PLoS ONE: eukaryot Initiation Factor 2α – en downstream Effector af pattedyr for rapamycin – Modulerer DNA reparation og Kræft Reaktion på Treatment

Abstrakt

I et forsøg på at omgå modstand mod rapamycin – et mTOR-hæmmer – vi søgte for nye rapamycin-downstream-mål, der kan være centrale aktører i svaret af kræftceller til terapi. Vi fandt, at rapamycin, ved nM-koncentrationer, øget phosphorylering af eukaryot initieringsfaktor (elF) 2α i rapamycin-sensitive og østrogenafhængige MCF-7-celler, men havde kun en minimal virkning på eIF2α phosphorylering i rapamycin-ufølsomme triple-negative MDA -MB-231-celler. Tilsætning af salubrinal – en hæmmer af eIF2α dephosphoryleringen – faldt udtryk for en overflade markør forbundet med kapacitet til selv fornyelse, øget ældning og induceret klonogenisk celledød, hvilket tyder på, at overdreven fosforylering af eIF2α er til skade for cellernes overlevelse. Behandling af celler med salubrinal forøget strålingsinduceret stigning i eIF2α phosphorylering og klonogenisk død og viste, at bestrålede celler er mere følsomme over for øget eIF2α phosphorylering end ikke-bestrålede dem. Svarende til salubrinal – den phosphomimetic eIF2α variant – S51D – øget følsomhed over for stråling, og begge ophævet strålingsinduceret stigning i brystkræft type 1 modtagelighed gen, således implicerer øget phosphorylering af eIF2α i modulering af DNA-reparation. Faktisk salubrinal inhiberede ikke-homolog ende sammenføjning samt homolog rekombination reparation af dobbelt strengbrud, der blev induceret af I-Scel i grønt fluorescerende protein reporter plasmider. Ud over dets virkning på stråling, salubrinal forbedret eIF2α phosphorylering og klonogenisk død i afhængighed histondeacetylaseinhibitoren – vorinostat. Endelig den katalytiske kompetitiv inhibitor af mTOR – Ku-0063794 – øget phosphorylering af eIF2α demonstrerer yderligere inddragelse af mTOR aktivitet i modulering eIF2α phosphorylering. Disse forsøg antyder, at overdreven phosphorylering af eIF2α formindsker overlevelse af cancerceller; gør eIF2α en værdig mål for udvikling af lægemidler, med potentiale til at forbedre de cytotoksiske virkninger af etablerede antineoplastiske behandlinger og omgå modstand mod rapalogues og muligvis til andre lægemidler, der hæmmer opstrøms dele af mTOR pathway

Henvisning.: Tuval-Kochen L, Paglin S, Keshet G, Lerenthal Y, Nakar C, Golani T, et al. (2013) eukaryot Initiation Factor 2α – en downstream Effector af pattedyr for rapamycin – Modulerer DNA reparation og Kræft respons på behandlingen. PLoS ONE 8 (10): e77260. doi: 10,1371 /journal.pone.0077260

Redaktør: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, USA

Modtaget: April 29, 2013; Accepteret: August 30, 2013; Udgivet: 25 oktober 2013

Copyright: © 2013 Tuval-Kochen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen blev understøttet af en generøs donation fra boet efter Miss Haran ESTER af velsignet hukommelse gennem Keren Izvonot, Israel, Ministeriet for sundhed (SP) og hver fond Medical Research Development Infrastruktur – Sheba Medical center (YL). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

phosphatidylinositol 3-kinase – proteinkinase B – pattedyr mål for rapamycin (PI3K-Akt-mTOR) pathway regulerer cellevækst og proliferation. Liberaliseringen af ​​vejen ligger til grund onkogene transformationer og modulation af antineoplastiske behandlinger påvirker deres udfald. MTOR er hæmmere – rapamycin og derivater – mindske kræft celledeling og er blevet testet som anticancer-midler i kliniske forsøg [1-3]. Rapamycin er blevet anvendt til overtrækning stents at forhindre angiografisk-restenose [4], og har vundet FDA godkendelse som et immunsupprimerende. Dens derivater – temsirolimous og everolimous er blevet godkendt til behandling af forskellige former for kræft [5,6]

Rapalogues binder deres intracellulære receptor FK506 bindende protein 12 (FKBP12), danner et kompleks, der hæmmer mTOR kompleks en. (mTORC1) ved binding mTOR s FKBP12 rapamycin-bindende domæne [7]. Endvidere kan langvarig inkubation med rapalogues inhibere dannelsen af ​​mTOR kompleks 2 (mTORC2) [8]. Men virkningen af ​​rapalogues på mTORC1 og mTORC2 er celletype specifik og kan afhænge af den relative forekomst af molekyler, der deltager i makeup af mTORC s makromolekylære komplekser [8,9]. Derfor den hæmmende resultat af rapalogues på tumorvækst er ikke universel [7].

