PLoS ONE: Androgen receptor Varianter forekommer hyppigt i kastrationsresistent prostatacancer Metastases

Abstrakt

Baggrund

Selvom androgener er opbrugt i kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), metastaser udtrykker stadig nukleare androgen receptor (AR) og androgen regulerede gener. Vi har for nylig rapporteret, at C-terminalt afkortet konstitutivt aktive AR splejsningsvarianter bidrager til CRPC udvikling. Da specifikke antistoffer afsløre alle C-terminale trunkerede AR-varianter er ikke tilgængelige, vores mål var at udvikle en metode til at vurdere forekomsten og funktion af AR varianter i prostatakræft (PCA).

Metode /vigtigste resultater

Brug 2 antistoffer mod forskellige regioner af AR protein (N- eller C-terminalen), held viste vi eksistensen af ​​AR variant i LuCaP 86.2 xenograft. For at evaluere forekomsten af ​​AR varianter i humant PCa væv, vi brugt denne metode på væv mikroarrays herunder 50 primære PCa og 162 metastatiske CRPC væv. RT-PCR blev anvendt til at bekræfte AR varianter. Vi observerede et signifikant fald i nuklear C-terminale AR farvning i CRPC men ingen forskel mellem N- og C-terminale AR nuklear farvning i primær PSA. Ekspressionen af ​​AR regulerede proteiner PSA og PSMA blev marginalt påvirket af faldet i C-terminale farvning i CRPC prøver. Disse data antyder, at der er en stigning i forekomsten af ​​AR varianter i CRPC grundlag af vores evne til at differentiere nukleare AR-ekspression under anvendelse af N- og C-terminale AR antistoffer. Disse resultater blev valideret ved hjælp af RT-PCR. Vigtigt er det, at tabet af C-terminale immunoreaktivitet og identifikation af AR varianter var forskellige afhængigt af det sted, metastaser i den samme patient.

Konklusioner

Vi succes udviklet en ny immunhistokemisk tilgang, som var anvendes til at fastslå forekomsten af ​​AR varianter i et stort antal primære PCa og metastatisk CRPC. Vores resultater viste et øjebliksbillede af den samlede høje frekvens af C-terminale trunkerede AR splice varianter og stedsspecifikke AR tab i CRPC, hvilket kunne have nytte stratificere patienter for AR målrettede lægemidler

Henvisning:. Zhang X, Morrissey C Sun S, Ketchandji M, Nelson PS, True LD, et al. (2011) Androgen receptor Varianter forekommer hyppigt i kastrationsresistent prostatacancer Metastaser. PLoS ONE 6 (11): e27970. doi: 10,1371 /journal.pone.0027970

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: Juni 17, 2011; Accepteret: 29 oktober 2011; Udgivet: November 17, 2011

Copyright: © 2011 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning er baseret på arbejde delvist understøttet af en PA1 National Institutes of Health tilskud (PO1CA085859), Pacific Northwest prostatakræft SPORE tilskud (P50CA097186), den prostatakræft Foundation og Richard M. Lucas Foundation. CM modtog en karriereudvikling pris fra Pacific Northwest prostatakræft SPORE tilskud (P50CA097186). Denne forskning er resultatet af arbejdet støttet af midler fra VA Puget Sound Health Care System, Seattle, Washington. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

metastatisk prostatacancer (PSA), der går igen efter kastration eller androgen deprivation terapi (ADT), betegnet kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), varsler et dårligt resultat med høj dødelighed. Selvom cirkulerende niveauer af androgener er depleteret i CRPC, tumorprogression er ofte samtidig med forhøjede niveauer af androgen receptor (AR), aktivering af AR, og ekspressionen af ​​AR-regulerede gener. Men en stigning i AR-ekspression i sig selv er i almindelighed ikke tilstrækkelig til at gå i indgreb med AR transkriptionelle program [1]. Forskellige mekanismer har vist sig at føre til AR transaktivering og engagere AR programmet efter kastration. Disse omfatter vedvarende intratumorale androgener, ektopisk androgen syntese af tumoren enten fra adrenale androgener eller intratumoral

de novo

syntese og øget androgen transport ind i tumoren ved opløst stof carrier organisk anion transportproteiner [2] – [6] . Adskillige cytokiner og vækstfaktor-pathways er blevet vist at være i stand til at aktivere AR gennem direkte binding eller cross-talk mekanismer [7] – [13]. Ændringer i AR co-regulatorer kan også modulere AR aktivitet, når androgen niveauer reduceres [14] – [18]. Funktionelt, idet hver af disse mekanismer fremmer AR aktivering i CRPC kræver carboxyterminalen region af det modne protein, som indeholder det ligandbindende domæne (LBD).

