PLoS ONE: Effekter af Warm Iskæmisk Time på genekspressionsprofilering i kolorektal cancer væv og Normal Mucosa

Abstrakt

Baggrund

Genom-dækkende genekspression analyser af tumorer er et kraftfuldt værktøj til at identificere gen signaturer forbundet med biologisk og klinisk relevante egenskaber og flere tumortyper er under klinisk validering af potentielle forsøg. håndtering og forarbejdning af kliniske prøver, som kan påvirke de molekylære data fra deres analyse betydeligt. Vi undersøgte effekten af ​​væv håndtering tid på genekspression i humane normale og tumor colon væv gennemgår rutinemæssige kirurgiske procedurer.

Metoder

RNA udvundet fra prøver af 15 patienter på fire tidspunkter (for en i alt 180 prøver) efter kirurgi blev analyseret for genekspression på high-density oligonukleotid mikroanalyse. En blandet-effekter model blev brugt til at identificere prober med forskellige udtryk betyder på tværs af de fire forskellige tidspunkter. De p-værdier i modellen blev justeret med Bonferroni-metoden.

Resultater

Tredive-to probe sæt forbundet med væv håndtering tid i tumor prøver og enogtredive i normale væv , blev identificeret. De fleste gener udstillet moderate ændringer i udtryk over tidspunkter analyserede; men fire af dem var onkogener, og to bekræftede effekten af ​​væv håndtering af uafhængig validering.

Konklusioner

Vores resultater tyder på, at et kritisk tidspunkt for væv håndtering i tyktarmen synes at være 60 minutter ved stuetemperatur. Selv om antallet af tidsafhængige gener identificerede vi var lav, de tre gener, der allerede viste ændringer på dette tidspunkt i tumorprøver blev alle onkogener, således anbefale standardisering af væv-handling protokoller og indsats for at reducere den tid fra prøven flytning til snap frysning regnskab for varm iskæmi i denne tumortype

Henvisning:. Musella V, Verderio P, Reid JF, Pizzamiglio S, Gariboldi M, Callari M, et al. (2013) Effekter af Warm Iskæmisk Time på genekspressionsprofilering i kolorektal cancer væv og Normal slimhinde. PLoS ONE 8 (1): e53406. doi: 10,1371 /journal.pone.0053406

Redaktør: Shoba Ranganathan, Macquarie University, Australien

Modtaget: April 18, 2012; Accepteret: November 30, 2012; Udgivet: januar 7, 2013 |

Copyright: © 2013 Musella et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Fondazione Cariplo-regionen Lombardiet (projekt Titel: “Biobanca per il karcinom colorettale”), Associazione Italiana Ricerca Cancro, Alleanza Contro il Cancro, og EurocanPlatform projekt. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

med indførelsen af ​​nye genomiske teknologier som vævsbaserede RNA microarrays, mønstre af genekspression identificeret ved microarray analyser er blevet opdaget, at stratificere tumorer og forudsige de kliniske resultater i forskellige typer kræft [1]. Nogle af dem er med held blevet anvendt til at identificere patienter, der kan drage fordel af specifik behandling og FDA (Food and Drug Administration) -godkendte tests baseret på brystkræft gen underskrifter er nu kommercielt tilgængelige. Som følge heraf, indsamling i vævsbanker kirurgiske prøver, der kan anvendes til disse analyser er blevet et obligatorisk emne for at forstå de korrelative resultater af størstedelen af ​​de nuværende kliniske forsøg. variabiliteten i vævet håndtering og forarbejdning af kirurgiske prøver, kan imidlertid påvirke reproducerbarheden og fortolkning af resultater. Flere variabler, herunder væv manipulation, varm ex-vivo iskæmi og opbevaringstid kan potentielt ændre mRNA-ekspressionsniveauer og påvirke gyldigheden af ​​undersøgelser, der brugte kliniske prøver [2]. Alle disse variabler skal nøje undersøgt for at etablere retningslinjer for væv bank [3]. Organiseringen af ​​kvalificerede og certificerede biobanker bør være grundlaget for at sikre netværk af aktiviteter og tilgængeligheden af ​​kvalitets-certificeret biologisk materiale.