Derfor, i rapamycin-sensitive cancerceller, afgrænser rapamycin downstream effektorer som modulerer tumorvækst og respons på antineoplastisk behandling vil sandsynligvis føre til opdagelsen af ​​nye forbindelser, som vil inhibere tumorvækst og /eller forøger dens følsomhed til etablerede terapier. Sådanne molekyler forventes at omgå modstand af kræftceller til lægemidler rettet mod opstrøms dele af PI3K-Akt-mTOR pathway samtidig have kun en delvis effekt på sine globale aktiviteter.

I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi, at inhibering af mTOR fører til øget phosphorylering af eIF2α – en underenhed af eIF2. Til dato har kontrasterende rapporter offentliggjort vedrørende inddragelse af mTOR i eIF2α fosforylering [10-16]. Men den foreliggende undersøgelse viser, at i østrogenafhængige rapamycin-sensitive brystkræft MCF-7-celler samt i tredobbelt negative rapamycin-ufølsomme MDA-MB-231-celler, inhibering af mTOR ved rapamycin og ved specifik katalytisk inhibitor (Ku-0.063.794 ) henholdsvis fører til øget phosphorylering af eIF2α. Når bundet til GTP, rekrutter eIF2 Met · tRNA

MET til ribosomet, som så scanner udjævnede mRNA. Efter indregning af initieringskodonet og GTP hydrolyse, den inaktive eIF2 · BNP frigives og genbruges i et aktivt eIF2 · GTP kompleks via interaktion med guanin nukleotid udveksling faktor eIF2B [17]. Under normale fysiologiske betingelser, eIF2α letter interaktionen af ​​eIF2 med eIF2B [18]. Imidlertid phosphorylering af eIF2α ved sin Ser

51 fik eIF2 fra et substrat af eIF2B i sin kompetitiv inhibitor, hvilket fører til en reduktion i niveauet af eIF2 · GTP · Met · tRNA

MET kompleks og til dæmpning af global protein oversættelse. Vigtigt er det, fordi det cellulære niveau af eIF2 overstiger eIF2B, kan en lille stigning i eIF2α phosphorylering sekvestrere en væsentlig del af eIF2B [17]. I pattedyrceller eIF2α phosphoryleres med fire forskellige kinaser, der reagerer differentielt til forskellige stress-signaler [17], og dets dephosphorylering udføres ved den katalytiske underenhed af phospho-proteinphosphatase 1 (PP1c) i kompleks med specifikke regulatoriske underenheder f.eks den konstitutive repressoren af ​​eIF2α phosphorylering (CREP) eller stress-induceret vækststandsning og DNA-skade inducerbar protein (GADD34) [19]. Salubrinal – en hæmmer af eIF2α dephosphorylering – forstyrrer sammenslutningen af ​​PP1c og dets regulatoriske subunits, hvilket fører til øget eIF2α fosforylering. Dens anvendelse på forskellige cellesystemer in vitro er blevet anvendt til at belyse den fysiologiske relevans af øget eIF2α phosphorylering til celleoverlevelse [20,21].