Ud over mekanismer, der fører til AR-aktivering i CRPC der kræver ligand, seneste beviser peger på eksistensen af ​​alternativt splejsede former for AR mRNA, der koder for receptorer blottet for LBD, men bevarer evnen til at engagere transkriptionel maskiner og fremme reguleringen af ​​kendte — og potentielt nye — sæt transkriptionelle mål [19] – [26]. Ikke blot er disse C-terminale trunkerede AR varianter konstitutivt aktive, men deres struktur forudsiger en generel resistens over for terapeutika såsom AR-antagonister, der kræver binding til LBD’et for aktivitet. Til dato har vi og andre identificeret tre AR splejsningsvarianter i humane vævsprøver [22], [25] – [27]. AR-V1 koder for en splejsningsvariant bestående af exoner 1-3 og slutter i en kryptisk exon (CE1), AR-V7 (også kaldet AR3) koder for et protein med exon 1-3 og en terminal kryptisk exon (CE3), og AR

v567es koder for et protein bestående af exoner 1-4, og på grund af en læserammeforskydning grund af tab af exoner 5-7, exon 8 har en stopkodon genereret efter de første 10 aminosyrer, hvilket resulterer i en forkortet exon8. [22], [25] – [27]. Yderligere AR splejsningsvarianter er blevet påvist i humane PCA cellelinjer [21], [24], [26] – [28]

Flere undersøgelser evaluerer udtryk for AR splejsning former i et lille antal prostatakræft. antyder, at AR varianter er lettere at bestemme i CRPC sammenlignet med hormon-naive cancere, og der kan opstå på grund af den selektive tryk af AR målrettet terapi [22], [25], [26]. En nylig undersøgelse brugte QRT-PCR til at identificere AR variant udskrifter i 40 knoglemetastaser, hvoraf 30 var fra CRPC, og fundet en sammenhæng mellem ekspression af AR varianter og overlevelse [29]. Bestemmelse af forekomsten af ​​AR varianter i forskellige kliniske tilstande af prostatakræft er blevet udfordret af krav til velbevarede frosne vævsprøver til udskrift-baserede analyser, og manglen på antistoffer i stand til specifikt at detektere de fleste AR variant proteiner. For at overvinde denne begrænsning, søgte vi at drage fordel af det faktum, at nye AR carboxy-termini kodet af alternativt splejsede former af AR mRNA ikke kan genkendes af antistoffer rettet mod normalt C-terminalen af ​​fuld-længde AR (AR

FL). Vi antager, at denne funktion af AR-varianter har lejlighed til at identificere AR proteinvarianter i formalin-fikserede væv ved at sammenligne forskellen farvning af antistoffer, der genkender enten N- eller C-terminalen af ​​AR. Derfor, i den foreliggende undersøgelse anvendte vi antistoffer mod den N- eller C-terminalen af ​​AR-proteinet at forespørge et stort antal af godartet prostata væv, primære hormon naive PCa og en række metastatisk CRPC at fastslå forekomsten af ​​C-terminal trunkerede AR varianter.

Materialer og metoder

Reagenser

de anvendt i denne undersøgelse antistoffer og arbejdsforholdene er anført i tabel 1.

Tissue

Menneskelig primær og metastatisk PCA væv blev opnået som led i PSA forskningsprogram og University of Washington Medical center prostatakræft Donor Rapid Autopsy program, som er godkendt af University of Washington Board Institutional Review. Den Institutional Review Board fra University of Washington Medical Center godkendt alle procedurer, der involverer mennesker, og alle emner underskrevet skriftligt informeret samtykke. Humane væv microarrays (TMAS) består af 42 patienter fra prostatakræft Donor Rapid Autopsy Program (herunder 65 blødt væv metastaser og 120 knoglemetastaser) [30], 55 radikal prostatektomi patienter (inklusive 28 normal prostata, 24 hyperplastisk prostata, og 50 primære prostata cancervæv) blev anvendt. Den LuCaP 86.2 prostatakræft xenograft er en adenocarcinom, der ikke reagerer på kastrering og blev afledt af et humant PCa blære metastase. Den LuCaP 35 prostatacancer xenograft er en adenocarcinom, der reagerer på kastrering og var afledt af et PCA lymfeknudemetastase. Disse xenotransplantater ikke vokser som cellelinier, således de vedligeholdes ved seriel passage i SCID-mus. Den LuCaP 86.2 xenograft udtrykker en kendt C-terminal afkortet AR variant AR