Formålet med denne pilotundersøgelse var at undersøge effekten af ​​tid at håndtere væv i præcist dokumenteret væv prøver, der fulgte de rutinemæssige forarbejdningsnormer i vores institution (Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, INT-MI), for at udvikle en klinisk anvendelig metode til prøveudtagning tumorer i vævsbanker, der kan sikkert bruges til microarray-analyser. Vi bruges kolorektal cancer (CRC) model. CRC er den næsthyppigste årsag til kræft død i de vestlige lande, og på trods af betydelige fremskridt i sin ledelse, samlet overlevelse for avanceret og metastatisk sygdom har ændret sig lidt i løbet af de sidste 20 år, med fem år på næsten 90% for tidligt og 15% for sent tumorer [4]. Som følge heraf er der et presserende behov for nye biomarkører at forbedre påvisningen og den kliniske behandling af CRC. Ved hjælp af høj-densitet oligonukleotid mikroanalyse undersøgte vi sekventielle virkninger af væv håndtering i prøver taget fra 15 CRCs og i deres matchet normalt væv opsamlet på vores Institution og efterladt ved stuetemperatur ved forskellige tidspunkter efter kirurgi. Undersøgelsens primære resultat var at evaluere effekten af ​​tiden på tumorprøver og eventuelt vælge bestemte gener, hvis ekspression er tidsrelateret, der kunne anvendes som detektorer af vævsnedbrydning. Yderligere, for at identificere gener påvirkes af tid uanset prøvetypen (normal eller tumor), vi også undersøgt tiden virkning i normale væv og sammenlignet den differentielle ekspression mellem de to vævstyper tegner sig for tiden.

Vores resultater viser, at virkningen af ​​væv håndtering tid på hele genekspressionsprofilen kunne anses mindre i tyktarmen, og at en rimelig grænse for indsamling prøver kunne være 60 minutter efter operationen, hvor der blev observeret genændringer. Sådanne prøver kan anvendes til at generere reproducerbare microarray profiler til at hjælpe beslutning behandling gør udnytte clinicogenomic modeller.

Materialer og metoder

1 Etik Statement

Alle patienter, hvis biologiske prøver blev inkluderet i undersøgelsen underskrev et informeret samtykke, der er godkendt af den uafhængige komité af INT-MI, til at donere til INT-MI sidesten vævsprøver efter endt diagnostiske procedurer til forskningsformål. The Independent Etisk Komité INT-MI godkendt brugen af ​​prøverne for denne specifikke undersøgelse inden for rammerne af et projekt i biobank kvalitetskontrol.

2 Study Design og Sample Handling

tumor og de normale modstykke prøver anvendt i forsøgene blev prospektivt indsamlet fra 15 patienter, som gennemgik kirurgisk resektion på INT-MI og hvis tumorer var repræsentative for de forskellige patologiske stadier af denne tumortype. På histologiske rutinemæssigt undersøgelse alle tumor prøver blev klassificeret moderat differentieret colon adenokarcinomer NOS (grad G2 i henhold til amerikanske Blandede Cancer 2010 https://www.cancerstaging.org/). De klinisk-patologiske og histologiske detaljer er anført i tabel 1. Seks fragmenter fra hver prøve blev opnået og blev tilfældigt efterladt ved stuetemperatur ved forskellige tidspunkter som følger: tre fragmenter på 20 min. (T0), ét fragment på 60 min. (T1), ét fragment på 180 minutter. (T2) og et fragment på 360 min. (T3). Tiden blev målt ud fra patientens kirurgisk udskæring og den første tidspunkterne analyseres (T0) blev behandlet og frosset inden for 20 min. fra kirurgi. Prøverne blev transporteret fra teater til patologi ved stuetemperatur uden is. Det samlede antal analyserede fragmenter var 180 (90 normale prøver og 90 tumorprøver). Neoplastiske prøver blev opnået fra det centrale område af neoplasi, undgå at vælge nekrotiske materiale eller overgangszoner med sund slimhinde. Prøver af colon sund slimhinde blev resektion mindst 20 centimeter langt fra neoplasi og fjernt fra de kirurgiske resektion marginer. Kontrollen var udelukkende costituited ved normal slimhinde, strippet fra den luminale overflade.

