PLoS ONE: Prognostisk Betydningen af ​​MYH9 Expression i resektion Ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Introduktion

Myosin-9 (MYH9) tilhører myosin superfamilien af ​​actinbindende motor protein . For nylig er MYH9 været anset for at være associeret med cancer cell migration, invasion, og metastase. Formålet med denne undersøgelse var at immunhistokemisk undersøge MYH9 udtryk i kirurgisk resektion ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), og evaluere sine korrelationer med klinisk-patologiske parametre og prognosen for patienter.

Metoder

MYH9 ekspression blev immunhistokemisk undersøgt i 266 på hinanden følgende resektion NSCLCs, og dens foreninger med klinisk-patologiske parametre blev evalueret. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og Cox proportionel risiko modeller blev anvendt til at estimere effekten af ​​MYH9 udtryk på overlevelse.

Resultater

MYH9 udtryk blev påvist i 102 af 266 (38,3%) NSCLCs. MYH9 udtryk var signifikant korreleret med adenocarcinom histologi (

P

= 0,014), dårligere differentiering ((

P

= 0,033), intratumoral vaskulær invasion og lymfe invasion ((

P

= 0,013 og P = 0,045 henholdsvis), og en dårligere prognose ((

P

= 0,032) Desuden afslørede multivariable analyse, MYH9 udtryk uafhængigt forudsagde en dårligere overlevelse (HR, 2,15;. 95% CI, 1,17-3,92 (

P

= 0,01)

Konklusion

Den foreliggende undersøgelse viste, at MYH9 udtrykkes i en delmængde af NSCLC med en mere ondartet natur og dets. udtryk er en indikator for et ringere overlevelse sandsynlighed

Henvisning:. Katono K, Sato Y, Jiang SX, Kobayashi M, Nagashio R, Ryuge S, et al (2015) Prognostisk Betydningen af ​​MYH9 Expression i resektion Non. . -Lille Cell Lung Cancer PLoS ONE 10 (3): e0121460 doi:. 10,1371 /journal.pone.0121460

Academic Redaktør: John Souglakos, University Hospital of Heraklion og Laboratoriet for Tumor Cell Biology, School of Medicin, University of Crete, GRÆKENLAND

modtaget: august 29, 2014 Accepteret: 1. februar, 2015; Udgivet: Marts 31, 2015

Copyright: © 2015 Katono et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne modtaget nogen specifik finansiering til dette arbejde

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Primær lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for næsten 80% af alle dødsfald [1]. Prognosen for patienter med NSCLC hovedsageligt korreleret med tumormetastase. Processen med tumormetastase består af komplekse trin: at inddrage tumorcellemigration efterfulgt af adskillelse fra den primære tumor, invasion i omgivende væv, intravasation til blod eller lymfekar, spredning til hemolymphatic systemet, og ekstravasation ved sekundære steder [2]. Forståelse proteiner relateret til tumor migration, invasion, og metastase kan være nyttige som nye prognostiske markører eller terapeutiske mål i NSCLC. En tæt sammenhæng mellem metastase og kemoresistens blev hyppigt observeret hos patienter humane cancer, blev der rapporteret nogle molekyler, som er relateret til metastase og kemoresistens [3,4,5]. Derfor har vi fokuseret proteiner fra cisplatin-resistente sub-linjer til at opdage en ny markør, der indikerer aggressiv klinisk adfærd i NSCLC.