v567es der er konstitutivt aktiv. Den LuCaP 35 xenograft kun udtrykker bred typen AR [25]. Frisk LuCaP 35 og 86,2 xenograft væv blev anvendt til Western-analyse. Tyve to CRPC metastatiske væv fra hurtige obduktion patienter svarende til vævene på menneskets TMA havde været lynfrosset i flydende nitrogen efter resektion og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Kliniske data vedrørende de 42 obduktion patienter er vist i tabel 2.

Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)

Samlet væv RNA blev isoleret fra hakket frisk væv under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. To mikrogram totalt RNA blev fordøjet med DNase I, og revers transkriberet under anvendelse af Superscript First-Strand Synthesis System (Invitrogen). PCR blev udført under anvendelse AmpliTaq Gold® PCR Master Mix (Applied Biosystems). PCR-produkter blev kørt på 2% agarosegel og image billeder blev taget ved anvendelse AlphaDigiDoc Pro imaging system fra Alpha Innotech (San Leandro, CA). QRT-PCR-reaktioner blev udført ved hjælp af en Applied Biosystems 7900 sekvens detektor med 5 ng cDNA, 200 nM af hver primer par og Power SYBR Green PCR Master Mix eller TaqMan Universal PCR Master Mix fra Applied Biosystems.

Genekspression niveauer blev målt ved relativ kvantificering mellem RNA-prøver, og fold ekspressions ændringer blev bestemt ved 2-ΔΔCT metoden [31]. Alle QRT-PCR-forsøg blev udført tredobbelt, og husholdning genet RPL13A blev anvendt som en endogen kontrol.

Primersekvenserne er anført i tabel 3.

Celledyrkning og stimulering

VCAP celler, der udtrykte både AR

FL og AR

v567es variant blev dyrket til 80% konfluens i 30 mm plader i RPMI 1640 medium med 5% serum, og derefter om RPMI-1640 medium med 5% trækul strippet serum i 24 timer. Dihydrotestosteron (DHT) 10

-9 M, MDV-3100 50 nM, eller MDV-3100 plus DHT blev tilsat til kulturerne. Efter 24 timer blev total RNA indsamlet fra dobbelte brønde for QRT-PCR til påvisning af AR

FL, AR

v567es og AR-V7 udskrifter. Forsøget blev gentaget 6 gange med tre eksemplarer hver gang, og de QRT-PCR-resultater blev normaliseret til DHT behandlingsgruppe.

Western Blotting

Friske væv blev homogeniseret og lyseret med kold lysepuffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100) indeholdende Halt ™ phosphataseinhibitor Cocktail og proteasehæmmere (Thermoscientific). Komplette lysater blev separeret på SDS-PAGE, overført til en nitrocellulosemembran, blokeret i 5% mælk-PBS-Tween og probet med respektive natten over ved 4 ° C. Membraner blev inkuberet med et peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Cell Signaling), og fremkaldt med ECL (Pharmacia Biotech). Membranerne blev strippet i 30 minutter i Stripping Buffer (Thermoscientific) og re-undersøgt med anti-β-actin antistof som en loading kontrol (Sigma-Aldrich). Uafhængige eksperimenter valideret, at denne stripping procedure ikke føre til tab af signal.