3 RNA-ekstraktion og evaluering

Vævsprøver blev opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-ekstraktion. Totalt RNA blev ekstraheret fra 10-20 mg af tumorprøver og fra 30-40 mg af normale prøver. Væv blev sønderdeles mekanisk og samtidigt homogeniseres i nærvær af QIAzol Lysis-reagens (Qiagen, Valencia, CA, USA), ved anvendelse af en Mikrodismembrator (Braun Biotech International, Melsungen, Tyskland). RNA blev ekstraheret under anvendelse af miRNeasy Mini kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Oprensning og DNase-fordøjelse blev udført under anvendelse af to forskellige kits: RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen) blev anvendt i op til 45

μ

g RNA mens RNeasy Mini kit (Qiagen) blev anvendt til RNA i området mellem 45 og 100

μ

g. RNA-koncentrationer blev målt med NanoDrop ND-100 spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE), mens RNA kvalitet blev vurderet med Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) under anvendelse af RNA 6000 Nano kit (Agilent Technologies). RNA Integritet Number (RIN) [5] blev bestemt ved hjælp af den software, der leveres af producenten.

4 genekspressionsprofilering

RNA-prøver blev behandlet for microarray hybridisering af Functional Genomics core facilitet på INT-MI. Kort fortalt blev 800 ng af total RNA revers transkriberet, mærket med biotin og amplificeret natten over (14 timer) under anvendelse af Illumina RNA TotalPrep Amplification kit (Ambion, Austin, Texas, USA) i overensstemmelse med producentens protokol. Et ug den biotinylerede cRNA prøve blev blandet med Hyb E1 hybridizatioin puffer indeholdende 37,5% (vægt /vægt) formamid og derefter hybridiseret til Sentrix Bead Chip HumanHT12_v3 (Illumina, Inc., San Diego, CA) ved 58 ° C natten over (18 timer). Den vifte repræsenterer over 48000 perletyper, hver med en unik sekvens er afledt af humane gener i National Center for Biotechnology Information reference Sequence og UniGene database. Array chips blev vasket med producentens E1BC løsning, farvet med en ug /ml Cy3-streptavidin (Amersham Biosciences, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Og til sidst scannet med Illumina BeadArray Reader

5 Real Time PCR

TaqMan® gen analyser blev anvendt til validering af ABL1 (Hs00245443), fosB (Hs01547109), juni (Hs00277190) gener i tumoren prøver og HIST1H1D (Hs00271187), HIST1H1E (Hs00271195), HIST1H4E (Hs003743461), HIST4H4 (Hs00545522) i både Tumor og normale prøver. Alle gener blev normaliseret til 18S (HS03003631), mens de tre Tumorassocierede gener blev også normaliseret til ACTB (HS03023942) og GAPDH (Hs00266705). Kort fortalt cDNA blev syntetiseret i to eksemplarer til validering af ABL1, fosB og Jun og i en enkelt reaktion for validering af histon gener fra 500 ng af total RNA ved hjælp af High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, Californien ) ifølge producentens instruktioner. Real-Time qPCR blev udført ved anvendelse af FAST kemi (Applied Biosystems) med genspecifikke assays i ABI PRISM 7900 HT Real-Time PCR-system (Applied Biosystems) under anvendelse af 10 ng cDNA.

