uden sektionering eller yderligere behandling, ville ikke blot lette øjeblikkelig etablering eller bekræftelse af en diagnose og stadie intraoperativt som vil påvirke den kirurgiske procedure, men også gøre det muligt at vurdere alle de kirurgiske margener, således at tumor er fjernet fuldstændigt uden at kompromittere normal del af pancreas. Præcis vurdering kirurgisk margen giver mulighed for forbedring af langsigtede overlevelse, da positive kirurgiske margener forekommer blandt 37-50% af patienter, der gennemgår kirurgisk resektion og den samlede overlevelse for patienter svinger mellem 8 og 14 måneder [4]. Real-time detektion af morfologiske mønstre på løsningen af ​​en enkelt celle, som er en analog af histologi, indikerer en attraktiv udsigt til optimal intraoperativ håndtering af kræft i bugspytkirtlen med gunstige overlevelse.

Optiske metoder, der udnytter ikke-invasion og højt tempo-rumlig opløsning, kan opnå

in vivo

billedbehandling og sensing i biomedicinske forsøg. Raman spektroskopi, som er baseret på forskellen i energien af ​​den indfaldende og spredte fotoner på grund af de molekylære vibrationer, er følsom over for ændringer i den kemiske sammensætning i celler og væv. Det er blevet anvendt til differentiering mellem normale og cancerøse pankreatiske væv fra en musemodel [5]. Reflektans og fluorescensspektroskopi kan give biokemisk information af vævene til at skelne forskellige humane pancreas væv, herunder normale pancreasvæv, pancreatitis og pancreatisk adenocarcinom [6], [7]. Photon-væv interaktion modeller er blevet videreudviklet til at give kvantitative forbindelser mellem reflektans og fluorescens målinger og histologiske karakteristika for humane pancreas væv, såsom det nukleare størrelse [8], [9]. Men de spektrale parametre er vanskelige at være direkte matchet med de morfologiske træk afsløret af den konventionelle histologisk undersøgelse, især ændringerne i nuklear form og organisering af den ekstracellulære matrix. Mere detaljeret karakterisering af pancreas morfologi med cellulære opløsning ved hjælp af optiske metoder er nødvendige for at forbedre påvisningen af ​​pancreas neoplasi, implicerer et nyt middel til real-time histologi.

I de seneste år, ikke-lineær optisk mikroskopi (NOM), primært herunder TPEF og SHG, har vist sig som et effektivt redskab til at identificere mindre strukturelle og funktionelle ændringer i cellulær opløsning. NOM har den fordel submikron rumlig opløsning, millisekund tidsopløsning, og den optiske sektionering evne i grumsede væv [10], [11]. En vigtig arten af ​​disse et billeddannende modalitet er, at de endogene optiske biomarkører i væv kan anvendes til at tilvejebringe kontrast, som gør det muligt at detektere sygdomme hos mennesker uden behov for fiksering, sektionering eller farvning. Intrinsic to-foton exciteret fluorescens (TPEF) biomarkører herunder reduceret nikotinamidadenindinucleotid (phosphat) [NAD (P) H] og flavinadenindinukleotid (FAD) er blevet anvendt til at afsløre morfologi af cellerne, idet NAD (P) H og FAD er de store fluoroforer i cytoplasmaet [12], [13]. I mellemtiden kollagenfibrene, som er vigtige strukturelle proteiner i den ekstracellulære matrix (ECM), kan implementere den iboende anden harmoniske generation (SHG) proces i biologisk væv for at afspejle ECM mønster [12], [13]. Desuden er den intracellulære NAD (P) H og FAD også forbundet med redox-forhold på celler, der kan anvendes som en indikator for det metaboliske niveau af celler [14], [15]. NOM har været almindeligt anvendt til at visualisere cellulære og vævsstrukturer i forskellige kræft væv, herunder æggestokkene, blære, gastrisk væv, og så videre [14], [16] – [20].