Immunhistokemi

formalin-faste paraffin vævssnit (5 um) blev afparaffiniseret og rehydreret. Antigen genfinding blev udført med 10 mM citratpuffer (pH 6,0) i en trykkoger (20 psi i 10 min). Endogen peroxid og biotin /avidin blev blokeret i 15 minutter med respektive midler (Vector Laboratories). Efter inkubering med 5% normalt gede-hest-chicken serum ved stuetemperatur i 1 time, blev snit inkuberet med primære antistoffer (tabel 1) ved 4 ° C natten over efterfulgt af biotinylerede sekundære antistoffer og SABC reagens (Vector Laboratories). DAB (Invitrogen) blev anvendt som chromogenet, og hematoxylin som kontrastfarve. Mus eller kanin IgG, efter omstændighederne, ved den samme koncentration som det primære antistof blev brugt som en negativ kontrol og viste ikke uspecifik farvning [32].

immunhistokemisk vurdering

Et par ubrugelige kerner blev fundet i TMA’erne grundet væv kerne mangler, cancer nekrose, eller utilstrækkelige cancerceller. Disse kerner blev udelukket fra resultaterne.

Immunfarvning blev vurderet ved hjælp af en kvasi-kontinuerlig nukleare AR score, skabt ved at gange hvert intensitetsniveau (0 for ingen plet, en for svag plet, og 2 for intens plet) ved den tilsvarende procentdel af positive celler, og derefter summere resultaterne.

Ki-67 farvning blev målt ved tilfældigt at vælge op til 4 områder 250 um

2 i hvert væv site. Totalt celleantal og Ki67 positivt celleantal blev talt, og den endelige Ki-67-indekset blev beregnet ved anvendelse positivt celleantal divideret med den samlede celleantal.

AR antistoffer anvendt i denne undersøgelse målrettet tre distinkte regioner af den humane AR protein. Immunogenerne AR F39.4.1 (mod aa301-320) og AR441 (mod aa299-315) blev placeret i den N-terminale ende af AR mens AR C-19 (mod aa900-919) i C-terminalen. Derfor beskriver vi AR F39.4.1 og AR441 som N-terminal AR antistoffer og AR C-19 som en C-terminal AR antistof. Specifikke mønstre af AR nuklear immunfarvning blev vurderet som: N + C + (tilsvarende positiv N-terminale og C-terminale AR farvning i kernen); N + C ↓ (C-terminale AR score faldt mere end 50% i forhold til N-terminalen i kernen) og N-C- (lignende negativ N- og C-terminale AR farvning i kernen). De væv i N ↓ C + gruppe blev ikke medtaget, fordi de var sjældne, og ikke i forhold til C-terminale trunkerede AR varianter.

Statistisk analyse

statistiske analyser af resultaterne blev udført ved hjælp af Prism-software (Prism Graphpad), hvor vi brugte Mann-Whitney test, og

s

værdier ≤0.05 blev valgt som statistisk signifikant.

Resultater

Alternativt splejsede former for AR kunne identificeres under anvendelse N- og C-terminale antistoffer

Adskillige AR transkript varianter blevet beskrevet som koder AR polypeptider blottet for den C-terminale LBD grund alternativ exon splejsning [21], [24] – [28] . Men specifikke antistoffer er ikke tilgængelige til at detektere alle disse varianter i væv. Som antistoffer er blevet udviklet mod specifikke N-terminale og C-terminale domæner af AR-protein, søgte vi at bestemme, om disse reagenser kan anvendes til at skelne PCa udtrykker forskellige AR former. For at validere denne tilgang, vi først evalueres to PCa xenograft linjer afledt i laboratoriet af en af ​​forfatterne (RLV-CX) og kendt for at udtrykke forskellige AR-koder mRNA. Den LuCaP 86,2 xenograft, afledt fra en human PCa blære metastase og vedligeholdes ved seriel passage i ikke-kastrerede SCID-mus, er blevet vist at besidde en C-terminal trunkeret AR splejsningsvariant der sprunget exonerne 5-7 og koder for en alternativ læseramme fra exon 8 , betegnet AR

v567es. Den LuCaP 35 xenograft blev afledt af et PCA lymfeknudemetastase og udtrykker fuld længde AR (AR

FL) -kodende mRNA består af 8 exoner og et protein af passende størrelse til dette transkript [25].