Den molekylære resultat og fysiologiske relevans af øget eIF2α fosforylering er blevet grundigt undersøgt i løbet af endoplasmatisk reticulum (ER) overbelastning, hvor det generelt menes at udøve en beskyttende rolle. Som reaktion på øget ER belastning PKR-lignende ER-lokaliserede eIF2α kinase (PERK) aktiveres, og en forbigående stigning i eIF2α phosphorylering ensues [22]. Dette fører til en global dæmpning af protein oversættelse, der kan gå hånd i hånd med øget oversættelse af specifikke mRNA, der besidder enten en intern-ribosom-entry-site element [23] eller korte åbne læserammer i deres 5 ‘leder [17]. Den globale dæmpning af proteintranslation formindsker ER belastning, mens specifikke proteiner, hvis oversættelse forøges aktivere transkription af gener, som modulerer cellulær reaktion på stress. Den lindring af eIF2α fosforylering er nødvendig for at muliggøre oversættelse af den nye transkriptom [24]

Eksponering af muse embryonale fibroblaster (MEF) til anticancer-midler – såsom doxorubicin eller histondeacetylaseinhibitorer – også førte til øget phosphorylering af eIF2α, omend en vedvarende snarere end en transient on [25,26]. I disse undersøgelser modificerede MEF bærer de ikke-phosphorylatable eIF2α A /A-mutationer viste højere følsomhed over for narkotika end deres S /S vildtype modstykker, der fører til den konklusion, at lægemiddel-induceret stigning i eIF2α fosforylering er beskyttende mod celledød. Men mens stramt reguleret fosforylering af eIF2α kan være beskyttende, kan en overdreven og vedvarende eIF2α fosforylering være så skadelig som den samlede ophævelse. Faktisk er det blevet bemærket, at mens stramt reguleret phosphorylering af eIF2α er nødvendig for korrekt fosterudvikling, en mangel i phosphorylerede eIF2α signalering, grundet homozygositet for eIF2α A /A såvel som overdreven phosphorylering er resultatet af en knockout af CREP, en mutation, fører til hæmning af eIF2α dephosphorylering, er forbundet med føtal anæmi og vækstretardering [22]. Også mutation i PERK og inhibering af eIF2α phosphorylering resulterer i beta-celler død og Wolcott-Rallison syndrom og tilsvarende overdreven eIF2α phosphorylering i TSC muterede celler efter eksponering til ER stressor inhiberer ekspression af stressinduceret transkriptom fører til celledød [24] .

Vores undersøgelser implicerer vedvarende og overdreven eIF2α fosforylering i hæmning af DNA-reparation, udvikling af alderdom og nedsat udtryk for en overflade markør forbundet med kapacitet til selv fornyelse, hvilket giver et rationale for association med øget følsomhed over for anti- neoplastiske behandlinger såsom ioniserende stråling og histondeacetylaseinhibitorer (HDACi). Vores resultater tyder på, at udviklingen af ​​lægemidler, der øger eIF2α fosforylering kan give yderligere midler for at øge følsomheden over for etablerede antineoplastiske behandlinger og /eller omgå resistens over for lægemidler, der er målrettet opstrøms dele af PI3K-Akt-mTOR pathway.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur

MCF-7 og MDA-MB-231 brystkræft cellelinier, fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) blev udpladet ved en densitet på 4 · 10

3 per cm

2 og vedligeholdes som beskrevet før [27]. Celler blev bestrålet 48 timer efter udpladning på en Cs

137 strålerøret (Gammacell 1000 Elite /3000 Elan) ved en dosis på 475 cGy /minut eller i X-ray strålerøret (Polaris sc-500 serie II) i en dosis på 100 cGy /minut. Rapamycin, Vorinostat (LC laboratorier, Boston, MA), Ku-0.063.794 (Selleck, Houston, TX) og salubrinal (Calbiochem-Merck4Biosciences, Tyskland) blev tilsat til kulturerne fra stamopløsninger i dimethylsulfoxid (DMSO). Kontrolkulturer modtog lige store mængder af køretøjet. koncentration DMSO i mediet ikke overstige 0,08%. Lægemidler blev tilsat til kulturen umiddelbart efter stråling.