I den foreliggende undersøgelse har vi fokuseret på Myosin-9 (MYH9), som er steget i cisplatin-resistente sub-linjer. Myosin superfamilien er repræsenteret ved femten klasser. Myosin-II, den konventionelle tohovedet myosin, der danner bipolære filamenter, er direkte involveret i reguleringen cytokinese, celle motilitet, og cellemorfologi i nonmuscle celler. Hvirveldyr udtrykker mindst to ikke-muskel myosin II tung kæde isoformer, benævnt myosin-IIA og myosin-IIB. Førstnævnte består af to ikke-muskel myosin IIA tunge kæder (NMMHC-Ha), benævnt Myosin-9 (MYH9), to regulatoriske lette kæder (RLC) og to essentielle lette kæder. Aktiviteten af ​​myosin-IIA er primært reguleret af phosphorylering af RLC og MYH9 [6]. Fordi MYH9 bidrager til celle polaritet, vedhæftning, division, og migration [7,8], har flere undersøgelser vist, at MYH9 spiller en central rolle i kræft celle migration, invasion, og metastase [9,10]. I humane MCF-7 brystcancerceller, MCF-7/6 celler, der har en invasiv evne viser en højere ekspression af MYH9 end MCF-A /Z-celler, som er noninvasive. Invasivitet af MCF-7/6 formindsket enten ved knockdown af MYH9 eller behandling med Blebbistatin, der inhiberer funktionen af ​​MYH9, hvilket indikerer deltagelse MYH9 i migration og invasion af cancerceller. Overekspressionen af ​​MYH9 angår en dårlig prognose i esophageal [11], blære [12], og gastrisk cancer [13]. Maeda et al. rapporterede, at trin I patienter med lunge adenocarcinom mangler ekspression af enten MYH9 eller vimentin har et positivt resultat uden postoperativ adjuverende kemoterapi [14]. Men forholdet mellem MYH9 udtryk og klinisk-patologiske træk, og patienternes prognose skal undersøges nærmere i et stort antal NSCLC sager på forskellige sygdomstilstande faser samt i lunge pladecellekarcinom,. Den foreliggende undersøgelse undersøgte MYH9 udtryk i resektion NSCLCs herunder planocellulært karcinom på patologisk stadium I-III, og analyseret sammenhængen med klinisk-patologiske parametre for patienter og dets prognostisk betydning.

Materialer og metoder

Etik udsagn

undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Kitasato University School of Medicine (B13-53) og fulgt Helsinki-erklæringen protokol. Alle patienter blev kontaktet på grundlag af godkendte etiske retningslinjer, enige om at deltage i denne undersøgelse, og kunne nægte indrejse og afbryde deltagelse til enhver tid. Alle deltagere viste sig skriftlige samtykke. Dyr i denne undersøgelse blev håndteret i overensstemmelse med retningslinjerne for dyreforsøg i Kitasato University School of Allied Health Sciences, og alle animalske forsøgsprotokol blev godkendt af Udvalget for etik dyreforsøg i Kitasato University School of Allied Health Sciences (14- 16).

Cellelinjer

LCN1, der stammer fra store celle neuroendokrine karcinom, blev etableret i vores laboratorium [15]. LC-2 /ad og A549, begge afledt fra en lunge adenocarcinom, blev indkøbt fra Riken Bioresource Center (Ibaraki, Japan) og japansk Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan), hhv. Disse celler blev dyrket i RPMI-1640-medium (Sigma, Steinheim, Tyskland) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Biowest, Miami, FL, USA), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ( GIBCO, Auckland, New Zealand). Efter høst og vask to gange med phosphatbufret saltvand uden divalente ioner (PBS), blev sub-sammenflydende celler opbevaret ved -80 ° C i proteomisk analyse og fikseret i 10% formalin og indlejret i paraffin for immunhistokemi. LCN1 celler blev også Amex-fast [16] for immunhistokemisk screening. De SP2 /O-Ag14-celler afledt fra et muse myelom blev indkøbt fra Riken Bioresource Center og blev dyrket i RPMI-1640 medium suppleret med 1 × 8-azaguanin (50 × Hybri-Max, SIGMA), 10% FBS, 100 enheder /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (GIBCO).

Cisplatin-resistente sub-linier

Cisplatin-resistente sub-linier (LCN1-cis, LC-2 /ad-cis, og A549-cis) blev oprettet ved at dyrke cellerne i 6 måneder med cisplatin (Randa inj., Nippon Kayaku Co., Ltd., Tokyo, Japan), startende fra en koncentration på 25 og gradvist stigende til 3200 ng /ml. Cisplatin-resistente sub-linjer blev stabilt dyrket i en koncentration på 3200 ng /ml cisplatin i over 12 måneder i vores laboratorium [17].