Vi analyserede protein fra LuCaP 86,2 og LuCaP 35 xenotransplantater ved Western blot under anvendelse af antistoffer, der genkender N-terminalen (AR 441) eller C-terminalen (AR C-19) af AR

FL-protein. I LuCaP 35 tumor begge til AR-antistoffer detekteret en lignende 110 kDa AR polypeptid, som svarede til størrelsen af ​​AR

FL. I LuCaP 86,2 tumoren, ved siden af ​​en svag 110 kDa bånd, N-terminal AR antistof også identificeret en 80 KDa AR isoform, der svarede til den forudsagte størrelse af de C-terminale trunkerede AR splejsningsvariant-AR

v567es mens C-terminal AR-antistof gjorde ikke (Figur 1A).

(A) Western blot-analyse af AR ekspression i LuCaP 86,2 og LuCaP 35 xenotransplantattumorer. (B) IHC farvning for N- og C-terminale AR på LuCaP 86,2 (a og b) og LuCaP 35 (c og d) xenotransplantattumorer. (C) IHC-farvning for PSA (e), PSMA (f), Chromogranin-A (g), synaptophysin (h), Ki67 (i) og negativ kontrol (j) på LuCaP 86.2 xenograft. (D) IHC-farvning for PSA (k), PSMA (l), Chromogranin-A (m), synaptophysin (n), Ki67 (o) og en negativ kontrol (p) på LuCaP 35 xenograft. (Oprindelig forstørrelse x200, indsætte x400).

Svarende til Western blot-resultatet, immunhistokemisk analyse (IHC) af LuCaP 86,2 viste meget svag kernefarvning hjælp af C-terminale AR (AR c-19) antistof, men intens nuklear farvning i den serielle sektion med AR antistof mod N-terminalen (AR F39.4.1). Den LuCaP 35 tumor, vist at udtrykke kun AR

FL ved Western-analyse, viste ingen forskel mellem N- og C-terminale AR-farvning ved IHC (figur 1B). Disse data bekræftede, at sammenligne den N-terminale AR med C-terminale AR-ekspression kunne identificere C-terminale trunkerede AR varianter /mutationer i PCa væv.

AR

v567es er blevet vist at være konstitutivt aktiv [25 ], dette er i overensstemmelse med det faktum, at forskellige AR immunoreaktivitet med N- og C-terminale antistoffer blev observeret i kernen. For yderligere at bekræfte nukleare AR aktivitet, vi farves for AR-regulerede PSA og PSMA proteiner. LuCaP 86.2 var immunoreaktiv for både PSA og PSMA. For at bekræfte at LuCaP 86.2 ikke var en neuroendokrine xenograft linje, vi farvet med neuroendokrine biomarkører Chromogranin A (CHG-A) og synaptophysin (SYN). LuCaP 86.2 viste negativ CHG-A immunreaktivitet, og svag til moderat SYN immunoreaktivitet som et fint, granulært reaktionsprodukt, som blev overvejende lokaliseret i det perifere cellers cytoplasma. Endvidere ca. 20% af tumorcellerne var Ki67 positive indikerer LuCaP 86.2 havde en moderat proliferationshastighed (fig 1C). Tilsvarende IHC resultater for LuCaP 35 er også vist i figur 1D.

Variationer i N-terminal og C-terminal AR udtryk forekom sjældent i godartet epitel og primær ubehandlet PCa

For at bestemme hyppigheden af C-terminale afkortede AR varianter i godartet epitel og ubehandlet lokaliseret PCa, vi scorede IHC farvning af radikal prostatektomi prøver. Alle 28 normale prostata prøver havde overensstemmende N-terminale og C-terminale nuklear AR ekspression (N + C +) (figur 2A a og b). Blandt de 24 hyperplastiske prostata prøver, 21 tilfælde (87,5%) viste konsekvent N + C + ekspression (figur 2A c og d), kun 1 (4,2%) var faldet C-terminale AR-farvning (N + C ↓) og 2 (8,3 %) havde ikke nogen AR immunoreaktivitet (NC). I 50 primære PCA prøver, 46 tilfælde (92%) udtrykte N + C + AR (figur 2A e-h), 2 tilfælde (4%) var faldet nuklear C-terminale vs. N-terminale AR-farvning (N + C ↓) , mens 2 tilfælde (4%) var AR negative (NC-). Samlet set var der ingen signifikant forskel i forholdet mellem N- mod C-terminal nukleare farvningsintensitet mellem den normale prostata og hyperplastiske prostata prøver (

s

= 0,5756), normal prostata og PCA prøver (

s

= 0,7428), og hyperplastiske prostata og PCA prøver (

s

= 0,7508) (Figur 2B).