Colony overlevelse assay

Plating for kolonioverlevelse assay kolonitælling, og beregning af overlevende andel blev udført i triplikater som tidligere beskrevet [28]. Medmindre andet er angivet, blev kolonier fikseret, farvet og talt 8-10 dage efter udpladning, når 90-95% af kolonierne i kontrol besidder mere end 50 celler. Den teoretiske additiv virkning, af kombinerede antineoplastiske behandlinger, cell-overlevelse blev beregnet efter følgende formel: 100 x SFa x SFb (SFA = overlevende fraktion af celler behandlet med agent «a ‘; SFb = overlevende fraktion af celler behandlet med agent ‘b’). En eksperimentelt bestemt overlevende fraktion, der er lavere end den beregnede man indikerer, at de to midler har en forbedret snarere end en additiv inhibitorisk virkning på celleoverlevelse. Den underliggende antagelse af denne ligning er, at agenterne handle uafhængigt af hinanden inden for samme population. Den cellulære fraktion i procent, der ikke overlever behandling (IF)% er lig med: [1-overlevende fraktion] x100 og den teoretiske additiv inhiberende virkning af midler a og b på størrelsen af ​​dræbte cellulær fraktion i procent – (IFAB)% er lig med [29]: 100 x [1- (1-Ia /100) x (1-Ib /100)] = 100 x (1-SFa x SFb).

Western blotting-analyse

Fremstilling af cellelysater og analyse af behandlingsrelaterede inducerede ændringer i proteinniveau og phosphorylering blev udført som beskrevet før [27] med mindre modifikation. Proteinindhold blev bestemt med et bicinchoninsyre reagens (Bio-Rad, Hercules, CA), og lige belastning blev verificeret ved måling af absorbansen ved 520 nm af Ponceau S (Sigma, St-Louis, MO) ekstraheret med PBS fra individuelle strimler af en twin løb. Blots blev udsat til x-ray film til kemiluminescens efter behandling med West Pico ECL reagens (Thermo Scientific Rockford, IL). Værdier for integreret lys tæthed af autoradiogrammer blev opnået med Image J NIH software og blev anvendt til bestemmelse af behandlingsrelaterede inducerede ændringer i proteinniveauer og i forholdet af phosphoryleret eIF2α (p-eIF2α) til det samlede niveau af proteinet. Kaniner antistoffer, der genkender enten p-eIF2α eller begge de phosphorylerede og ikke-phosphorylerede eIF2α var fra cellesignalering Technologies (Boston, MA) og antistoffer til BRCA1 (klon D9) og CD2 var fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX)

Karakterisering af epitelial antigen (ESA) ekspression ved FACS-analyse

Kontrol og salubrinal behandlede celler blev løsnet med ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning (Sigma, Israel), inkuberet med humant serum og FcR blokerende reagens og derefter med fluorescerende isothiocyanat (FITC) -anti-ESA eller med isotypekontrol (Miltenyi Biotec, Tyskland). 7-aminoactinomycin D (7AAD, eBiosciences, San Diego, CA) tjente som viabilitetsfarvestoffet. Påvisning af cellefarvning blev udført ved FACSCalibur hjælp Quest software (BD Biosciences, San Jose, CA) som beskrevet af Keshet et al. til farvning af overfladen MDR1 [30].

Farvning for sure β-Galacotosidase

Cellefarvning kit fra Cell Signaling Technologies blev brugt til cellefarvning og mikrofotografier af farvede celler blev opnået med Nikon TS100 Eclipse omvendt mikroskop og Nikon DS kamera. Salg

Analyser for DNA-reparation

Ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ) reparation blev analyseret i HeLa-celler og homolog rekombination reparation (HRR) blev analyseret i U2OS celler stabilt transficeret med pEJSSA og PDR-GFP henholdsvis [31,32]. Den HeLa [33,34] celler var en gave fra Dr. Dahm-Daphi Universitet Hamburg og U2OS var en gave fra Dr. Scully, Harvard Medical School [32,34]. Assayet blev udført i det væsentlige som beskrevet af Moyal et al. og Seluanov et al. [34,35], bortset fra at cellerne blev behandlet med 4,5 pM salubrinal 6 timer før transfektion med plasmider, der udtrykker I-Scel (eller tom vektor i kontroller). Til måling af NHEJ, celler co-transficeret med I-Scel udtrykkende vektor og pDsRed2-N1 i et forhold på 10: 1. Transfektion blev udført med LT1 DNA transfektionsreagens (Mirus Bio LLC.) Ifølge producentens instruktioner. Parallel, vildtype GFP og dsRed udtrykkende celler såvel som negative kontroller blev anvendt til FACS kalibrering (justering spænding og farve kompensation). NHEJ-aktivitet blev fulgt på den noterede tid efter transfektion med I-Scel ved at overvåge GFP-ekspression i dsRed udtrykkende celler. Påvisning blev udført ved FACSCalibur på 50.000 begivenheder pr prøve. Til bestemmelse af HR-aktivitet den del af I-Scel afhængige GFP-udtrykkende celler blev divideret med transfektionseffektiviteten i disse celler som beskrevet af Moyal et al. [34]. Under vores forsøgsbetingelser, virkningen af ​​salubrinal på den gennemsnitlige fluorescensintensitet i GFP-udtrykkende celler var altid mindre end 10%, hvilket indikerer, at de anførte virkning salubrinal på DNA-reparation ikke resulterer fra inhibering af translation. Som vist i tabel S1 i File S1, salubrinal ændrede ikke cellecyklusfordeling af U2OS celler indikerer, at den inhibitoriske virkning af salubrinal på HRR aktivitet efter transfektion med I-Scel skyldes direkte inhibering af reparation og ikke fra en effekt på fraktionen af ​​celler i S-fase.