Generation af monoklonale antistoffer

LCN1-cis cellelysat blev fremstillet med PBS (-) ved anvendelse af en ultra-sonic homogenisator (UH-50; SMT Company, Tokyo, Japan). Fem uger gamle BALB /c-mus blev immuniseret intraperitonealt med 50 mg våd vægt af LCN1-cis cellelysat i 500 ml PBS (-) 3 gange med to ugers interval. Antistoftiteren blev testet ved IHC under anvendelse af 100-gange fortyndede sera fra de immuniserede mus som det første antistof på AMEX-faste LCN1-cis celler. Tre dage før cellefusion, dyret med den højeste titer var intraperitonealt boostet med den samme mængde af LCN1-cis lysat. Hybridoma forberedelse og IHC-screening med AMEX-faste LCN1-cis celler blev beskrevet tidligere [18,19].

Bestemmelse af antistof isotype

Et antistof, der er udpeget som KU-Lu-6, som viste membranøs farvning i LCN1-cis celler, men ikke i sine forældre LCN1 celler, blev samlet op og yderligere undersøgt. For at bestemme isotypen af ​​det etablerede KU-Lu-6-antistof anvendte vi Isostrip

TM Mouse Monoclonal Antibody isotypebestemmelse Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) i overensstemmelse med producentens instruktioner.

Immunopræcipitation

immunpræcipitationsfremgangsmåden anvendes til Pierce Protein L Agarose (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) i denne undersøgelse var ifølge producentens anvisninger. I korte træk blev LC-2 /ad-cis-celler vasket med PBS (-) og behandlet med radio-immunopræcipitation assay (RIPA) buffer indeholdende Hel-mini EDTA-fri (Roche Diagnostics) på is i 30 minutter. Efter centrifugering ved 15.000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C blev supernatanten opsamlet. At konjugere det primære antistof, blev 200 pi primært antistof (KU-Lu-6 hybridomsupernatant) og 50 pi Protein L agaroseperler suspenderet i RIPA puffer inkuberet med rotation ved stuetemperatur i 30 min. Efter centrifugering, antistof-agarose konjugat og 500 ug totalt celleprotein fra LC-2 /ad-cis supernatant blev inkuberet med rotation ved stuetemperatur i 30 min. Immunopræcipitaterne blev opsamlet ved centrifugering ved 15.000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. Efter vask tre gange med RIPA-buffer, supernatanten blev forsigtigt fjernet, og pellets blev resuspenderet i 20 pi 1 × Laemmili puffer. Derefter blev alle prøverne kogt og separeret ved SDS-PAGE med 10% polyacrylamidgel. Efter SDS-PAGE, geler var Zn-farvet med den negative Gel Stain MS kit (Wako Pure Chemical, Tokyo, Japan), ifølge producentens instruktioner.

Identifikation af antigen-protein

proteinplet blev udskåret fra SDS-PAGE-gel og hakket til 1 mm

3, affarvet med Affarvningsopløsningen (Wako Pure Chemical), dehydreret med 100% (v /v) ACN og tørret under vakuum. Tryptisk fordøjelse blev udført med et minimalt volumen af ​​fordøjelse opløsning indeholdende 10 ng /pl trypsin (trypsin Gold, massespektrometri Grade, Promega Madison, WI, USA) og 25 mM NH4HCO3 i 24 timer ved 37 ° C. Efter inkubation fordøjet proteinfragmenter eluerede i opløsning, blev opsamlet, og gelerne blev vasket en gang i 5% (v /v) trifluoreddikesyre /50% (v /v) ACN og opsamles i det samme rør.

indsamlede peptidfragmenter blev analyseret ved anvendelse autoflex III matrix-associerede laser desorption /ionisering-time of flight /time of flight-massespektrometri (MALDI-TOF /TOF MS; Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Tyskland). En engangsplade, plettet α-cyano-4-hydroxykanelsyrematrix for prøver, og PAC Peptid Calibstandard for kalibrering (Prespotted AnchorChip 96 sæt til Proteomics, Bruker Daltonik GmbH) blev anvendt. Peptidmasse fingeraftryk (PMF) blev målt, og derefter et par toppe opnået fra PMF blev yderligere målt for deres tandem massespektre som forælder masserne. MASCOT (https://www.matrixscience.com) ved hjælp af IPI menneskelige 3,85 database (89,952 sekvenser; 36,291,020 rester), blev anvendt til at bestemme proteiner fra PMF og tandem masse data

Fordi KU-Lu-. 6 antistof ikke virker for immunoblotting antistoffet absorption test for bekræftelse af antigenet ved hjælp renset syntetisk antigen protein blev udnyttet.