(A) IHC farvning for N- og C-terminale AR i normal prostata (NP) (a og b), hyperplastisk prostata (HP) (c og d) og den primære PCa (eh) (forstørrelse x200). (B) Sammenligning af AR farvningsprofiler blandt normal prostata, hyperplastiske prostata og primær PCa. (C) Sammenligning af AR farvningsprofiler mellem primær PCa og metastatisk CRPC.

Variationer i N-terminal og C-terminal AR udtryk forekom hyppigt i CRPC

For at bestemme hyppigheden af variant AR udtryk i metastatisk PCa, vi scorede IHC farvning af metastatiske steder fra 42 patienter, der døde af avancerede CRPC.

Blandt 162 metastatiske steder, viste 103 (63,6%) sites konsekvent nukleare AR udtryk med begge antistoffer (N + C +). Men 39 (24,1%) sites havde en nuklear C-terminal AR score (N + C ↓), der var mindst 50% mindre end den tilsvarende N-terminale AR score, og 20 (12,3%) steder af metastaser havde noget nukleart AR ekspression (NC-) (figur 2C). Disse IHC resultater var i overensstemmelse med hyppigheden af ​​AR splejsningsvarianter i metastatisk PCa bestemt under anvendelse af PCR-metoder til at opdage AR-V7 /AR3 og AR

v567es udskrifter [25]. Der var ingen forskel i N-terminal AR farvning mellem primær og metastatisk PCa (

p

= 0,38, data ikke vist), men hyppigheden af ​​nedsat nukleare C-terminal AR udtryk i metastatisk CRPC var signifikant højere end i primær PCa (

s

= 0,0027). Sammenligningen af ​​nukleare AR udtryk mellem primær PCa og metastatisk CRPC er vist i figur 2C.

AR-reguleret genekspression blev ændret i metastatisk CRPC med formindsket nukleare C-terminale AR

For at afgøre, om faldet i nukleare C-terminal AR udtryk var forbundet med en ændring i ekspressionen af ​​AR regulerede proteiner, der repræsenterer et tab af AR aktivitet, vi undersøgte AR regulerede proteiner PSA, PSMA, og TMPRSS2 udtryk i metastatiske CRPC prøver (figur 3A) . Mens knap mangler betydning, udtryk for PSA i N + C ↓ metastatiske steder var lavere end N + C + metastatiske steder (

s

= 0,0505). PSA udtryk i N-C- metastatiske steder var betydeligt lavere end både N + C + og N + C ↓ metastatiske sites (

s

0,001) (figur 3B). Derudover udtryk for PSMA i N + C + metastatiske steder var højere end i N + C ↓ metastatiske sites (

s

= 0,0097), men PSMA i NC-metastatiske steder var betydeligt lavere end både N + C + og N + C ↓ metastatiske sites (

s

0,0001) (figur 3B). Endelig udtryk for TMPRSS2 i N + C + metastatiske steder var betydeligt højere end N + C ↓ metastatiske sites (

s

= 0,045). TMPRSS2 i N-C- metastatiske steder var betydeligt lavere end både N + C + og N + C ↓ metastatiske sites (

s

0,01) (figur 3B). Tabet af TMPRSS2 udtryk i N + C ↓ og NC metastatiske steder var ikke så udtalt som tabet af PSA og PSMA udtryk, hvilket tyder på, at TMPRSS2 ikke kan reguleres af AR på samme niveau som PSA og PSMA i CRPC.

(a) IHC-farvning til N-terminal AR (a), C-terminale AR (b), PSA (c), PSMA (d), TMPRSS2 (e), AKT-1 (f), Ki -67 (g), Negativ kontrol (h) på en metastatisk CRPC væv (forstørrelse x200, indsætte x400). (B) PSA, PSMA, TMPRSS2 og AKT-1 farvning profiler af CRPC.