6 Dataanalyse

6.1 Microrarray data forbehandling.

Rå data blev indhentet fra scannede billeder ved hjælp af Illumina BeadStudio software (version 3.3.8) og præ-behandlet ved hjælp af lumi pakken [6] BioConductor projekt [7]. Signalet middelværdi, påvisning sats og mellem array-afstande blev evalueret i kvalitetskontrollen trin. To af de 90 profiler fra tumorprøver og to fra de 90 profiler fra normale prøver ikke passere kvalitetskontrol og blev kasseret i efterfølgende analyse. Data blev normaliseret under anvendelse af Robust Spline Normalisering fremgangsmåde og prober med en påvisning p-værdi 0,01 hos mindre end 10% af prøverne blev frafiltreret. Alle microarray data er MIAME kompatibel og de rå data blev indsat på NCBI s Gene Expression Omnibus (GEO) database (https://www.ncbi.nmlm.nih.gov/projects/geo/) med tiltrædelse nummer GSE37182.The association mellem baseline gen profiler og klinik-patologiske træk blev analyseret ved En-vejs ANOVA.

6.2 Tidsforløb analyser.

for at identificere sonder i tumorprøver forskelligt udtrykt på tværs af de fire forskellige tidspunkter (

tidsforløb ekspressionsanalyse

) et blandet effekter model blev implementeret på microarray data ved at betragte den faktor

Time Hotel (T0, T1, T2, T3) som faste og den faktor

patient

som random [8]. Modellen blev implementeret ved at betragte som afhængige variabler log (base 2) udtryk værdi af hver probe. P-værdierne af modellen blev justeret med Bonferroni-metoden [9]. For valideringsundersøgelsen den samme fremgangsmåde blev anvendt ved at betragte som afhængige variabler de -ΔCt værdier fra qPCR udført på gener af interesse. Statistisk analyse blev udført gennemføre en specifik kode udviklet i SAS ® software v. 9.2 (SAS Institute Inc. Cary, NC). Overlejres resultater blev fremstillet ved anvendelse programmeringssproget R v. 2.12.0 [10] samt ved hjælp af frit distribueres og open source EDGE softwarepakke [11]. En identisk statistisk procedure blev efterfølgende anvendt i behandlingen af ​​data fra Normal væv. RIN værdier svarende til både normale og tumor prøver blev analyseret efter samme fremgangsmåde, der anvendes til microarray data ved overvejer også den faktor

Type

(normal eller tumor) og som er fastsat (

tidsforløb RIN analyse

) .

6.3 Gene sæt analyse

Gene sæt funktionel analyse ved hjælp af Gene ontologi (2010) [12].; [13] databaser blev udført ved hjælp af BioConductor pakker GOstats [14] og kategori (v 2.16.0.) Med standardparametre (over-repræsentation med p-værdi 0,01) (v 2.16.0.).

Resultater

1 RIN Analyse

RNA Integrity Number (RIN) af samtlige prøver i løbet af alle tidspunkter havde en median værdi på 5,8 med en inter-fraktil vifte af 1,95. Tumor prøver havde i gennemsnit en højere RIN værdi end de normale prøver (median på 6,4 og 5,35 henholdsvis), især på det første tidspunkt T0. Lignende fordelinger af RIN værdier kunne iagttages på tværs af de forskellige tidspunkter og betydelig variation blev observeret for hver prøve inden det første tidspunkt T0 (RIN varians median = 1,668, IQR = 2,084), hvilket var mere udtalt i de normale prøver. Tidsforløbet RIN analyse viste, at RIN værdier havde en tendens til at falde over tid (samlet p-værdi for Time = 0,0565 og for enlige kontraster i forhold til T0, T1 = 0,0214, T2 = 0,1705 og T3 = 0,0529). Fordelingen af ​​RIN værdier adskiller sig væsentligt (p-værdi = 0,0008) i Tumorprøver i forhold til de normale (fig. 1).

RIN distributioner på hvert tidspunkt for både tumor (A) og normal ( B) prøver. En højere RIN indikere en højere RNA kvalitet.