En MYH9 udtryk klon blev konstrueret fra CU013414 klon og pINSOL20 destination vektor med Gateway-systemet ( Life Technologies, USA). Proteinsyntese blev udført under anvendelse af fremgangsmåden i vores tidligere rapport [20]. Kvantificeringen af ​​protein blev beregnet som densiteten af ​​båndet af CBB farvning i SDS-PAGE som BSA standard protein.

A hundred pi hver af ikke-fortyndet hybridomsupernatanter blev præ-absorberet med 0,12, 0,24, og 0,48 ug af syntetiske MYH9 proteiner hhv. Derefter blev de inkuberet ved stuetemperatur i 2 timer og ved 4 ° C natten over. Efter at være blevet centrifugeret ved 20.000 g i 10 minutter blev hver supernatant opsamlet og anvendt som de første antistoffer.

IHC med absorberede antistoffer blev beskrevet i 2.8.

Patienter og vævsprøver

i alt 266 konsekutive NSCLC patienter, som gennemgik komplet resektion fra januar 2002 til december 2005 Kitasato Universitetshospital blev inkluderet i denne retrospektive kohortestudie. De, der fik præoperativ kemoterapi og /eller strålebehandling blev udelukket. Ti procent af formalinfikserede og paraffinindlejrede væv blev forarbejdet til 3-um-tykke sektioner og farvet med hematoxylin og eosin. Den histologiske diagnose var baseret på kriterierne i World Health Organization /International Association for Studiet af lungekræft klassifikation af lunge og pleurale tumorer [21]. Hver patient blev revurderet i henhold til den 7. udgave af TNM klassifikationen [22]. De kliniske og patologiske parametre retrospektivt anmeldt omfattede den alder kirurgisk resektion, køn, rygevaner, histologisk type, tumor differentiering, patologisk TNM (p-TNM) og scene, nodal status, intratumoral vaskulær invasion, intratumoral lymfatisk invasion, pleural invasion, der modtager adjuverende kemoterapi, levedygtighed status, og overlevelsestid efter operationen. Status levedygtighed blev bestemt på grundlag af, hvorvidt NSCLC dødsfald indtraf, og overlevelsestiden blev defineret som varigheden fra tidspunktet for kirurgi til dødsdagen eller slutningen af ​​follow-up. Tilfælde af død af andre årsager eller tabt til opfølgning blev behandlet som censurerede sager.

immunhistokemisk farvning af KU-Lu-6 antistof

Efter deparaffinizing i xylen, 3-um tykke sektioner eller cellepræparater blev rehydreret i en faldende ethanol series og derefter behandlet med 3% hydrogenperoxid i 10 min. De blev antigen-hentes ved autoklavering i 10 minutter i 0,01 M citratpuffer (pH 6,0) med 0,1% Tween20. Efter blokering med 2% normalt svineserum /Tris-bufret saltvand (0,01 M Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl) i 10 minutter, blev de omsat med ikke-fortyndet supernatant af KU-Lu-6-antistof natten over ved stuetemperatur . Efter at være blevet skyllet i Tris-bufret saltvand tre gange i 5 min hver, blev de omsat med ChemMate ENVISION reagens (DAKO, Glostrup, Danmark) i 30 minutter ved stuetemperatur. De blev efterfølgende visualiseret med Stable DAB-opløsning (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og modfarvet med Mayers hematoxylin. Negative kontroller blev fremstillet ved at erstatte phosphatbufret saltvand for KU-Lu-6-antistof.

Evaluering af immunhistokemisk farvning

membranøs immunfarvning af tumorceller blev anset for at være positiv for KU-Lu -6 antistof. Den farvningsintensitet blev kategoriseret i tre grupper: 0 = negativ; 1 = svagt positiv; 2 = stærkt positiv. Tumorcellerne med en farvning score på 2 blev bedømt som positive. Vi observeret i alle tumorceller af prøven blev en tumor med positiv farvning i mere end 25% af sine tumorceller betragtes som positive. Alle de immunofarvede sektioner blev revideret af to efterforskere (K. K. og S.Y.) uden kendskab til de kliniske data. Uharmoniske sager blev gennemgået og diskuteret indtil enighed blev nået.