Vi først, til vores viden kendetegnet morfologiske detaljer i pancreas væv ved hjælp af etiketten uden TPEF og SHG teknikker. I et forsøg på at vurdere mulighederne for NOM for den detaljerede morfologiske karakterisering af pancreas væv, vi anvendte label-fri TPEF og SHG teknikker til normal rotte bugspytkirtel og relateret til traditionelle histologiske farvning billeder. Forskellige rutinemæssige midler til forberedelse af prøverne er blevet sammenlignet for at erhverve optimale lineære optiske billeddannelse af pancreas væv. De kemiske-induceret pancreas cancer væv blev yderligere karakteriseret og sammenlignet med normale pancreas prøver at validere evne NOM at afsløre de neoplastiske forandringer. For at vurdere potentialet af etiketten uden TPEF og SHG teknikker til at karakterisere forskellige stadier under væksten af ​​kræft i bugspytkirtlen, de subkutane pancreatiske tumorxenotransplantater høstet på forskellige tidspunkter efter implantation kvantitativt analyseret på grundlag af deres morfologiske karakteristika.

Materialer og metoder

Dyremodeller

En kemisk induceret bugspytkirtelkræft model, der spontant udvikler ondartet kræft i bugspytkirtlen blev anvendt til sammenligning af neoplastiske væv til normale væv. Forsøgene blev godkendt af Etik udvalg Tongji Medical College, Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi. Animal Care blev ydet i overensstemmelse med de procedurer, der er beskrevet i “Vejledning til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr” udgivet af de amerikanske National Institutes of Health. De mandlige Sprague-Dawley rotter (100-125 g) blev opnået fra Experimental Animal Center of Tongji Medical College (Wuhan, Kina). Tumorerne blev induceret ifølge en tidligere etableret protokol [21]. Kort fortalt blev anæstesi induceret med fordampet ether, efterfulgt 10 min senere af en intramuskulær injektion af pentobarbital (20 mg /kg) og ketamin (50 mg /kg). Rotterne undergik en midtlinie laparotomi med eksponering af pancreas hoved segment. Parenchym blev indridset parallelt med forløbet af den fælles galdegang, og en lomme blev udviklet i pancreas parenkym på incisionsstedet. 5 mg DMBA krystaller blev implanteret og fastgjort på plads ved hjælp af en 6-0 prolene pung-streng sutur. Tumorerne blev høstet og afbildet ved 9 måneder efter induktion. Frisk udskåret væv fra i alt 12 (10 normal og 2 kemisk-induceret kræft) rotter blev afbildet og sammenlignet.

athymiske (nu /nu) mus på en BALB /c baggrund, anskaffet fra Shanghai Laboratory Animal Center- (Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd.), blev anvendt til etablering af subkutan pancreas tumor model. Forsøgene fulgt de procedurer, der er godkendt af Institutional Animal etiske komité for Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi. Seks til otte uger gamle hanmus blevet rejst under specifikke patogenfrie (SPF) betingelser, med temperaturen holdes på ca. 21 ° C og luftfugtighed på 60-70% med kunstigt lys i 12 timer. De tumorxenografter blev udviklet fra den etablerede PANC-1 cellelinje (ATCC, Rockville, MD) [22]. Ca. 6 × 10

6 PANC-1-celler blev inokuleret subkutant til venstre tomt og subkutane tumorxenotransplantater blev høstet efter 5, 10, 20, 30 dage efter implantering, hhv. I alt 20 mus med tumorxenoplantater (5 mus for hver etape) blev anvendt til billedbehandling og kvantitativ analyse.

Forberedelse af pancreas prøver

Dyrene blev aflivet med en overdosis af isofluran, og derefter pancreas væv blev dissekeret ud og afbildes. Før billeddannelse blev de frisk udtaget væv, herunder de normale rotte pancreas, den kemisk-induceret pancreas cancer væv og det subkutane tumorxenoplantater, inkuberet i phosphatpufret saltvand (PBS). Halvdelen af ​​hver prøve blev derefter straks afbildet og indsamlingen af ​​alle de billeder var færdig inden for 1 time efter dissektion. Den anden halvdel af hver prøve blev anvendt til histologisk analyse.