Transfektion af celler med plasmider, der koder for eIF2α varianter

heIF2α S51A og heIF2α S51D i pcDNA3.CD2 [36,37] var en gave fra Dr. Ron laboratorium New York, NY. Forbigående transfektion blev udført med JetPei (POLYPLUS, New York, NY) i henhold til producentens anvisninger. Når transfektion blev udført i 10 cm dyrkningsskåle – 10 ug plasmider blev inkuberet i 6 ml vækstmedium uden antibiotika i 24 timer før tilsætning af 4 ml medium og fortsætter med forsøgsprotokollen. Når transfektion blev udført i 6 brønd skåle blev de konstaterede mængder af plasmider inkuberet i 2 ml vækstmedium uden antibiotika i 24 timer før tilsætning af 0,5 ml medium og fortsætter med forsøgsprotokollen. Ekspression af reporter-protein blev overvåget i Western blots med anti-CD2.

Statistisk analyse

Uparret Student

t

test eller en prøve

t

test efter logaritmisk transformation var ansat til statistisk analyse.

s

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater Salg

Det er tidligere blevet påvist, at østrogenafhængige MCF-7 brystcancerceller er meget følsomme over rapamycin (IC

50 – ~ 10 nM). . I modsætning hertil tredobbelte negative MDA-MB-231 er ufølsomme over for lægemidlet (IC

50 -5900 nM) [38] på grund af forholdsvis høje phosphatidinsyre, der konkurrerer med rapalogues om binding til FRB domæne [9] . Vore resultater viser også, at mens i MCF-7 celler rapamycin inducerer klonogene ihjel med en IC

50 ~ 50 nM, i koncentrationer MDA-MB-231-celler op til 2 uM påvirkede ikke signifikant celleoverlevelse (tabel S2 i fil S1).

eIF2α er en downstream mål for rapamycin og bestråling

Hos nM koncentrationer rapamycin ført til øget fosforylering af eIF2α som var meget mere udtalt i MCF-7 end i MDA-MB-231 (figur 1 ab). Ioniserende stråling, på den anden side steg eIF2α phosphorylering i både MCF-7- og MDA-MB-231 (figur 2 A-C) celler. I MDA-MB-231 celler øget p-eIF2α samt øget andel af p-eIF2α til eIF2α blev opretholdt gennem 48 timer efter bestråling. I nogle eksperimenter en nedgang i det samlede niveau af eIF2α i bestrålede celler blev imidlertid bemærket denne forskel var ikke statistisk signifikant. I MCF-7-celler niveauet p-eIF2α samt at af det samlede niveau af eIF2α faldt betydeligt med 48 timer efter bestråling, men den forhøjede forhold mellem p-eIF2α at eIF2α opnås ved 24 timer efter bestråling blev opretholdt.

a. Celler blev inkuberet i 24 timer med 50 nM rapamycin, høstet og forarbejdet til bestemmelse af ændringer i eIF2α phosphorylering B. Middelværdi ± SEM fold ændring i forhold til kontrollen med eIF2α (e), p-eIF2α (p) og forholdet p-eIF2α /eIF2α (p /e) i rapamycin-behandlede celler. Analysen betegner 6 separate bestemmelser for MCF-7-celler og 3 for MDA-MB-231-celler. * Angiver væsentlig ændring i forhold til kontrol –

s

0.05.