Statistisk analyse

Kontinuerlige variable er præsenteret som median (range), mens numeriske variabler er givet som N (%). Forholdet mellem NMIIA udtryk og klinisk-patologiske parametre blev vurderet med Pearsons χ

2 test eller Fishers eksakte test, som er relevant. Den kumulative overlevelse af patienter blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden, og betydningen af ​​overlevelse forskelle mellem MYH9-positive og -negative grupper blev testet under anvendelse af log-rank test. Det 5-års kumulativ overlevelse sandsynlighed blev estimeret ved hjælp af liv bordet metoden med intervallet længde sat til 1 måned. Multivariable analyse blev udført ved at anvende Cox proportionel risiko regressions model til at undersøge samspillet mellem MYH9 udtryk og andre klinisk-patologiske variabler, og estimere den uafhængige prognostiske effekt af MYH9 på overlevelse ved at justere for forstyrrende faktorer. Den konventionelle

P

-værdi på 0,05 eller mindre blev brugt til at bestemme niveauet af betydning. Alle indberettede

P

-værdier er tosidet. Analyser blev udført uafhængigt ved vores kliniske forskningscenter hjælp SPSS-version 17,0 softwaren. (SPSS, Chicago, IL, USA)

Resultater

Karakterisering af KU-Lu-6 antistof

Brug AMEX-faste LCN1-cis-celler til immunhistokemisk screening endelig valgte vi en klon, som KU-Lu-6, som viste membranøs farvning på LCN1-cis celler, men ikke på LCN1 celler (Fig. 1).

membranøs farvning blev observeret i LCN1-cis celler, men ikke i LCN1 celler. (Oprindelig forstørrelse: A, B × 400).

Ved immunhistokemisk farvning af KU-Lu-6-antistof med formalin-fikserede cellelinier, intensiv farvning blev observeret i cisplatin-resistente cellelinier, især i LC2 /ad-cis celler (fig. 2A).

KU-LU-6-antistof supernatant blev præ-absorberet med ingen (A), 0,12 ug (B), 0,24 ug (C), og 0,48 ug (D) af syntetiske MYH9 proteiner. Hver absorberede antistof blev immunfarvet med formalin-fikserede LC2 /ad-cis celler. Den stainability af KU-Lu-6 antistof blev gradvist reduceret afhængig af koncentrationen af ​​MYH9 protein.

For at identificere det antigen protein genkendes af KU-Lu-6-antistof, vi udførte IP med lysat fra LC-2 /ad-cis celler. Resultaterne af IP er vist i fig. 2. Det antigene protein blev observeret ved omtrent 250 kDa i bane 2 (fig. 3). Intet signal blev observeret i bane 3 og 4 som en negativ kontrol (fig. 3). For at bestemme det antigene protein genkendt af KU-Lu-6-antistof, vi udskåret og indsamlet stedet fra Zn-farvede gel, og fortsatte med i-gel fordøjelse. Efter analyse ansætte en MALDI-TOF /TOF MS og MASCOT søgning, blev proteinet bestemt som isoform 1 af myosin-9 (MYH9, tiltrædelse: IPI00019502), som er sammensat af 1.960 aminosyrer med en forudsagt molekylvægt på 226.532 Da. Den immunoglobulinisotype af KU-Lu-6 antistof blev bestemt som IgM, k. Ved antistoffet absorption test blev stainability af KU-Lu-6 antistof gradvist reduceret afhængig af koncentrationen af ​​MYH9 protein. Den stainability af KU-Lu-6-antistof var fuldstændig tabt med 0,48 ug MYH9 protein (figur 2).

Bane 1:. Molekylvægtmarkør, bane 2: LC-2 /ad-cis lysat kombineret med KU-Lu-6-antistof, bane 3: LC-2 /ad-cis lysat kombineret med protein L, bane 4: KU-Lu-6-antistof kombineret med protein L, bane 5: LC-2 /ad-cis lysat. Bane 3 og 4 er negative kontroller, og specifik immunpræcipiteret produkt med KU-Lu-6 antistof blev påvist i bane 2 (pil).