For at undersøge de optimale betingelser for den ikke-lineære optiske billeddannelse af pancreas væv blev de ikke-lineære optiske billeder af kolde lagret, faste og kryokonserveret rotte pancreas væv sammenlignet med specifikationerne for de friske væv henholdsvis eftersom strukturen af ​​vævene kan opretholdes ved fiksering og det er blevet rapporteret, at de iboende fluorescerende komponenter (NAD (P) H og FAD) kan detekteres med en høj grad af nøjagtighed under -80 ° C [23]. De kolde lagrede pancreas væv blev opbevaret i 4 ° C i 4 timer, 12 timer og 24 timer efter udskæring, henholdsvis. De fikserede væv blev behandlet med 4% paraformaldehyd i PBS i 19 timer. De kryopræserverede væv blev nedfrosset til -196 ° C i flydende nitrogen i mindst 30 minutter. Alle væv blev overført til PBS efter forarbejdning og derefter afbildes ved stuetemperatur.

Nonlinear optisk afbildning

Nonlinear optisk afbildning blev udført ved anvendelse af en modificeret system baseret på et kommercielt mikroskop (FluoView 1000, Olympus , Japan) udstyret med en Ti: Sapphire laser (Mai Tai, Spectra-Physics) med en gentagelse på 80 MHz (figur 1).. Den 750-nm laserens output system blev anvendt til excitation medmindre andet er angivet. Den gennemsnitlige lasereffekt på overfladen af ​​prøven var ca. 15 mW. Scanningen sats er 10 mikrosekunder /pixel. De udsendte signaler opkræves af fokusering mål (60 × /1,2 NA vand-nedsænkning, Olympus). To band-pass filtre (FF01-380 /14-25 og FF01-445 /45-25, Semrock) blev ansat før fotomultiplikatorrør at opdage SHG og TPEF signaler hhv. Den SHG-signalet blev bekræftet af ejendom bølgelængden afhængighed, da der ikke var påvist i 380/14 nm ved bølgelængder længere end 780 nm signal. Den gengivelse af ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, Maryland) 3D volumen blev brugt til billedet præsentation.

Kvantitativ analyse af nuklear størrelse og kollagen

For hver fase af den subkutane pancreas tumorxenografter, 80 celler i den ikke-lineære optiske billeder blev visuelt udvalgt og diametrene af kernen blev manuelt målt til at estimere nukleare størrelser. De gennemsnitlige nukleare størrelser for de subkutane pancreatiske tumorxenotransplantater høstet på forskellige stadier blev beregnet henholdsvis.

I collagen analyse, indholdet af collagenfibre for hver prøve blev vurderet ved forholdet mellem antallet af pixels, der kollagenfibre udgør det samlede antal pixels i billedet. 40 aksiale træk billeder fra overfladen blev beregnet til at få det gennemsnitlige indhold værdi for alle prøver. Den grå niveau samtidig forekomst matrix (GLCM) metoden, som er en tekstur analysemetode baseret på estimeringen af ​​det fælles betingede tæthedsfunktion anden ordens [24], [25], blev brugt til at karakterisere morfologi kollagen fibre.

Statistisk signifikans blev beregnet med ANOVA lineær kontrast hjælp SPSS software (SPSS). Alle p-værdier på 0,05 eller mindre blev betragtet som væsentlig omtales som sådan i teksten.

Histologisk Analyse

De pancreas væv blev fikseret med 10% neutral bufferet formalin, og paraffinindstøbte snit med en tykkelse på 5 um blev rutinemæssigt fremstillet. Vævssnittene blev efterfølgende farvet med hematoxylin-eosin og Massons trichrom hhv. Det hematoxylin-eosin farvning blev anvendt til vurdering af cellulær morfologi, og Massons trichrom pletten blev anvendt til påvisning af collagenfibre i pancreas væv. Histologiske billeder blev erhvervet ved hjælp af et optisk mikroskop (IX81, Olympus, Japan) udstyret med en 20 × luft objektiv og en farve digital industrielle kamera (DFK 41BU02, The Imaging Source Europe GmbH, Tyskland).