Ved at betragte alle de fire tidspunkter vi identificeret en delmængde af 6 normale og 7 tumor tilfælde RIN værdier som var stadig højere end fem og tidsforløb udtryk analyse blev udført også for denne delmængde af prøver. Det skal understreges, at ingen association blev observeret mellem gen profiler på tumorprøver ved T0 og trin (p-værdi = 0,59) eller placering (p-værdi = 0,95) af sygdommen.

2 Tidsforløb Expression Analysis

Efter kvalitetskontrollen af ​​microarray data, udtrykket profiler af 4 prøver (2 profiler fra tumor og 2 fra normale prøver) blev fjernet. Disse outliers tilhørte forskellige tidspunkter af to patienter i tilfælde af normale prøver og til den samme patient til tumorprøver. På grund af karakteren af ​​undersøgelsens design var det afgørende at have for hver enkelt patient en fuld billeder på tværs af alle tidspunkter og dermed alle profiler forbundet med disse patienter blev ikke tage i betragtning i tidsforløbet analyse. Som følge heraf blev i alt 13 patienter anvendes på normal datasæt som indeholdt 17895 prober og 14 i tumoren datasæt indeholdende 18007-prober. Begge datasæt delt 16698 almindelige sonder

De sonder identificeret af den strenge Bonferroni korrektion. (P-værdi 0,05) metode i

Tid

faktor eller i mindst én af de tidsmæssige kontraster ( T0 baseline) i normal og Tumor datasæt er anført i tabel 2 (N = 32) og tabel 3 (N = 31) hhv. I disse tabeller, er rækkerne er bestilt i henhold til de rå p-værdier afledt af

Tid

faktor og en stjerne (*) I kolonnerne ‘Time’, ‘T1’, ‘T2’, eller ‘ T3 ‘angiver hvorfra kontrast proben blev valgt. Heatmaps i panel A og B i figur S1 grafisk repræsenterer retningen af ​​udtrykket ændring på hvert tidspunkt i tumoren og Normale datasæt henholdsvis.

Fotos

Fem sonder (gener) udviser forskellig udtryksmidler på tværs af de fire tidspunkter blev identificeret i både Normal og tumoren datasæt (

HIST1H1D, HIST1H1E, HIST1H4E, HIST4H4 og 5.960.086).

størstedelen af ​​variabilitet observerede stammer fra den sidste tidspunkt T3 på 360 minutter, når man sammenligner med baseline T0. Dette gælder især i tumoren datasæt mens nogle prober afledt af T2 kontrast dukke op i den normale datasæt. Alle identificerede gener i Tumor datasæt er konsekvent opreguleret over tid; det samme gælder for den normale datasæt med nogle få undtagelser. I det hele dog, de fleste gener udviser ikke drastiske ændringer i niveauer af ekspression. Funktionel annotation af generne fra de to lister (ved hjælp af både Gene ontologi og Kegg veje databaser) fremhævede, at 22 af de 32 gener moduleret i normale væv var histoner, der er involveret i nucleasome organisation og kromatin forsamling. Fire af dem var også tidsafhængig i tumor prøver, sammen med andre 27 gener med forskellige funktioner, der er involveret i kræft, herunder onkogener, såsom

Juni

,

fosB

,

ABL1

EGR1

. En anden gen almindeligvis moduleret i Normal og tumorvæv var

RNU11

, en lille nukleare RNA.

En identisk analyse blev udført ved hjælp af den delmængde af prøver med en RIN højere end fem, som identificerede kun 6 sonder i Normal datasæt og 6 i Tumor datasæt, datasæt sandsynligvis på grund af den reducerede prøve størrelse. Ingen fælles sonder er fundet i de to lister. Fem af 6 sonder (

HIST1H1E

,

HIST1H4B

,

HIST1H4E

,

HIST4H4

,

5.960.086

) i Normal datasæt var også til stede i analysen ved hjælp af alle prøver og 2 (

HSPA1A

,

IER5

) var i almindelige i Tumor datasæt.

