PLoS ONE: 3′-Deoxy-3 ‘- [18F] fluorthymidin PET Imaging Afspejler PI3K-mTOR-medieret Pro-Survival Reaktion på målrettet terapi i kolorektal cancer

Abstrakte

Biomarkører, der forudsiger respons på målrettet terapi i onkologi er en væsentlig bestanddel af skræddersyet medicin. I prækliniske behandling respons undersøgelser, der fremhævede modeller af vildtype

KRAS

eller mutant

BRAF

kolorektal cancer behandlet med enten cetuximab eller vemurafenib henholdsvis vi illustrere, at [

18F] -FLT PET, en non-invasiv molekylær billeddannelse udlæsning af thymidin bjærgning, nøje afspejler pro-overlevelse responser på målrettet terapi, der medieres af PI3K-mTOR aktivitet. Aktivering af pro-overlevelsesmekanismer danner grundlag for talrige former for resistens. Konkluderer vi derfor, at [

18F] -FLT PET kan tjene en roman og potentielt afgørende rolle at forudsige tumorer, der udviser molekylære funktioner, der har tendens til at afspejle vrangvillighed at MAPK målrettede terapi. Selv om disse undersøgelser fokuserede på kolorektal cancer, vi forestiller, at resultaterne kan anvendes på andre solide tumorer samt

Henvisning:. McKinley ET, Zhao P, Coffey RJ, Washington MK, Manning HC (2014) 3 ‘ -Deoxy-3 ‘- [

18F] fluorthymidin PET Imaging Afspejler PI3K-mTOR-medieret Pro-Survival reaktion på målrettet terapi i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (9): e108193. doi: 10,1371 /journal.pone.0108193

Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA

Modtaget: 24. februar, 2014 Accepteret: August 24, 2014; Udgivet: 23 September, 2014

Copyright: © 2014 McKinley et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningsmidler : R25 CA136440, K25 CA127349, P50 CA128323, P50 CA095103, R25 CA092043, R01 CA140628, RC1 CA145138, R01 CA046413, P30 DK058404, The Kleberg Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

med øget evne til hurtigt og billigt karakterisere det genetiske grundlag af en individuel patients tumor, er personlige terapier hurtigt bliver udbredt i onkologi. Landmark eksempler på succes skræddersyet medicin i onkologi omfatter anvendelse af vemurafenib at behandle

V600EBRAF

melanom [1] og trastuzumab at behandle

HER2

overudtrykkende brystcancer [2]. Med en stigende afhængighed af molekylært målrettede behandlinger, er der stadig en lige så kritisk udfordring at udvikle og validere specifikke biomarkører, der afspejler målet hæmning, pathway inaktivering, og forudsige overordnede kliniske respons. De fleste biomarkører udnyttes i onkologi studier kræver væv sampling, som er meget modtagelige for prøveudtagning fejl og fordomme på grund af heterogenitet. Serumbaserede biomarkører mangler evnen til direkte at visualisere tumoren og viser, at den målte effekt er direkte resultat af tumorrespons. Ikke-invasiv billeddannelse omgår disse begrænsninger og giver store fordele i forhold til traditionelle biomarkører. Af de billeddiagnostiske modaliteter tilgængelige klinisk, følsomheden og evnen til let at producere biologisk aktive molekyler bærer positron-emitterende isotoper gør positronemissionstomografi (PET) en af ​​de mest attraktive modaliteter til påvisning af tumorer og profilering biologiske reaktioner på behandlingen.

Vores laboratorium har studeret det biologiske grundlag af 3′-deoxy-3 ‘[18F] fluorthymidin ([

18F] -FLT) ophobning i tumorer [3] – [6] og andet sygt væv [7]. Et thymidin-analog, [

18F] -FLT blev oprindeligt udviklet til at tjene som en ikke-invasiv måling af cellulær proliferation, med indlysende nytte i onkologi [8], [9] ved at rapportere om thymidin frelsesyntesevejen der giver DNA-forstadier til delende celler. Efter cellulær internalisering, [

18F] -FLT phosphoryleres i en reaktion katalyseret af det cytosoliske enzym thymidinkinase 1 (TK1) og fanget i cellen. TK1 aktivitet er tæt korreleret med DNA-syntese og har en tendens til at blive formindsket i hvilende celler. [

18F] -FLT er blevet bredt undersøgt som en markør for behandling respons i et spektrum af tumor typer og behandlinger både i prækliniske og kliniske indstillinger [10]. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at i modsætning til mere generalisere proliferationsmarkører, såsom Ki67, [

18F] -FLT PET afspejler proliferative indeks til variable og potentielt upålidelige udstrækninger [6], [11]. [

18F] -FLT-PET kan ikke diskriminere moderat proliferativ, thymidin bjærgning-drevne tumorer fra dem af højt proliferative tumorer, der er afhængige primært på

de novo

thymidin syntese. På trods af en manglende sammenhæng med spredning i nogle tilfælde, vi forestillede at TK1 niveauer, og dermed [

18F] -FLT PET, kan afspejle andre potentielt vigtige molekylære begivenheder forbundet med respons på behandlingen.