a. MCF-7 b. MDA-MB-231-celler blev bestrålet med det anførte strålingsdosis og forarbejdet til analyse af eIF2α phosphorylering på den anførte tidspunkt efter bestråling. c. Middelværdi ± SEM af fold ændring i forhold til kontrollen med eIF2alpha (e), p-eIF2α (p) og forholdet mellem p-eIF2α /eIF2α (p /e) i bestrålede MCF-7 og MDA-MB-231-celler. Analyse for MCF-7 ved 24 timer efter bestråling med 1,5 og 9,5 Gy repræsenterer 2 og 3 separate bestemmelser henholdsvis og efter 48 timer 3 separate bestemmelser for hver dosis. Analyse for MDA-MB-231-celler efter 24 timer repræsenterer 3 bestemmelser for hver dosis og ved 48 timer 5 Bestemmelse i 1,5 Gy og 6 til 9,5 Gy. * Angiver væsentlig ændring i forhold til kontrol –

s

0.05

Øget fosforylering af eIF2α er til skade for celleoverlevelse

For at bestemme relevansen af ​​øget eIF2α fosforylering til celle overlevelse vi behandlet MDA-MB-231 celler med salubrinal -. En inhibitor af eIF2α defosforylering. Salubrinal førte til en dosisafhængig stigning af eIF2α phosphorylering, der var forbundet med øget klonogene død (figur 3 a, b; Tabel 1). Ved at kombinere behandling af salubrinal – i en koncentration, der ikke påvirker celle overlevelse (4,5 uM) – og stråling ført til øget fosforylering af eIF2α der var forbundet med øget klonogene død (Figur 3 c, d, Tabel 2, Tabel S3 i File S1) . Interessant nok i celler, der modtog kombineret behandling af 4,5 uM salubrinal og 1,5 Gy, phosphorylering af eIF2α var svarede til den opnåede i celler behandlet med salubrinal alene, hvilket antyder, at bestrålede celler er mere modtagelige for forøget eIF2α phosphorylering end ikke-bestrålede celler. Forbedret følsomhed over for stråling blev også bemærket i salubrinal behandlet MCF-7 celler (tabel S4 i File S1).

a. Celler blev bearbejdet til analyse af eIF2α phosphorylering 48 timer efter tilsætning af salubrinal (Sal). b. Middelværdi ± SEM fold ændring i forhold til kontrollen med eIF2α (e), p-eIF2α (p) og forholdet p-eIF2α /eIF2α (p /e) i salubrinal (SAL) behandlede celler. Forsøget blev gentaget 3 gange i 4,5 um og to gange i 16 uM. * Angiver væsentlig ændring i forhold til kontrol – P. 0,05

c. Celler blev bestrålet med den noterede strålingsdosis før tilsætning af 4,5 uM Salubrinal (Sal). d. Mean fold ændring i forhold til kontrollen med eIF2α (e), p-eIF2α (p) og forholdet p eIF2α /eIF2α (p /e) .Den eksperiment blev gengivet gang med lignende resultater (Værdier for e, p og p /e fra begge eksperimenter er vist i tabel S3 i File S1).

Salubrinal (uM)

IF (%)

00 ± 0.64.50 ± 5938 ± 216.5100Table 1. Salubrinal inducerer dosisafhængig klonogene død.

MDA-MB-231 celler udpladet og behandlet til klongenicitetsassayet. Tal er IF (%) ± SEM af tredobbelte prøver. Effekten af ​​salubrinal på celledød på 9 og 16,5 uM var signifikant (

s

0,05). CSV Hent CSV Gy

-Sal IF (%)

+ Sal IF (%)

Calculated Additive

00 ± 10 ± 313 ± 0,38 ± 2.631.517 ± 0,630 ± 1.6172.548 ± 166 ± 2.648Table 2. Salubrinal forbedrer klonogenisk celledød i bestrålede celler.