Vi næste undersøgt de gener, der er blevet identificeret som havende deres udtryk steget i respons på AR C-terminalen afkortede varianter [ ,,,0],26], [29], herunder Akt1, CDC20, CDK1, C-MYC, CyclinA2, UGT2B17 og UBE2C. Kvantitative RT-PCR-resultater viste, at Akt1, CDC20, CDK1 og UGT2B17 ekspression var betydeligt højere i de N + C ↓ (n = 11) sammenlignet med N + C + prøver (n = 7), (p 0,05) (figur 4A) . UBE2C trended også højere, men nåede ikke signifikans (p 0,10). Vi har detekteret yderligere AKT-1 protein-ekspression ved IHC. Men det relativt lave cyklus er angivet relativt høje niveauer af genekspression i alle tilfælde. Derfor, når vi også farves TMA for Akt1, relativt stærkt signal var til stede i de fleste af tumorprøver på TMA og i betragtning af de semi kvantitative målinger, påvistes ingen forskelle mellem grupperne ved IHC (figur 3B). Således kræft med N + C ↓ AR udtrykte højere Akt1 niveauer, men denne forskel kunne ikke påvises på IHC grundet rigelige protein i alle grupper.

(A) Profil af syv AR variant forbundet gener udtryk i menneskelig metastatiske væv. (B) De samme gener blev målt i LuCaP 86,2 og LuCaP 35 implanteret. Husholdning gen RPL13A blev brugt som en endogen kontrol.

Tabet af nukleare C-terminal AR immunoreaktivitet var forbundet med ekspressionen af ​​AR varianter i metastatisk CRPC

Vi fastslået, at tabet af C-terminale AR immunoreaktivitet forekom hyppigt i metastatisk CRPC. Dette tab af C-terminale immunreaktivitet kan skyldes ekspressionen af ​​en række kendte (for eksempel AR-V7 /AR3, eller AR

v567es) og ukendte AR splejsningsvarianter. For at bestemme om de N- og C-terminale immunoreaktivitet var forbundet med AR transcript varianter, udførte vi RT-PCR på en delmængde af metastatiske CRPC væv og sammenlignet RT-PCR resultater til IHC Resultaterne (tabel 4). Af 4 N + C + metastatiske prøver undersøgt af RT-PCR, alle udtrykte AR

FL (en havde også begrænset udtryk for AR-V7). Af 8 metastatiske prøver klassificeret som N + C ↓ ved IHC-analyse, alle udtrykte AR

FL og 6 (75%) også udtrykt mindst et kendt AR variant (AR-V7 /AR3 og /eller AR

v567es ) ved RT-PCR. Disse N + C ↓ metastatiske prøver udviste også mindre niveauer af PSA og PSMA immunreaktivitet. Ingen af ​​de fire NC metastatiske prøver udtrykte AR

FL undersøgt ved RT-PCR, selv om man udviste meget lavt niveau af AR

v567es udtryk.

Disse data viste, at IHC-analyse ved hjælp af forskellige AR antistoffer, som genkender tydelig AR protein regioner var meget overensstemmende med udskrifter koder AR

FL og AR splejsningsvarianter som mangler C-terminale exoner.

AR variant mRNA var følsom over for androgen koncentration in vitro

VCAP celler blev dyrket i trækul stribet serum (CSS), og derefter behandlet med dihydrotestosteron (DHT), MDV-3100 eller MDV-3100 med DHT, separat. QRT-PCR viste, at AR

FL mRNA blev undertrykt ved tilsætning af DHT, MDV-3100 og DHT + MDV (figur 5A). Varianten AR

v567es mRNA blev også undertrykt af DHT; imidlertid kan den forbedres ved tilsætning af androgenreceptorantagonist MDV-3100 alene, og undertrykt til niveauet for CSS når DHT blev tilsat med MDV-3100 (figur 5B). AR-V7-mRNA reagerede på en lignende måde som AR

FL (figur 5C).

(A) AR

FL mRNA blev undertrykt af DHT, MDV-3100 og MDV-3100 + DHT men ikke på niveauet af DHT alene. (B) AR

v567es mRNA blev undertrykt i nærvær af DHT, forøges yderligere ved tilsætning af MDV-3100 og undertrykt til niveauet for CSS når DHT blev tilsat sammen med MDV-3100. (C) AR-V7 mRNA reagerede på en lignende måde som AR

FL.