Brug præklinisk modeller af kolorektal cancer viser vi to omstændigheder, hvor [

18F] -FLT PET ikke korrelerer med proliferation, men snarere afspejler PI3K-mTOR medieret pro-overlevelse reaktioner på målrettet terapi. I disse indstillinger, [

18F] -FLT PET var diskordante 2-deoxy-2 – [

18F] fluor-D-glucose ([

18F] -FDG) PET, den mest anvendte sporstof i klinisk onkologi, som ikke var følsom over for mTOR- eller PI3K-pathway aktivitet. Cetuximab medieret hæmning af MAPK aktivitet i en vildtype

KRAS

cellelinje model og vemurafenib-medieret hæmning af BRAF i en

V600EBRAF

mutant cellelinje model havde ingen effekt på [

18F] -FLT PET medmindre PI3K-mTOR blev efterfølgende svækket farmakologisk eller

via

genetiske lyddæmpning. Samlet set har disse undersøgelser viser en ny rolle for [

18F] -FLT PET som et middel til at forudsige tumorer, der modstår MAPK hæmning gennem PI3K-mTOR aktivering i kolorektal cancer og potentielt andre solide tumorer.

Materialer og Metoder

cellelinjer og musemodeller

alle undersøgelser blev godkendt af Vanderbilt University Institutional Animal Care og brug Udvalg og blev gjort alt for at minimere dyrenes lidelser. Difi humane celler var en gave fra Dr. Bruce Boman [12] og COLO 205 celler blev opnået fra ATCC (CCL-222). Difi humane colorektale cancerceller blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) og COLO 205 celler blev dyrket i RPMI (Cellgro) med 10% føtalt bovint serum, (Atlanta Biologicals), 1% penicillin og streptomycin (GIBCO) ved 37 ° C og 5% CO

2. C225 blev opnået fra Vanderbilt Pharmacy, blev PLX4032 og PLX4720 syntetiseret som beskrevet [13], PP242 blev opnået fra Sigma-Aldrich, og BEZ235 fra Selleck Chem. Stamopløsninger af hvert lægemiddel blev fremstillet og opdelt i prøver at opnå endelige medikamentkoncentrationer for

in vitro

studier.

For

in vivo

undersøgelser, cellelinje xenografter blev genereret i atymiske, nøgne mus (Harlan) som beskrevet [3] og behandling begyndte, da volumen nåede ca. 150 mm

3. Til behandling af Difi xenotransplantater, saltopløsningsbærer, 20 mg /kg, eller 40 mg /kg cetuximab blev administreret i.p. hver tredje dag. PET billeddannelse af Difi xenograft bærende mus blev udført 7 dage efter påbegyndelse af behandlingen, 24 timer efter den tredje behandling. For COLO 205 xenotransplantater blev mus behandlet med DMSO-vehikel, 60 mg /kg PLX4720, eller 40 mg /kg BEZ235 dagligt ved oral sondeernæring (100 pi totalvolumen). PET billeddannelse af COLO 205 xenograft bærer mus blev udført 4 dage efter påbegyndelse af behandlingen, cirka 24 timer efter den tredje behandling. Musene blev aflivet umiddelbart efter afslutningen af ​​PET billeddannelse.

siRNA metoder

Raptor (L-004.107-00) og tilfældig rækkefølge (D-001.810-01) siRNA reagenser blev opnået fra Thermo Scientific. siRNA blev transficeret ind Difi celler ved anvendelse af DharmaFect transfektion kit (Thermo Scientific) i henhold til producentens anvisninger. Kort sagt, blev 500.000 Difi celler udpladet i hver brønd i en 6-brønds plade. Efter 24 timer blev siRNA tilføjet til de relevante brønde. Efter 48 timer, saltopløsningsbærer, 0,5 ug /ml eller 5,0 ug /ml C225 blev tilsat til passende brønde. Efter yderligere 24 timer blev celler høstet til Western blotting og QRT-PCR som beskrevet nedenfor.

radioaktivt lægemiddel syntese

[

18F] -FLT blev fremstillet i et to-trins, one-pot reaktion, som beskrevet [4], [14]. [

18F] -FLT blev opnået med gennemsnitlige radiokemiske renhed på 98,3% og specifik aktivitet ≥345.5 TBq /mmol. [

18F] -FDG blev syntetiseret på Vanderbilt University Medical Center radiofarmaci og distribueret af PETNET. Den gennemsnitlige radiokemiske renhed af produktet var 98,5% og specifikke aktivitet var mere end 37 TBq /mmol.