MDA-MB-231 celler blev udpladet for klonogene overlevelse assay. Salubrinal (Sal) (4,5 pM) blev tilsat til cellerne umiddelbart efter bestråling. Tal er middel IF (%) ± SEM af tredobbelte prøver fra et repræsentativt eksperiment, der er gengivet to gange med lignende resultater. Teoretisk additiv effekt af salubrinal og stråling på størrelsen af ​​dræbte cellulære fraktion præsenteres under ‘beregnet tilsætningsstof «. Effekten af ​​salubrinal på øget klonogene død inden for 1,5 Gy og 2,5 Gy stråling grupper var signifikant (

s

0,05). CSV download CSV

Svarende til effekten af ​​salubrinal, transient transfektion med phosphomimetic eIF2α S51D variant faldt – i et plasmid-dosisafhængig måde – klonogene overlevelse i forhold til den observeret i celler transficeret med den ikke-phosphorylatable S51A variant. Ved høje plasmidkoncentrationer (figur 4 a) overlevelse af celler, der udtrykker phosphomimetic variant var lavere end den for celler, der udtrykker den ikke-phosphorylatable variant. Men ved en lavere plasmid koncentration eIF2α S51D ikke påvirkede overlevelse i forhold til eIF2α S51A (figur 4 b), men ført til øget klonogene død i bestrålede celler (figur 4 C, tabel 3). Under vores forsøgsbetingelser strålingsinduceret stigning i phosphorylering af endogent eIF2α var ens i eIF2α S51A og eIF2α S51D udtrykkende celler (fig S1), hvilket indikerer, at i lighed med salubrinal den skadelige virkning forårsaget af ekspression af eIF2α S51D resultater fra en forøget cellulær niveau af hæmmede eIF2α dvs. eIF2α S51D og phosphoryleret endogent protein.

a. Celler transficeret med 2 pg /2ml eIF2α S51A (SA) eller med eIF2α S51D (SD) blev bearbejdet til analyse 17 dage post-plating. Ved denne koncentration SD faldt klonogene overlevelse. b, c. Celler transficeret med 1.5μg /2ml SA eller med SD. Celler i B blev ikke bestrålet mens celler i c blev bestrålet med 1,5 Gy 24 timer efter transfektion. Celler i b og c blev forarbejdet til analyse 10 dage efter bestråling. På denne koncentration SD alene påvirkede ikke klonogen overlevelse, men gjorde øge følsomheden for stråling. Forsøget blev gentaget en gang med lignende resultater.

SA IF (%)

SA + 1,5 Gy IF (%)

SD IF (%)

SD + 1,5 Gy IF (%)

0 ± 348 ± 0,50 ± 462 ± 1.5Table 3. phosphomimetic eIF2α variant stiger klonogene død i bestrålede celler.

celler blev transficeret med 1.5μg /2ml eIF2α S51A eller eIF2α S51D. Bestråling med 1,5 Gy fandt sted 24 timer senere. Kolonier blev forarbejdet til analyse 10 dage efter bestråling. Tal er middel IF (%) fra tredobbelte prøver ± SEM. Forsøget blev gentaget en gang med lignende resultater. Forskelle mellem kontrol- og bestrålede grupper samt mellem de to grupper af bestrålede varianter var signifikant

s

0,05. SA – ikke-phosphorylatable eIF2α, S51A, SD – phosphomimetic eIF2α S51D. CSV Hent CSV

Salubrinal påvirker ekspressionen af ​​overfladen ESA

Det er blevet rapporteret, at tumorigene brystkræft stamceller er beriget med en sub-population af celler, der udtrykker CD

44 + /CD

24 – /lav /ESA

+ på deres overflade [39], og at en delpopulation udtrykker en lignende kombination af celle-overflademarkører er blevet identificeret i brystkræft cellelinier (såsom MDA-MB-231), og har vist sig at besidde høj kapacitet for selvfornyelse og tumorinitiering [40]. Fordi over 90% af MDA-MB-231 celler er CD

44 + /CD

24- /lav, sortering til celleoverfladen ESA ekspression i disse celler kan tjene som en indikator for ændringer i størrelsen af ​​cellulær fraktion med selvstændige fornyelse kapacitet [40]. Som bemærket i figur 5, behandling af cellerne med salubrinal nedsat ekspression af ESA på cellernes overflade, hvilket antyder, at den skadelige virkning af overdreven eIF2α phosphorylering kan formindske deres evne til selvfornyelse.