Resultater og diskussion

Visualisering af morfologiske oplysninger om de normale rotte bugspytkirtlen

pancreas er en vigtig kirtel med både exokrine og endokrine funktioner (fig. 2A) med et tyndt fibrøst bindevæv kapsel, enwraps pancreas parenkym. Den exokrine del af pancreas består af drue-lignende klynger af acinære celler navngivne acini, der syntetiserer og udskiller fordøjelsesenzymer ind i duodenum via duktale systemer. De acinære celler viser en pyramideformet form med apikal cytoplasma indeholdende zymogen granuler og en fremtrædende kerne placeret tæt på den basolaterale cellemembran. Det endokrine del af bugspytkirtlen udgør ca. 1-2% af den totale pancreas- masse og består af spredte pancreas-øer, der indeholder klynger af forskellige slags hormonproducerende celler.

(A) Den anatomiske organisation af den normale rotte pancreas består af eksokrine acini og endokrine pancreas-øer. RBC: røde blodlegemer. (B) Den ulineære optiske billede af den normale rotte pancreas ved et billeddannende dybde på 6 um. Den røde farve-kodet struktur er kollagen, og den grønne farve for fluorescerende komponent. Scale bar er 30 um. (C) Den ulineære optiske billede af den normale rotte pancreas ved et billeddannende dybde på 23 um. Stjernerne, pilespidser og pile viser kernerne, acinære celler, kollagen fibre, hhv. (D) Den ulineære optiske billede af den normale rotte pancreas ved et billeddannende dybde på 27 um. Den stiplede cirkel angiver det mønster af pancreas acini. (E) Det pancreas acini kan observeres i hematoxylin og eosin billede. (F) Den Masson trichrom billedshow lille mængde kollagen fibre er fordelt rundt om acini af normale rotte pancreas prøver.

Den ulineære optiske billede på en billedbehandling dybde på 6 um viser det fibrøse bindevæv kapsel i overfladen af ​​bugspytkirtlen (fig. 2B), som angivet ved SHG signal. I pancreas parenkym, de ikke-fluorescerende cellekerner viser sig som mørke og runde regioner lokaliseret tæt på den basolaterale cellemembran (asterisker i fig. 2C) og den individuelle acinære (pilespidser i fig. 2C) celler klart kan identificeres i overfladiske lag af den acini (billeddannelse dybde på 23 um). Desuden kan en lille mængde af kollagenfibre (pile i fig. 2C) fordelt i den ekstracellulære matrix omkring acini, hvilket er i overensstemmelse med Masson Trichrome-farvede billeder (fig. 2F). Figur 2D viser, at acinære celler er anbragt i et mønster (stiplet cirkel) ligner den strukturelle samlingen af ​​exokrine acini (fig. 2A) ved det dybe lag (billeddannelse dybde på 27 um). Drue-lignende klynger af de acinære celler kan også observeres i de tilsvarende hæmatoxylin-eosin-farvede mikroskopiske billeder (fig. 2e). Men sammenlignet med de ikke-lineære optiske mikroskopiske billeder, de histologiske billeder er svære at visualisere den fibrøse kapsel og 3-D-konformation af acinære celler. Et supplerende film er også at vise en dybde-løst stak i bugspytkirtlen (Video S1). Dertil kommer at 3-D arrangement af acinære celler yderligere valideret ved farvning af kerner med en fluorescerende farve (figur S1). Vores resultater viser, at den ikke-lineære mikroskopi har den fordel, 3-D visualisering af bugspytkirtlen uden væv udskæring eller co-registrering i løbet af de histologiske metoder.

Den normale pancreas-ø er rapporteret til at blive gennemtrængt af et tæt net af kapillærer og omgivet af en tynd collagen kapsel og glial ark, der adskiller de endokrine celler fra exokrin komponenten [26]. Men der var ikke nogen mønster, der svarer til holme til stede i de ikke-lineære optiske billeder, muligvis på grund af den sparsomme befolkning af holme. Større område billeddannelse med specifikke farvestoffer kan lette yderligere identifikation af strukturen af ​​de Langerhanske øer.