Små dyr imaging

Små dyr PET-billeddannelse blev udført ved anvendelse af et dedikeret microPET scanner ( Concorde Microsystems Focus 220). Mus blev holdt under 2% isofluoran anæstesi i oxygen ved 2 L /min og holdes varme via en cirkulerende vand varmepude for varigheden af ​​PET-scanning. For [

18F] -FLT PET imaging dyr blev administreret 7.4-9.3 MBq (200-250 uCi) intravenøst. Dyr havde fri adgang til foder og vand under en 40 minutters optagelse tidsrum, efterfulgt af bedøvelse og en 20 minutters billedoptagelse. For [

18F] -FDG PET imaging, mus fastede i ca. 6 timer forud for billeddannelse og opvarmet i en opvarmet (31 ° C) kammer i 1 time forud for [

18F] -FDG injektion og under optagelse periode for at minimere brunt fedt optagelse af [

18F] -FDG. Musene blev administreret 7.4-9.3 MBq [

18F] -FDG intravenøst ​​og fri adgang til vand under en 50 minutters optagelse periode efterfulgt af en 10 min PET købet.

PET data blev rekonstrueret ved hjælp OSEM3D /KORT. De resulterende tredimensionelle rekonstruktioner havde en x-y voxel størrelse på 0,474 mm og afstanden mellem snittene af 0,796 mm. ASIPro software (Siemens) blev anvendt til manuelt at trække tredimensionale områder af interesse i tumorvolumen. Tumor prøver blev straks opsamlet efter [

18F] -FLT-PET og flash frosset i flydende nitrogen. [

18F] -FLT optagelse blev kvantificeret som procentdelen af ​​den injicerede dosis pr gram væv (% ID /g) ved at dividere ROI aktivitet ved den injicerede dosis og multiplicere med 100. Salg

Immunoblotting

in vitro

undersøgelser blev cellerne lyseret med CelLytic M (Sigma-Aldrich), centrifugeret ved 16.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C, og supernatanten fjernes før måling af proteinkoncentrationen ved bicinchoninsyre (BCA) assay (Thermo Scientific). For

in vivo

undersøgelser, frisk frosset væv blev homogeniseret i CelLytic MT (Sigma-Aldrich) lysepuffer, centrifugeret ved 16.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C, og supernatanten fjernes før måling af proteinkoncentrationen ved BCA- assay. Før beslutningen ved elektroforese, 20-40 ug protein fra hver prøve blev fyldt i 7,5 til 12% SDS PAGE geler og overført til PVDF-membraner (PerkinElmer). Membraner blev blokeret natten over ved 4 ° C i tris-bufret saltvand 0,1% Tween-20 (TBST) indeholdende 5% w /v fedtfri mælkepulver. Efterfølgende blev membranerne afhørt med antistoffer opnået fra Cell Signaling Technology medmindre noteret for at p-ERK 1/2 Thr202 /Tyr204 (# 4370), ERK 1/2 (# 4372), TK1 (Abcam, # 57.757), p27 (# 3686 ), p-AKT Ser473 (# 4060), p-AKT Thr308 (# 4056), AKT (# 4685), p-rpS6 Ser236 /236 (# 4858), rpS6 (# 2217), p-4EBP1 Thr37 /46 ( # 2855), p-MEK Ser217 /221 (# 9154), MEK (# 9126), DUSP6 (# 3058), β-actin (# 4970), β-tubulin (Novus Biologicals, # NB600-936). Membraner blev probet i 1 time ved stuetemperatur i TBST med 3% bovint serumalbumin (BSA). Membraner blev efterfølgende inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Jackson ImmunoResearch) fortyndet 1:5000 i TBST indeholdende 3% BSA. Western Lightning Plus-ECL (PerkinElmer) blev anvendt til kemiluminescens-detektion på en Xenogen IVIS 200.