MYH9 udtryk i NSCLC

MYH9 blev udtrykt i membranen og cytoplasma nogle tumorceller. Især blev farvningsintensitet markeret i cellemembranen. Af de 266 kirurgisk resektion NSCLCs, herunder 203 adenocarcinomer, 51 skælcellecarcinomer, 10 storcellede carcinomer, og 2 adenosquamøst cellecarcinomer, positiv MYH9 ekspression i tumorceller blev observeret i 102 tilfælde (38,3%) (Fig. 4). MYH9 ekspression blev også observeret i fibroblaster i tumorstroma og i normale bronchiale epitelceller. MYH9 ekspression blev ikke påvist i normale alveolære epitelceller. Ingen ekspression blev observeret i de negative kontroller

A:. MYH9 var stærkt udtrykt i membranen af ​​tumorceller i adenocarcinom. B: MYH9 var stærkt udtrykt i membranen og cytoplasma af tumorceller i pladecellecarcinom. (Original forstørrelse: A, B × 400)

klinisk-patologisk karakteristika af patienter

De klinisk-patologiske karakteristika for de patienter er opsummeret i tabel 1. I alt 168 mænd og 98 kvinder. blev inkluderet, med aldre spænder fra 34 til 85 år (median, 64 år), hvoraf 166 (62,4%) var rygere. Den overordnede opfølgning varighed varierede fra 3 til 129 måneder (median, 84 måneder). I alt 142 patienter var i live ved slutningen af ​​opfølgningen, 88 patienter var døde af lungekræft, var 19 patienter døde af andre årsager, og 17 patienter blev tabt for opfølgning. Årsagerne til de 19 ikke-lungekræft dødsfald var lungebetændelse (n = 11), cholangiocellulær carcinom (n = 2), kronisk obstruktiv lungesygdom (n = 1), sepsis (n = 1), cerebral infarkt (n = 1) , akut myokardieinfarkt (n = 1), gastrisk cancer (n = 1) og leukæmi (n = 1). Ingen af ​​disse 19 patienter havde kirurgi dødsfald. I 17 tabte-til-opfølgende patienter, alle blev tabt til opfølgning på grund af ophørende hospital fremmøde og var ude af stand til at blive kontaktet. De opfølgende varigheder af de 17 patienter tabte til opfølgning varierede fra 15 til 92 måneder (median, 61 måneder).

Forholdet mellem MYH9 udtryk og klinisk-patologiske karakteristika

relationer mellem MYH9 udtryk og klinisk-patologiske karakteristika er sammenfattet i tabel 2. MYH9 udtryk blev oftere fundet i adenocarcinom end i planocellulært karcinom og andre histologiske undertyper (

P

= 0,014). MYH9 ekspression blev også relateret til dårligere differentiering (

P

= 0,033), intratumoral vaskulær invasion (

P

= 0,013), og intratumoral lymfatisk invasion (

P

= 0,045) . Der var ingen signifikant sammenhæng mellem MYH9 udtryk og alder, køn, rygevaner, p-TNM stadie, nodal status, eller pleural invasion

Kaplan-Meier estimatet for overlevelse i MYH9-positive og. – negative patienter

Alle patienter blev inkluderet i overlevelse analyse. De overordnede opfølgende perioder varierede fra 3 til 129 måneder (median, 84 måneder), og 5-års kumulativ overlevelse sandsynlighed var 70% for alle patienter. Fordi en kumulativ overlevelse sandsynlighed på 50% endnu ikke var nået, blev den samlede median overlevelsestid ikke bestemt. Det 5-års kumulativ overlevelse sandsynlighed var 66% for MYH9-positive gruppe og 78% for MYH9-negative gruppe. Mens den gennemsnitlige overlevelsestid ikke var tilgængelige, overlevelsesraten for MYH9-positive gruppe var signifikant dårligere gruppe (

P

= 0,029) (fig. 5A). I yderligere analyser, blev MYH9 udtryk signifikant korreleret med dårligere overlevelse hos patienter med enten adenocarcinom (

P

= 0,007) (fig. 5B) eller pladecellekræft (

P

= 0,032) (Fig . 5C). Det 5-års overlevelsen sandsynlighed var 69 og 85% for MYH9-positive og -negative adenocarcinom patienterne, og 43 og 74% for MYH9-positive og ekskluderet pladecellekræft patienterne.

(A ) for alle patienter; (B) til patienter med adenocarcinom; (C) for patienter med planocellulært karcinom, behandle alle andre årsager til død og tabte til opfølgning som censurerede sager. MYH9 udtryk var signifikant korreleret med dårligere overlevelse i resektion NSCLCs.