Celler blev inkuberet med 24 pM salubrinal i 96 timer før høst blev Cellefarvning med FITC-anti-ESA eller med isotype-matchede kontroller detekteret med FACSCalibur. Eksperimentet blev gentaget to gange med lignende resultater. 7AAD – levedygtighed farvestof, FITC -. Anti-ESA

Salubrinal inducerer ældning i brystkræftceller

Kolonier af bestrålet og salubrinal behandlede celler indeholder udvidet og ældede udseende celler. Vi tælles disse celler i kolonier dannet efter eksponering for 1 Gy, til 4,5 uM salubrinal til kombinationen af ​​stråling og salubrinal og i ubehandlede kontroller. Interessant, selvom kombineret behandling af 4,5 uM salubrinal og en Gy ikke føre til øget klonogene død (tabel 2) det førte til øget forekomst af ældede udseende celler (figur 6). Farvning af sure β-Galacotosidase viste, at disse store celler udtrykker enzymet angiver, at faktisk salubrinal forbedrer senescens i bestrålede celler (figur 6).

Celler blev udpladet for kolonioverlevelse assay. Salubrinal (4,5 uM) eller køretøjet blev tilføjet umiddelbart efter stråling med en Gy. Sure β-galactosidaseaktivitet afspejles i blåsplint. Tal er gennemsnit af aldrende leder celler /koloni ± SD i tredobbelte plader og forskelle mellem de kombinerede behandlinger og hver enkelt af de eneste behandlinger samt mellem hver behandling og kontrol var statistisk signifikant

s

0,05. Bar, 100 uM.

Øget eIF2α fosforylering modulerer DNA-reparation

Stråling ført til øget niveau af BRCA1, et protein, der deltager i DNA-reparation efter stråleskader [41]. Stigningen i BRCA1 blev ophævet ved salubrinal og ved forbigående ekspression af phosphomimetic eIF2α S51D antyder, at overdreven eIF2α phosphorylering modulerer DNA-skade reparation (figur 7). Faktisk eksperimenter med HeLa-celler og U2OS celler, der udtrykker reporter plasmider til NHEJ og HRR viste henholdsvis at salubrinal inhiberede reparation af I-Scel-induceret DSB via begge mekanismer (figur 8).

Overpanel: Kontrol og bestrålede celler (1,5 Gy) blev behandlet med 4,5 pM salubrinal eller køretøjet. Celler blev høstet 48 timer efter bestråling og bearbejdet til western blot analyse af ændringer i niveauet af BRCA1.

Lower paneler: Celler transficeret med 10 ug /ml af S51A og S51D eIF2α varianter eller med transfektionsreagenser alene (SHAM). Celler blev bestrålet med 9,5 Gy 24 timer efter transfektion og bearbejdet til BRCA1 analyse 24 timer efter stråling. CD2 blev udtrykt i transficerede celler indikerer en vellykket transfektion. Sal – 4,5 uM salubrinal.

a. Måling af NHEJ aktivitet blev udført 24 timer efter transfektion med I-Scel. Forsøget blev gentaget en gang med lignende resultater dvs. 4% reparation aktivitet til kontrol og 3% for salubrinal behandlede celler. b. Måling af HR-aktivitet blev udført 36 timer efter transfektion med I-Scel. Forsøget blev gentaget en gang med lignende resultater dvs. 2,35% aktivitet til kontrol og 1,6% aktivitet for salubrinal behandlede celler ved 24 timer efter transfektion med I-Scel. Sal -. 4,5 uM salubrinal

Øget og vedvarende fosforylering påvirker respons brystkræftceller til Vorinostat

Ligesom stråling, den HDACi – Vorinostat fører også til øget eIF2α fosforylering. Denne stigning har været tænkt som et gennemsnit af cellulær beskyttelse mod skader [26]. Imidlertid kombinerer lave koncentrationer af salubrinal og Vorinostat, ved koncentrationer, der hver for sig næppe påvirker eIF2α phosphorylering, resulterede i øget phosphorylering af eIF2α, som endnu engang var forbundet med øget klonogene død (figur 9, tabel 4, tabel S5 i File S1).

a. Celler blev høstet 48 timer efter anvendelse af køretøjet (D), 4,5 uM salubrinal (S), 0,75 uM Vorinostat (V) eller begge (V + S) og behandlet til Western blot analyse af eIF2α fosforylering. b. Mean fold ændring i forhold til kontrol af eIF2α (e), peIF2α (p) og af forholdet peIF2α /eIF2α (p /e). b.