Immunhistokemi (IHC)

Dyr blev aflivet, og tumor-prøver blev indsamlet umiddelbart efter PET-billeddannelse, så efterfølgende fikseret i 10% formalin i 24 timer. Væv blev derefter overført til 70% ethanol før paraffinindlejring. Væv blev snittet (5 um tykkelse) og farvet for p-rpS6 (Cell Signaling, # 4858, 1:100 primaerfortyndingen), p-AKT Ser473 (Cell Signaling, # 4060, 1:100 primaerfortyndingen), Ki67 (Dako, # M7240, 1:100 primaerfortyndingen), p27 (Dako, # M7203, 1:100 primaerfortyndingen). Kort beskrevet vævsprøverne blev de-paraffinized, rehydreret, og antigen-genvinding blev udført under anvendelse citratpuffer (pH 6,0) opløsning i 15 minutter ved 105 ° C efterfulgt af en 10 minutters bænk køle ned. Prøverne blev derefter behandlet med 3% hydrogenperoxid for at eliminere endogen peroxidaseaktivitet. Snittene blev derefter blokeret med et serum-frit protein blokerende reagens i 20 minutter. Primære detektionsantistof blev udført under anvendelse af følgende system: Vævssnittene blev inkuberet ved stuetemperatur i 60 minutter ved de angivne fortyndinger efterfulgt af en 30 minutters inkubation under anvendelse af Envision + System-HRP-mærket Polymer detektionsmetode (Dako, Carpinteria, CA). Farvning blev afsluttet efter inkubering med et 3,3′-diaminobenzidin-substrat-kromogen-opløsning. Væv objektglas blev afbildet ved 40x forstørrelse og manuelt scorede at bestemme procentdelen af ​​positive celler pr højstyrkefelt.

QRT-PCR

RNA blev opsamlet ved hjælp af RNeasy som foreslået af leverandøren (QIAGEN) . Både cDNA og realtime PCR-forsøg blev udført ved anvendelse af iScript cDNA-syntese kit og iQ SYBR Green Supermix (BIO-RAD) ved leverandør instruktion. Amplifikationer blev udført i en Bio-Rad CFX96 Real-Time systemet i 40 cykler. Data, blev overtaget af Bio-Rad CFX Manager-softwaren og fold ændringer blev analyseret som beskrevet af Schefe et al [15]. Menneskelig TK1 (5′-AATCAGCTGCATTAACCTGCCCAC-3 ‘frem, 5′-ATCACCAGGCACTTGTACTGAGCA-3′ omvendt), humant P27 (5’-AGCAATGCGCAGGAATAAGGAAGC-3 ‘frem, 5′-TACGTTTGACGTCTTCTGAGGCCA-3’ omvendt) blev opnået fra Integrated DNA Technologies.

Statistical Analysis

Statistisk signifikans af data blev evalueret ved brug af ikke-parametriske Wilcoxon Rank Sum (Mann-Whitney U) der benyttes de GraphPad Prism 4 software-pakke. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant, hvis p. 0,05

Resultater

Regulering af TK1 efter EGFR blokade i vildtype

KRAS

kolorektal kræftceller

Tidligere viste vi, at billeddannelse udlæsninger af EGFR belægning og apoptose, men ikke [

18F] -FLT PET, forudsagde reaktion på cetuximab i Difi cellelinje implanteret som udtrykker vildtype-KRAS og udviser EGFR forstærkning [3], [12] . Derfor, i denne undersøgelse, vi først søgte at belyse forholdet mellem EGFR blokade med cetuximab og TK1 regulering. Oprindeligt anvendte vi dyrkede Difi celler til at vurdere det tidsmæssige forhold mellem cetuximab eksponering og p-ERK, TK1, og p27 proteinniveauer over 24 timer (fig. 1a). Som forventet blev p-ERK-niveauer næsten øjeblikkeligt svækket, viser en dramatisk reduktion i den første time af cetuximab eksponering (5,0 mikrogram /ml), og den resterende godt under baseline niveau i op til 24 timer. Paradoksalt nok, TK1 stiger efter cetuximab eksponering, som toppede ved 12 timer, og derefter faldt hurtigt til under baseline niveauer. Proteinniveauer af cellecyklus-inhibitoren p27 steg dramatisk og nåede et plateau ved 12 timer. Det omvendte forhold mellem TK1 og p27 protein niveauer impliceret p27 som en afgørende faktor for TK1 regulering i Difi celler.