Resultaterne beviser, at den iboende TPEF fluorescens af pancreasceller og SHG signal af collagenfibrene i den ekstracellulære matrix kan visualisere morfologien af ​​pankreatiske celler og ekstracellulære komponenter ved hjælp af ikke-lineær optisk mikroskopi.

Oprindelse af iboende kontrast

det er veldokumenteret i litteraturen, at de væsentligste kilder til TPEF signal i cytoplasmaet er NAD (P) H og FAD med emission spektre at toppe på 460 nm og 530 nm [13], [14], [27]. Vi har registreret den autofluorescens i området 500-550 nm ved excitationsbølgelængden 750 nm og fandt, at intensiteten er meget lavere end i området fra 425 til 470 nm (data ikke vist). Da de iboende fluoroforer viser stærk emission i 425-470 nm kanal, når exciteres ved 750 nm, vi spekulere, at den iboende fluorescens pancreas væv hovedsageligt kommer fra NAD (P) H, og FAD har et mindre bidrag til den iboende emission.

fibrillær collagen er blevet rapporteret at vise en ikke-centrosymmetriske struktur, hvilket gør det et primært bidrag til SHG signal i de biologiske væv [13], [28]. Ifølge morfologi og fordeling af fibrene afsløret ved SHG billeder forventes oprindelsen af ​​SHG-signalet fra bugspytkirtlen til at være collagenfibrene i den ekstracellulære matrix.

Optimale betingelser for iboende billeddannelse af pancreas væv

det er blevet rapporteret, at koncentrationen af ​​NAD (P) H og FAD er forbundet med redox-forhold, som er følsom over for ændringer i den cellulære stofskifte og vaskulær iltforsyning [29]. Derfor har vi afbildet 4 ° C lagrede, fikseret, og cyropreserved pancreas væv til at undersøge de optimale betingelser for den ikke-lineære optiske billeddannelse af pancreas væv. Sammenlignet med de friske væv (fig. 3A), de ulineære optiske billeder af pancreas væv opbevaret i 4 ° C i 4 timer viser morfologien af ​​pancreas acini med lavere kontrast (fig. 3B). Kun et par pancreasceller kan observeres med nedsat styrke af fluorescens i pancreasvæv opbevaret i 4 ° C i 12 timer (fig. 3C)), mens den iboende fluorescens bliver ubetydelig, og cellerne kan næppe identificeret for lagret i 4 ° C i 24 timer (fig. 3D). Reduktionen af ​​intensiteten af ​​den iboende fluorescens og tabet af de pancreasceller kan skyldes faldet i levedygtighed pancreas væv under berøvelse af ilt og ernæring efter resektion. Især kan fremgangsmåden ifølge autofordøjelse induceret af skaden i bugspytkirtlen sandsynligvis fremskynde beskadigelse af pancreas væv.

iboende fluorescens (A) de friske væv, væv, der er lagret i 4 ° C i (B) blev påvist i 4 timer, (C) 12 timer, og (D) 24 timer, (E) faste væv samt (F) frosne væv. Scale bar er 30 um.

Figur 3E viser, at organiseringen af ​​den intakte pancreas acini blev bevaret efter fiksering. Men intensiteten af ​​fluorescensen faldt betydeligt, muligvis på grund af proteindenaturering under processen med fiksering og ændringerne i quencher koncentrationer [29]. Til sammenligning viste kryopræserverede pancreas væv endnu lavere fluorescens i figur 3F, da det cellulære NAD (P) H kan forsvinde på grund af død af cellerne efter fryse og optøning til stuetemperatur under billedbehandling.