3 RT-PCR Validation

de tre gener

, der var signifikante

for ‘Time’, ‘T2 «og» T3 «kontraster

i tumoren prøver (juni

,

fosB

ABL1)

blev udvalgt til teknisk validering med Real Time PCR (RT-PCR) analyse i de samme tumorvæv, der tilhører de 14 forskellige patienter analyseret af microarrays. To af dem (

Jun og fosB)

bekræftede resultaterne fra de arrays. Figur 2 rapporterer udtrykket dynamisk over tid af de gener, normaliseret til 18S. Normalisering hjælp GAPDH og ACTB husholdningsgener bekræftede disse resultater (data ikke vist). ABL1 blev ikke valideret som iskæmi associeret gen sandsynligvis på grund af den svage sammenhæng mellem microarray og RT-PCR-data. Dette kan delvis forklares med den begrænsede udtryk variabilitet af dette gen i vores prøver sammenlignet med juni og fosB (fig. S2). Fire gener almindeligvis modulerede i normalt og tumorvæv, blev også analyseret (HIST1H1D, HIST1H1E, HIST1H4E og HIST4H4); kun én af dem, HIST1H4E, bekræftede microarray data.

RT-PCR værdier fosB, Jun og ABL1 (-ΔCt) normaliseret til hus-føring gen 18S.

diskussion

Vi undersøgte effekten af ​​væv håndtering tid på global genekspression hjælp CRC prøver sub-samplet og snap-frosset på forskellige tidspunkter efter kirurgi, efter rutinemæssige væv håndtering protokoller en Pathology Unit. RNA kvalitet vurderes af RNA Integrity Number (RIN) udviste en svag tendens til fald er forbundet til anden med tumorprøver udviser højere og mindre variabel RIN values ​​at T0 forhold til de normale prøver. Tilstedeværelsen af ​​nedbrydning ved T0 kunne indikere variabiliteten af ​​proceduren eller en bestemt følsomhed af RNA fra colon væv. Resultater opnået for tumorprøver er i overensstemmelse med, hvad der findes af Bray et al. [15]. Alle prøver blev anvendt til microarray analyse uanset deres RIN nummer at forstå, hvis det microarray platform kunne fremhæve bedre fuldmagter til kvalitet for væv håndtering. Fordelingen af ​​funktionen intensiteter pr vifte var meget ens på tværs af alle de 180 arrays analyserede, hvilket tyder på, at alle RNA udføres på samme niveau, og at hybridiseringer blev udført på samme måde; kun 4 prøver ikke passere kvalitetskontrol.

For at vurdere variabiliteten af ​​genekspression målinger som funktion af tiden, blev hver funktion (probe) modelleret hensyn til tiden kategorier, og korrigeret for Patient faktor. Dette blev gjort separat i både tumorvæv og normalt datasæt. Ved hjælp af en Bonferroni korrektion af P 0,05, blev enogtredive prober identificeret som tidsafhængig i tumorprøver og toogtredive i normale prøver. Mange af de gener, der er identificeret i tumoren datasættet var DNA-bindende proteiner, der er involveret i forskellige processer: nogle svarede til gener involveret i kræft, såsom

ABL1

,

Juni

,

fosB

,

NFKB1A

og

CCL5

; fire sonder tilhørte histoner (

HIST1H1E

,

HIST1H4E

,

HIST1H1D

HIST4H4

), andre var transkriptionsfaktorer (

DDIT3

) eller gener involveret i transskription som

EGR1

PPP1R15A

. Seks gener blev involveret i apoptose, en af ​​de processer induceret af væv resektion. De fleste af de identificerede gener (N = 22) var signifikant i Time sammenligning involverer alle tidspunkter, 16 blev identificeret i T3 versus T0 kontrast og kun 3 gener (

ABL1

,

Juni

FOS

) på begge tidspunkter T2 og T3. Ni gener ændret kun på T3. På den anden side er mange af generne identificeret i de normale prøver (N = 21) svarede til gener, der koder for histonproteiner, og tre var små nukleare RNA’er (