(A) Western blot af Difi cellelysater efter cetuximab eksponering (5 ug /ml) resulterede i hurtig dæmpning af downstream MAPK mål, herunder p-ERK, som forblev godt under baseline niveau til 24 timer. Paradoksalt TK1 proteinniveauer steg fra 1-12 timer, indtil p27 proteinniveauer steg, på hvilket tidspunkt TK1 faldt bellow baseline. (B) Difi celler behandlet med enten 0,5 ug /ml eller 5,0 ug /ml cetuximab resulterede i en reduktion på 50% og fuld dæmpning af p-ERK protein niveauer, henholdsvis efter 24 timer. Ved 0,5 ug /ml TK1 niveauer var upåvirket trods en beskeden stigning i p27-proteinniveauer. Imidlertid 5,0 ug /mL cetuximab resulterede i stærkt formindsket TK1 med en stor stigning i p27-proteinniveauer. PI3K-mTOR aktivitet, som målt ved p-AKT Ser473, p-rpS6, og p-4E-BP1, blev enten opretholdes eller forhøjet ved 0,5 ug /ml cetuximab men var svækket ved 5,0 ug /ml cetuximab. (C) QRT-PCR-analyse viste

TK1

mRNA blev signifikant reduceret ved 0,5 ug /ml (p = 0,0279) og 5,0 ug /ml (p = 0,0186), mens ingen ændring i

p27

mRNA-niveauer blev observeret ved nogen af ​​doserne. (D) Silencing mTORC1 lettet opregulering af p27 og svækket TK1 protein niveauer ved 0,5 mg /ml cetuximab uden at påvirke de anti-MAPK aktivitet effekter af cetuximab. Niveauer af p-AKT Ser473, p-rpS6, og p-4E-BP1 blev reduceret ved 0,5 ug /mL cetuximab eksponering med Raptor knockdown men ikke i scrambled siRNA kontrol. (E) Som bevis for funktionaliteten af ​​P27,

TK1

mRNA niveauer blev tilsvarende reduceret med 0,5 mikrogram /ml og 5,0 mg /ml med Raptor knockdown.

For yderligere at evaluere relationer mellem MAPK-vejen inhibering, TK1 regulering, og p27 blev Difi cellerne eksponeret for to koncentrationer (0,5 ug /ml og 5,0 ug /ml) af cetuximab i 24 timer (fig. 1b). Ved 0,5 ug /ml, TK1 proteinniveauer var upåvirket trods beskedent forhøjet p27 og en reduktion på ca. 50% af p-ERK og p-AKT Ser473. Omvendt 5,0 mikrogram /ml niveau af eksponering resulterede i dramatisk svækkede TK1 niveauer. Svarende til tidsforløbsundersøgelse, reduceret TK1 korreleret med en robust stigning i p27. Desuden blev fuldstændig dæmpning af p-ERK og p-ATK Ser473 observeret ved 5,0 ug /ml. I modsætning til protein,

TK1 mRNA

tendens til at følge p-ERK-niveauer mere direkte (Fig. 1C), hvilket ikke er overraskende i betragtning

TK1

‘s afhængighed af E2F transkription [16], et efterfølgende produkt af MAPK aktivitet. Interessant

p27

mRNA var upåvirket af cetuximab eksponering, hvilket antyder, at forhøjede P27 protein niveauer skyldtes inhibering af downstream mål, der påvirker posttranskriptionel modifikation af p27, med AKT typisk er en af ​​disse [17]. At afgøre, om TK1 protein niveauer observeret ved 0,5 mg /ml eksponeringsniveauer blev opretholdt gennem øget translationel effektivitet, vi målte p-rpS6 og p-4E-BP1 niveauer både produkter af pro-translationel PI3K-mTOR-aktivitet (fig. 1B) . Vi fandt p-rpS6 niveauer, der skal dæmpes kun ved den højeste koncentration af cetuximab. Desuden blev p-4E-BP1 niveauer forhøjet ved den lavere koncentration af cetuximab, hvilket tyder på øget potentiale for oversættelse på ribosomalt cap [18]. Taget sammen med de

TK1

mRNA-niveauer, kan disse resultater antyder, at translationel effektivitet TK1 på det lavere niveau af cetuximab eksponering, der sandsynligvis fortsætte gennem aktivering af mTOR.

Slukning mTOR-PI3K aktivitet letter cetuximab-medieret dæmpning af TK1 niveauer i Difi celler

for at udforske den rolle, mTOR på TK1 regulering i denne sammenhæng, vi tavshed mTOR hjælp siRNA til Raptor, et vigtigt medlem af den funktionelle mTOR Complex 1 (mTORC1) [ ,,,0],19]. I fravær af mTORC1 aktivitet, blev TK1 proteinniveauer svækket både 0,5 ug /ml og 5,0 ug /ml koncentrationer af cetuximab, uden en indlysende virkning på MAPK-vejen aktivitet (fig. 1D). Som forventet Raptor inaktivering resulteret i større cetuximab-medieret dæmpning af p-AKT Ser473 og p-rpS6 samt blokering phosphorylering af 4E-BP1. Ud svækkede TK1 protein niveauer, mTORC1 inaktivering resulterede i øgede p27 protein niveauer, der syntes at være i det mindste delvist ansvarlig for