ovenstående resultater viser, at morfologien af ​​de pankreatiske væv kan mest præcist afgrænset af billeddannelse friske væv uden yderligere forarbejdning. Derfor blev de friske pancreas væv inkuberet i PBS anvendes til efterfølgende analyse. Vi har også undersøgt den optimale excitationsbølgelængde for den ikke-lineære optiske billeddannelse af pancreas væv, eftersom den iboende fluorescens er relativt svag. Excitationsbølgelængden er tunet i 730-840 nm området til at udføre pancreasvæv billeddannelse. Det blev konstateret, at 750 nm var den optimale bølgelængde for det mikroskopiske afbildningssystem vi bruges. Lasereffekten på overfladen af ​​prøverne blev testet for at opnå billeder med høj signal-støjforhold. I tilfælde af en gennemsnitlig effekt på omkring 15 mW, var der ingen synlige solskader eller fotoblegning efter overtagelsen af ​​en række på hinanden følgende aksiale skiver.

Sammenligning af normal og kræft i bugspytkirtlen væv

kemisk-induceret bugspytkirtelkræft væv blev afbildet og associeret med de histologiske billeder (fig. 4). Sammenlignet med den normale pancreas, kan observeres større nuklear størrelse og mærket variation i nuklear størrelse og form i den kemisk-induceret pancreas cancer væv, hvilket er sammenfaldende med de typiske karakteristika for cancerceller. Desuden er densiteten af ​​collagenfibrene steg, som ligner den intensive stromal fibrose manifesteret i pancreas kræftpatienter [30]. De åbenlyse forskelle i den morfologiske udseende mellem den normale og den kemisk-induceret pancreas cancer væv indikerer, at ikke-lineære optiske metoder viser evnen til at detektere neoplastiske læsioner i abnorme pancreas væv.

(A) De bugspytkirtelkræftceller med forskellige størrelse og form samt lineære collagenfibre kan identificeres i den ikke-lineære optiske billede. Den røde farve-kodet struktur er kollagen og den grønne farve for fluorescerende komponent. Scale bar er 30 um. (B) Den hematoxylin og eosin billede og (C) Masson trichrom billede viser morfologi kræft i bugspytkirtlen væv i korrespondance med (A).

Vækst af de subkutane pancreas tumorxenoplantater

subkutane pancreatiske tumorxenotransplantater høstet 5 dage efter inokulering består hovedsageligt af bølgede kollagenfibre og små celler, som kan være leucocyter (fig. 5A). Til sammenligning cellerne i tumorxenotransplantater høstet ved 10 dage efter inokulering viser forstørrede kerner, hvilket indikerer, at cancercellerne begynder at proliferere (fig. 5B). Desuden collagenfibrene er lineære og arrangeret strålevarme fra cancercellerne, hvilket kan bidrage til tumor pervasion langs fibrene. Mængderne af tumorceller steg i tumorvæv høstet 20 dage efter inokulering (fig. 5C), hvorimod den faldt i de høstet 30 dage efter inokulering (fig. 5D), hvilket indebærer, at der er nekrose i centrum af tumoren . Som xenotransplantater udvikler, collagenfibrene få mere fragmenteret og uregelmæssig, og densiteten af ​​fibrene faldet, hvilket kan være forbundet med den nedbrydende og remodellering af den ekstracellulære matrix under væksten af ​​tumorxenotransplantater.

pancreas tumorxenotransplantater høstet på forskellige stadier, herunder (A) 5 dage, (B) 10 dage, (C) 20 dage, og (D) 30 dage efter implantation, blev afbildet og relateret til konventionel histologi. SHG billeder (rød farvekodet), de TPEF billeder (grøn farve-kodet), og 3-D overlejret SHG /TPEF billeder er vist i de første tre kolonner henholdsvis medens hematoxylin og eosin billeder og Masson trichrom billeder vises i de to sidste kolonner. Alle 3-D billeder er 211 um × 211 um x 50 um. Scale bar er 30 um.

histologiske billeder viser, at omfattende nekrose er til stede i tumorxenotransplantater høstet ved 5 dage efter inokulering, og de fleste af cellerne er neutrofiler, som indeholder tre eller fire nukleare lapper (fig. 5A). Ved 10 dage efter implantation, de fleste af cellerne er tumorceller, og rigelige lange lineære kollagenfibre er til stede (fig. 5B). 20 dage efter implantation, kan høj densitet af tumorceller ses og relativt lavere indhold af kollagenfibre forekommer (fig. 5C). Endelig 30 dage efter implantation, spredt nekrose kan observeres i den centrale af tumoren (fig. 5D). Vi fandt, at resultaterne af etiket-fri TPEF og SHG billeddannelse er i overensstemmelse med de traditionelle histologiske farvningsmetoder.