Heterogen udtryk for AR blev observeret i de enkelte patienter

Vi identificerede C-terminal afkortet AR proteiner i flere metastatiske steder fra hvert af 42 CRPC patienter (figur 6). Af de 42 patienter, 16 (38%) havde ingen tab af C-terminale AR ekspression, 23 (55%) havde mindst én metastatisk site med nedsat nuklear C-terminale AR immunreaktivitet, og 6 (14,3%) havde mindst én stedet uden AR ekspression. Disse data fremhæve heterogenitet AR udtryk mellem forskellige metastatiske steder inden for samme patient.

Flere metastatiske steder af 42 CRPC patienter var blevet analyseret af IHC hjælp 2 AR antistoffer. Farvningsresultaterne blev opsummeret som N + C + (blå), N + C ↓ (orange) og N-C- (rød). LN = lymfekirtel; L = lændehvirvel; R. = højre; L. = venstre; T = brysthvirvel

Derudover at bestemme, om AR status fremmet hastigheden af ​​tumorvækst, vi opdelt CRPC knoglemetastaser prøver i tre grupper:. N + C + (n = 93), N + C ↓ (n = 39), og NC- (n = 18). Den Ki67 indeks for N + C + sites var 18%. Dette var ikke signifikant forskellig fra N + C ↓ sites (20,8%) (p = 0,4225) eller NC sites (17,8%) (p = 0,95).

Diskussion

Traditionel begreber AR translokation til kernen, der involverer ligand-binding, dissociation fra chaperones og nuklear translokation indebærer, at uden androgen ligand, ville AR findes primært i cytoplasmaet og CRPC tumor progression ville være drevet af andre end dem, der involverer AR mekanismer. Dette er imidlertid ikke tilfældet med undtagelse fleste neuroendokrine tumorer. CRPC normalt har en transkriptionelt aktiv AR, som modulerer ekspressionen af ​​AR regulerede messenger RNA’er [1], [33]. Endvidere i de fleste undersøgelser af CRPC væv har AR vist sig, i kernen.

Flere mekanismer er blevet foreslået til at forklare AR kernelokalisering og nogle eller alle kan være ansvarlige for den, der ses i CRPC [34], [35]. De fleste af de foreslåede mekanismer vil kunne translokere AR til kernen da de kræver ligandbinding til LBD. Hvis dette var tilfældet, forudsat at der ikke er nogen forskel på AR strukturer, ville vi forvente at se nogen forskelle i AR immunfarvning med N- eller C-terminale rettede antistoffer i metastatisk CRPC. Men som vi viser i denne undersøgelse, er der en signifikant forskel mellem nuklear N- og C-terminale AR antistoffer i de metastatiske væv. Dette tyder på, at mekanismen (er) end de ovenfor nævnte kan også være involveret i AR translokation ind i kernen uden ligand i CRPC dem.

Selvom antistoffer er blevet udviklet til AR-V7 /AR3 og AR

v567es splejsningsvarianter, mindst 20 AR splejsningsvarianter er blevet rapporteret til dato. Med specifikke antistoffer til rådighed for kun 2 af varianterne, at anvendelsen af ​​specifikt antistof farvning på væv detektere kastreringsinduceret C-terminale trunkerede AR varianter ikke er mulig [20] – [25]. Her udvikler vi en ny og hurtig immunhistokemisk tilgang, der sammenligner N- og C-terminale AR immunoreaktivitet, som med succes kan vise den samlede hyppighed af C-terminale trunkerede AR-splejsningsvarianter i patienter.

De data, rapporteret her korrelerer ekspressionen af ​​AR protein ved IHC med 2 antistoffer og validering af ekspressionen af ​​AR splejsningsvarianter ved RT-PCR, antyder kraftigt, at variationen mellem AR N- og C-terminale immunoreaktivitet resultater fra ekspressionen af ​​alternative AR mRNA’er. Dog bør alternative forklaringer blive underholdt. De primære tumorer og blødt væv metastaser blev formalin fikseret og paraffin indlejret mens metastatiske læsioner af knogle blev formalin faste og afkalket med 10% myresyre før indlejring i paraffin. Vi observerede ingen signifikant forskel i AR farvning i blødt væv versus knoglemetastaser (p 0,05, data ikke vist). Desuden har vi ikke set forskelle med andre antistoffer mellem knogle og blødt forberedelse væv metoder ved hjælp af de samme væv og metoder [36], [37]. Derfor har vi ikke været i stand til at identificere en teknisk årsag til forskellene i farvning.