TK1

transkriptionel regulering på det laveste niveau af cetuximab eksponering (fig. 1E). Interessant, som observeret tidligere, stigningen i P27 protein niveauer i sig selv ikke et produkt af øget

p27

transskription (fig. S1). Disse resultater antyder, mTOR aktivering bibringer sin virkning på TK1 til nedstrømseffektorer såsom AKT og ERK gennem post-translationel modifikation og nedbrydning af cellecyklusinhibitorer, herunder p27 [17]. Som bevis på dette, mTORC1 hæmning i forbindelse med EGFR blokade førte til en kraftig reduktion af TK1 protein niveauer ikke observerbare med cetuximab eksponering alene ved lavere koncentration.

[

18F] -FLT PET afspejler hæmning af PI3K-mTOR aktivitet i cetuximab behandlede Difi cellelinje implanteret

in vivo

Vi efterfølgende afbildet Difi xenograft-bærende mus med [

18F] -FLT PET efter cetuximab behandling (20 mg /kg eller 40 mg /kg) eller saltvand køretøj. Efter aftale med vores tidligere undersøgelser [3], tilsvarende [

18F] -FLT akkumulering blev observeret i xenotransplantater behandlet med køretøjet eller 20 mg /kg cetuximab. Forøgelse af dosisen af ​​cetuximab til 40 mg /kg resulterede i formindsket [

18F] -FLT akkumulering (fig. 2A). Formindskede TK1 proteinniveauer blev observeret ved 40 mg /kg dosis i forhold til optaget fra en bil og 20 mg /kg Cetuximabs-behandlede tumorer (fig. 2B). Svarende til

in vitro

studier, formindsket TK1 protein niveauer korreleret med forhøjet p27 protein, men ikke

p27

mRNA-niveauer (fig. S2). Derudover blev p-AKT Ser473 tumor proteinniveauer forøges ved /kg dosis 20 mg sammenlignet med både køretøjet og 40 mg /kg cetuximab. TK1 protein niveauer var upåvirket af lavere dosis af cetuximab trods væsentligt reduceret

TK1

mRNA (Fig. 2C), som blev reduceret i forhold til bærerbehandlede kontroller på begge niveauer af cetuximab eksponering. IHC of imaging-matchede xenograft væv illustrerede, at PI3K-mTOR aktivitet, som målt ved p-rpS6 og p-AKT Ser473 niveauer, blev inhiberet på højeste cetuximab eksponering (fig. 2D, fig. S3). Interessant, Ki67 blev reduceret på begge niveauer af cetuximab eksponering (Fig 2D, fig. S4), hvilket tyder på, at [

18F] -FLT PET blev afkoblet fra standard mål for spredning i den lavere dosis. Mens [

18F] -FLT PET viste sig at være følsomme over for PI3K-mTOR aktivitet, [

18F] -FDG PET imaging var ikke følsom over for dette fænomen. Vi observerede reduceret [

18F] -FDG optagelse i forhold til kontrol af køretøjer på begge niveauer af cetuximab eksponering (Fig. S5). Samlet set har disse resultater antyder, at [

18F] -FLT PET giver unik information om mTOR signalering, der ikke er fanget af [

18F] -FDG PET eller standard mål for spredning, såsom Ki67 IHC.

Difi tumorxenografter blev afbildet på dag 7 af 20 mg /kg eller 40 mg /kg Cetuximabs behandlingsregimer. (A) [

18F] -FLT PET blev kun reduceret i Difi xenotransplantater behandlet med 40 mg /kg (p = 0,0012). (B) Western blot-analyse af væv høstet umiddelbart efter billeddannelse bekræftede, at TK1 proteinniveauer først blev reduceret ved 40 mg /kg dosisniveau. Øget P27 protein niveauer blev observeret ved de 40 mg /kg dosisniveauer. Forøgede p-AKT Ser473 proteinniveauer blev observeret ved 20 mg /kg dosisniveau. (C) Svarende til

in vitro

observationer,

TK1

mRNA blev reduceret signifikant ved både 20 mg /kg (p = 0,0009) og 40 mg /kg (p = 0,0001) dosis-niveauer. (D) IHC-analyse af p-rpS6 og p-AKT Ser473 viste lidt forhøjet farvende niveauer ved 20 mg /kg. Imidlertid blev begge mærker stærkt reduceret ved 40 mg /kg. Ki67 immunoreaktivitet blev reduceret på begge niveauer af cetuximab eksponering.