Kvantitativ analyse af den nukleare størrelse viser, at diameteren af ​​cellekernerne høstet 10 dage efter inokulering falder mellem der høstet efter 5 dage (ca. 6 um), og dem, høstet efter 20 dage (hovedsagelig lå på mellem 10 um og 13 um). Dette indikerer, at proporation af tumorceller til neutrofiler forøges, når xenotransplantater vokse (Fig 6, s. 0,001, ANOVA lineær kontrast mellem størrelsen på 5 dage, og dem efter 20 dage, n = 5 for hver gruppe). Den viser, at der kan opnås den nukleare størrelse af cellerne under anvendelse af ulineær optisk billeddannelse, hvilket er vigtigt til påvisning af tumorceller. Densiteten af ​​collagenfibrene er også blevet beregnet for tumorxenografter høstet på forskellige stadier hhv. Det kan ses, at mængden af ​​collagenfibrene faldt gradvist tumoren vokser og massefylden ved 5 dage afveg væsentligt fra de efter 20 dage (Fig. 7A). Til kvantificering af de strukturelle ændringer af kollagen fibre, blev GLCM metode der anvendes til tekstur analyse. Korrelation er en stoflig funktion ekstraheret fra GLCM og kan anvendes til at estimere retning af tekstur. Som figur 7B viser korrelationen kurver tumorvæv høstet efter 10 dage er lavere end dem høstet 5 dage, hvilket svarer til mere uordnede kollagenfibre. Den Corr

50, beregnet af pixel afstand, hvor korrelationen faldet til 50% af den oprindelige værdi, er væsentligt større i de xenotransplantater høstet ved 5 dage sammenlignet med de høstet ved 10 dage, 20 dage og 30 dage (Fig . 7B; p = 0,035, ANOVA lineær kontrast, n = 5 for hver gruppe). De ovennævnte kvantitative resultater er i overensstemmelse med det visuelle udseende af de ulineære optiske billeder.

nukleare størrelse på 5 dage er signifikant lavere end dem på 20 dage og 30 dage. *, P 0,001, ANOVA lineær kontrast. Prøven størrelse er 5 for hver gruppe (5 mus). +, Outliers på box-og-knurhår diagram;

barer

, total udstrækning af data.

(A) kollagen tæthed aftager som tumorxenoplantater vokse. Densiteten af ​​tumorerne på 5 dage er betydeligt højere i forhold til dem på 20 dage (*, p = 0,033, ANOVA lineær kontrast) og 30 dage (**, p = 0,005, ANOVA lineær kontrast). +, Outliers på box-og-knurhår diagram;

barer

, total udstrækning af data. (B) Organiseringen af ​​kollagen fibre ændringer under væksten af ​​de subkutane pancreas tumorxenoplantater. En overordnet sammenligning af korrelationsværdierne viser den største forskel mellem de tumorxenotransplantater høstet ved 5 dage, og dem, der er høstet efter 10 dage, som angivet ved Corr

50 værdi, den afstand, hvor korrelationen krydsede 50% af den oprindelige sammenhæng. *, P = 0,035, ANOVA lineær kontrast. Prøven størrelse er 5 for hver gruppe (5 mus). Fejlsøjler er en standardafvigelse over og under hvert datapunkt.

neutrofiler og nekrose observeret i de subkutane tumorxenotransplantater høstet på 5 dage skyldes muligvis den inflammatoriske reaktion under tumor-host-reaktion, da det er blevet rapporteret, at den tilbageværende immunsystem hos værten kan deltage i tumorregression i de tidlige stadier efter podning af tumorxenografter [31].