RNU2-1

,

RNU11

og

RNU12

). Tredive-to gener ændret over alle fire tidspunkter analyserede; 17 af dem var signifikant forskellige på tidspunkt T3 og 8 ved begge tidspunkter T2 og T3. To gener ændret kun på T3. Ved at udføre den samme analyse kun bruger prøverne med en RIN over fem meget få gener blev identificeret (6 sonder i begge datasæt), hvoraf primært histoner var fælles med de tidligere identificerede gener. Resultaterne fra disse to fremgangsmåder indikerer, at de observerede ændringer over tid er forholdsvis ubetydelig. Faktisk, når vi sammenlignede vævstyper mellem både Normal og Tumor datasæt et meget stort antal af forskelle, hvor observerede, som forventet, uanset kvaliteten af ​​RIN. Endvidere funktionel analyse af disse prober under anvendelse af Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (Kegg) pathway database viste, at disse forskelle matches med elleve væsentlige involverede veje i cancer progression herunder Celle cyklus, DNA-replikation og p53-signalvejen (data ikke vist).

de observerede i generne for både normale og tumorvæv ændringer forekom hovedsageligt på T3, selvom nogle gener allerede blev ændret ved T2, hvilket antyder, at et kritisk tidspunkt indeholder 60 minutter ved stuetemperatur. Interessant, de tre gener, der viste ændringer allerede ved T2 i tumor prøver var alle onkogener, hvilket tyder på at nøje at overveje ændringer af disse gener mens håndtering tumorprøver og bruge en mere konservativ tid tærskel (dvs. 60 minutter) for prøveindsamling. Ekspressionsniveauerne over tid af de fleste af de gener blev forøget. Den nuværende fund er i overensstemmelse med det, findes ved Dumur et al. [16] på æggestok kræfttilfælde og ved Bray et al. [15], i CRC, hvor antallet af prober med forøget ekspression augmented med tiden. Som omtalt af forfatterne af de to undersøgelser, er det modsatte af, hvad forventet siden håndtering tid favorisere nedbrydning af RNA-transkripter og kan i hvert fald delvis afspejler en aktiv modulation af genekspression. Sammenligning mellem GO klassifikation af differentielt udtrykte gener i vores (FDR justerede p-værdier 0,05) og Bray analyser viste nogle fælles beriget udtryk ( “protein dimerisering aktivitet” og “transkriptionsfaktor aktivitet ‘). Mulige forklaringer på disse resultater kunne være de forskellige tidspunkter evalueret (op til 360 minutter i vores undersøgelse og op til 120 minutter i Bray undersøgelse), forskellige procedurer følges for prøveindsamling (kirurgiske prøver, der fulgte den rutinemæssige behandling standard vs tumorbiopsier) og forskellige microarray platforme, der anvendes til ekspression analyser (Illumina vs Affymetrix).

To af de tre gener udvalgt til validering

i tumorvæv

(

JUN og fosB) bekræftede array resultater

. Disse gener var også blandt de mRNA mest markant ramt af tid frosset for brystkræft undersøgelse [17]. Som rapporteret af disse forfattere, Jun og fosB er stress induceret umiddelbart tidlige transkriptionsfaktorer som er komponenter af AP-1-dimerer, og disse dimerer er blevet fundet ændret af iskæmi i forskellige væv, herunder prostata og tyktarmskræft. I iskæmiske og riperfused celler de to gener inducere proliferation og apoptose og kunne være tæt forbundet med attemps for nedbrydning eller regenerering af injuried væv [18]. Fem sonder blev delt mellem normale og tumor prøver. De identificerede gener fra histon familie (

HIST1H1D

,

HIST1H1E

,

HIST1H4E

HIST4H4

) involveret i DNA-organisation, og en lille nukleare RNA (

RNU11

). Kun én af disse gener (

HIST1H4E

) valideret microarray data. Den høje sekvens lighed histonerne kan forklare det høje antal af modulerede histoner identificeret, kan det være på grund af delvist uspecifikke hybridisering og kunne være årsagen til den manglende validering med en uafhængig teknik.