TK1 protein niveauer afspejler ikke

V600EBRAF hæmning i COLO 205 celler

Analogt til Difi model behandlet med cetuximab, vi evaluerede relationer mellem mål hæmning, nedstrømseffektorer, og TK1 niveauer i en

V600EBRAF udtrykkende cellelinie, COLO 205, behandlet med en selektiv

V600EBRAF inhibitor (fig. 3). PLX4032 eksponering i 48 timer førte til koncentrationsafhængig inhibering af p-MEK niveauer. Paradoksalt nok blev p-ERK-niveauer steg i en koncentrationsafhængig måde, undtagen ved den højeste dosis (5 uM) (fig. 3A). Misforholdet mellem p-MEK og p-ERK blev ikke observeret ved eksponering varigheder af 2 timer (fig. S6) eller 24 timer (fig. S7). Mens p-AKT Ser473 niveauer blev kun moderat reduceret med PLX4032 eksponering ved 48 timer, observerede vi en koncentrationsafhængig forøgelse i p-rpS6 der korreleret med stigningen i p-ERK. Samtidigt øget p-rpS6 og formindskede DUSP6 niveauer foreslog, at stigningen i p-ERK var i det mindste delvis skyldes formindsket fosfatase aktivitet, der var sandsynligvis relateret til mTOR aktivering [20]. PLX4032 eksponering førte til en beskeden stigning i p27 protein niveauer. TK1 niveauer blev forøget lidt ved lavere koncentrationer PLX4032 og uændret i forhold til køretøjet ved højere eksponeringsniveauer, bortset fra det højeste koncentration (5 uM). Overraskende,

TK1

mRNA-niveauer syntes at være mere tæt forbundet med hæmning af p-MEK og i modsætning TK1 protein niveauer, blev reduceret i en i det væsentlige koncentrationsafhængig måde (fig. 3B).

COLO 205 celler blev opsamlet 48 timers PLX 4032 eksponering ved 10 nM, 100 nM, 500 nM, 1 uM eller 5 uM. (A) Western blot-analyse viste target inhibering af p-MEK trods forøgede p-ERK-niveauer. PI3K-mTOR signalering blev forhøjet i en PLX 4032-afhængig måde som udvises af en støt stigning i p-rpS6 niveauer. ERK-phosphatase DUSP6 faldt sammen med mTOR signalering og var omvendt proportional med p-ERK-niveauer. En mindre stigning i P27 niveauer blev observeret samtidig med kun beskedne ændringer i TK1 niveauer, undtagen ved den højeste dosis af PLX4032. (B) Nedsat

TK1

mRNA niveauer blev observeret ved alle koncentrationer narkotika over 10 nM (p 0,05).

[

18F] -FLT PET, men ikke [ ,,,0],

18F] -FDG PET, afspejler forhøjede mTOR aktivitet og korrelerer med mangel på p-ERK inhibering i PLX4720-behandlede COLO 205 xenotransplantater

Mus bærer COLO 205 xenotransplantater blev behandlet dagligt med 60 mg /kg PLX4720 i 4 dage og filmede med [

18F] -FLT PET eller [

18F] -FDG PET (fig. 4). Efter aftale med

in vitro

undersøgelser viser, at BRAF hæmning havde ringe effekt på TK1 niveauer COLO 205 celler, behandling med PLX4720 havde ringe effekt på [

18F] -FLT PET billeddannelse. Omvendt [

18F] -FDG PET var signifikant reduceret i tilsvarende behandlede kohorter (fig. 4B). Efter aftale med billedbehandling, TK1 niveauer af PLX4720-behandlede xenotransplantater svarede til bærerbehandlede kontroller. ligner

in vitro

studier fundet Også vi forhøjede p-ERK-niveauer og p-rpS6 niveauer i PLX4720 behandlede xenotransplantater forhold til bærerbehandlede kontroller, trods hæmning af BRAF effektor, p-MEK.

(A) repræsentant tværgående [

18F] -FLT og [

18F] -FDG PET billeder erhvervet efter tre daglige behandlinger med bil eller 60 mg /kg PLX4720 (tumor angivet med pilespids). (B) Kvantificering af PET-data illustrerede lignende [

18F] -FLT optagelse i bærerbehandlede og PLX4720-behandlede tumorer. I modsætning [

18F] -FLT PET, PLX4720 eksponering fremkaldte en signifikant reduktion i [

18F] -FDG uptake (p = 0,0006). (C) Western blot analyse af køretøj og og PLX4720 behandlet tumorvæv bekræftede, at PLX4720 havde ingen effekt på TK1 protein niveauer efter aftale med [

18F] -FLT PET. Target hæmning som målt ved p-MEK niveauer blev observeret. Men ligner

in vitro

studier, PLX4720 behandlet COLO 205 xenografter udstillet forhøjede p-ERK og p-rpS6 protein niveauer i forhold til kontrol af køretøjer.