I dette papir vi har beskrevet for første gang virkningen over tid på at håndtere op til 6 timers normal colorektal væv, som ofte anvendes som kontrol i genom analyser. Interessant normalt væv viste mindre nedbrydning end dens tilsvarende tumorprøver, både med hensyn til RNA kvalitet (RIN værdi) og af modulerede gener, der var hovedsagelig histoner. Vores resultater favoriserer opbevaring af normalt væv, der ud over tumoral.

De overordnede ændringer i genekspression set i de analyserede i den aktuelle undersøgelse, hvor mere end 16000 sonder blev undersøgt prøver, synes ikke at korrelere med en global transkriptom begivenhed, man kunne forvente, i det mindste i den tidsramme analyseret i denne undersøgelse ( 20 minutter, 60 minutter, 180 minutter og 360 minutter). I betragtning af det meget lave antal berørte gener fundet, virkningen af ​​væv håndtering tid på den samlede genekspression profilering, i hvert fald i CRC, kunne anses mindre og ville ikke forventes at spille en vigtig rolle i genekspression-baserede tumor lagdeling.

Vores resultater er enige med den for Dumor et al. [16] og af Micke et al. [19], som viste ingen relevante ændringer i æggestok kræft og med hvad Hatzis et al. findes i brystcancer [20]. Andre undersøgelser har vist signifikante ændringer i RNA efter 30 minutters væv eksstirpation [15]; [21]; [22]. Da vores design ikke omfatter tidlige tider, kan vi ikke udelukke allerede forekommet, at relevante ændringer før vores første tidspunkt (20 minutter). Men de førnævnte undersøgelser har typisk stikprøvestørrelser meget lave og vil skulle yderligere validering.

Der blev observeret signifikant ændring af genekspression profil i vores tidligere undersøgelse om brystkræft prøver hvor tiden væv håndtering ændret ekspression af gener indgår i de hyppigste brystkræft prædiktive gen signaturer [23]. Disse data var i overensstemmelse med Borgan et al. [17], der findes miRNA (microRNA) og mRNA-ekspression alterated i brystkræft med iskæmi tid op til seks timer. Faktisk Hatzis og kolleger [20] i brystcancer viste ingen relevante ændringer i ekspressionsniveauer af enkelte gener og multigenfamilier signaturer, sandsynligvis fordi de betragtes 40 minutter som længste tidspunkt ved stuetemperatur eller op til 180 minutter, men ved anvendelse af RNA-senere til bevare RNA integritet.

på trods af delvis uenighed om dens udstrækning, kan tid af væv håndtering have en effekt på genekspression, og sandsynligvis kan variere med væv og med tumor type, herunder dem, der kunne udvise større følsomhed over for hypoksi effekter , såsom hjernetumorer [24].

konklusioner

resultaterne, at fire af de få gener betydeligt forskellige blandt de analyserede i tumoren prøver tidspunkter var onkogener, antyder, at analyse af deres udtryk i tumor prøver kan føre til misvisende resultater. Selvom tiden væv håndtering har en svag indflydelse på den samlede genekspression profilering, dereguleringen af ​​gener er direkte involveret i tumor processer indebærer, at væv skal opbevares ved tidlige tider efter kirurgi (i vores sammenhæng ikke mere end en time) og stærkt støtte dens indførelse som retningslinje for væv repositories.

Støtte Information

Figur S1.

Expression ændring på hvert tidspunkt i Tumor (A) og Normal (B) datasæt

doi: 10,1371 /journal.pone.0053406.s001

(PPTX)

Figur S2. Salg Scatter plot af RT-PCR ACt værdier (x-akse) versus log2 microarray intensitetsværdier (y-akser) for ABL1, JUN og fosB gener. I hver graf Pearson korrelationskoefficient (R) blev anvendt til at måle styrken af ​​foreningen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0053406.s002

(PPTX)