Regulering af TK1 efter mTOR eller dual PI3K-mTOR hæmning og

V600EBRAF hæmning i COLO 205 celler

For at undersøge mTOR rolle i TK1 regulering efter

V600EBRAF hæmning, dyrkede COLO 205 celler blev behandlet samtidigt med 250 nM pp242, en selektiv mTORC1 /mTORC2 inhibitor [21] og stigende koncentrationer af PLX4032 i 48 timer (Fig. 5). Tilføjelse PP242 havde ringe virkning på PLX4032-afhængig inhibering af p-MEK, men effektivt blokeret aktivering af p-AKT ved Ser473 og sløvet den tidligere observerede aktivering af p-rpS6 forårsaget af PLX4032 eksponering (sammenlign med fig. 3A). Imidlertid mTOR blokade var utilstrækkelig til at dæmpe p-ERK eller p-AKT Thr308-niveauer i et PLX4032-afhængig måde, og heller ikke til helt at dæmpe p-rpS6 niveauer (Fig. 5A). Som med monoterapi

in vitro

studier, p-rpS6 aktivering korreleret med en lille dæmpning af DUSP6 niveauer, og en let forhøjelse af p-ERK ved højere koncentrationer PLX4032. Ikke desto mindre, kombineret inhibering af p-AKT Ser473 og p-MEK resulterede i faldt dramatisk TK1, både proteinet og mRNA-niveau. Ved tilstedeværelse af forhøjet p27,

TK1

mRNA-niveauer faldt dramatisk, med betydelige reduktioner observeret på PLX4032 koncentrationer så lave som 10 nM (fig. 5A). Endvidere antyder, at AKT aktivitet var ansvarlig for post-translationel modifikation og nedbrydning af p27, i nærvær af p-AKT Ser473 inhibering, blev p27 proteinet dramatisk forhøjet, men

p27

mRNA var ikke (fig. 5C).

(A) Western blot af COLO 205 celler behandlet med PP242 (250 nM) og stigende PLX4032. Svarende til enkeltstof PLX4032, p-MEK, men ikke p-ERK, blev hæmmet i en PLX4032-afhængig måde. I overensstemmelse med mTORC1 /mTORC2 inhibering, p-AKT Ser473, men ikke p-AKT Thr308, blev inhiberet. I modsætning til enkeltstof PLX4032, hvilket resulterede i koncentrationsafhængig aktivering af p-rpS6, kombineret behandling opretholdes p-rpS6 niveauer på væsentlige baseline niveauer undtagen ved den højeste PLX4032 koncentration. Tilsvarende blev DUSP6 niveauer omvendt relateret til p-ERK proteinniveauer. Med kombineret mTOR og

V600EBRAF blokade, P27 og TK1 protein niveauer blev omvendt korreleret og dramatisk påvirket af PLX4032 eksponering. (B) På lignende måde

TK1

mRNA blev reduceret signifikant ved PLX4032 koncentrationer så lave som 10 nM. (C) På trods forhøjede p27 protein niveauer,

p27

mRNA var upåvirket af kombineret mTOR-

V600EBRAF hæmning.

Da kombineret

V600EBRAF-mTOR hæmning var utilstrækkelig at dæmpe p-rpS6, og kombineret med den iagttagelse, at PI3K-aktivitet og nedstrøms signalering er blevet foreslået som en mekanisme af resistens over for BRAF inhibering af colorectal cancer [22] og melanom [23], [24], vurderede vi virkningerne af dobbelt PI3K-mTOR inhibering i COLO 205-celler i sammenhæng med

V600EBRAF inhibering (fig. 6). COLO 205-celler blev behandlet med enten PLX4032, BEZ235, et lille molekyle dobbelt hæmmer af PI3K og mTOR [25], eller kombinationen i 24 timer. Faktisk inhibering både mTOR aktivitet, som målt ved p-AKT Ser473, og PI3K-aktivitet, som målt ved p-AKT Thr308, i nærvær af PLX4032 resulteret i større p27 proteinniveauer og faldt TK1 proteinniveauer. Disse resultater bedt vores vurdering af denne kombination

in vivo

.

Enkelt agent PLX4032 resulterede i aktivering af p-AKT Ser473 efter 24 timers eksponering ved to koncentrationer (100 nm, 1 uM).