Effekt af MYH9 udtryk på overlevelse med uni- og multivariable analyser

Univariable analyse blev udført i overensstemmelse med Cox proportional hazard model at vurdere effekten af ​​MYH9 ekspression og andre klinisk-patologiske faktorer på overlevelse. Resultaterne viste, at den histologiske type (HR, 1,94; 95% CI, 1,23-3,06;

P

= 0,004), p-TNM stadie (HR, 4,58; 95% CI, 2,89-7,26;

P

0,001), adjuverende kemoterapi (HR, 2,81; 95% CI, 1,73-4,57;

P

0,001), tumor differentiering (HR, 2,45; 95% CI, 1.53- 3,92;

P

0,001), vaskulær invasion (HR, 5,67; 95% CI, 3,25-9,90;

P

0,001), lymfatisk invasion (HR, 4,43; 95% CI, 2,65-7,40;

P

0,001), pleural invasion (HR, 2,64; 95% CI, 1,73-4,03;

P

0,001), og MYH9 udtryk (HR , 1,57; 95% CI, 1,03-2,39;

P

= 0,03) var signifikante prædiktorer for kræft-specifik overlevelse. Desuden blev MYH9 udtryk og andre clinicopathlogical variabler, herunder den histologiske type, p-TNM stadie, adjuverende kemoterapi, tumor differentiering, vaskulær invasion, lymfe invasion, og pleural invasion indgået multivariabel analyse ved hjælp af Cox proportionel risiko regressions model. Resultaterne indikerede, at MYH9 udtryk var en signifikant uafhængig prædiktor for en dårligere overlevelse. (HR, 2,15; 95% CI, 1,17-3,92;

P

= 0,01) (tabel 3)

diskussion

i den foreliggende undersøgelse, MYH9 blev udtrykt i 102 af 266 (38,3%) NSCLCs, og dens udtryk var signifikant korreleret med en adenocarcinom histologi, dårligere differentiering og intratumoral vaskulær og lymfe invasion. Efter aftale med tidligere rapporter om esophageal [11], blære [12] og gastrisk kræft [13], den foreliggende undersøgelse viste, at MYH9 udtryk er en uafhængig prognostisk faktor og forbundet med en dårligere prognose for patienter med reseceret NSCLCs. Selvom Maeda et al. rapporteret, at patienter med stadium I lungeadenokarcinom mangler ekspression af enten MYH9 eller vimentin vise et positivt resultat uden postoperativ adjuverende kemoterapi [14], den foreliggende undersøgelse viste, at MYH9 udtryk er en uafhængig prognostisk faktor for overlevelse hos patienter med resektion NSCLCs herunder patologisk stadium i-III og lunge pladecellekarcinom.

i den foreliggende undersøgelse, MYH9 farvning blev påvist i både membranen og cytoplasma nogle tumorceller, selvom farvningsintensitet var markant stærkere i cellemembranen. I MDA-MB-231 brystcancerceller spredning på fibronectin, er MYH9 observeret ved den marginale spredning lamellare region af cellerne [9]. Fordi MYH9 er rapporteret at bidrage til cellepolaritet og lamellipodia på cellens periferi og forkanten, stærk farvning intensitet ved cellemembranen kan afspejle den MYH9 aktivitet i kræft cellemigration og invasion.

Lokal mikromiljø invasion, såsom intratumoral lymphovascular gennemtrængning, er et vigtigt skridt i den tidlige fase af tumor metastase. MYH9 bidrager til cellemigrering som er påkrævet for invasion af det lokale mikromiljø.

In vitro

, rapporterede flere undersøgelser, at MYH9-udtømte celler viste defekte migration [10,11]. Endvidere lamellipodia dannelse ved forkanten af ​​cellen er nødvendig for migrationen [23], og en sådan dannelse er kontrolleret af Rac, WAVE kompleks, og ARP2 /3complex [24]. For nylig Morimura et al. rapporterede, at MYH9 er også nødvendigt for lamellipodia dannelse ved binding til Wave2 [25]. Således kan MYH9 udtryk være forbundet med erhvervelsen af ​​migrations- og invasion kapaciteter af tumorceller, som efterfølgende resulterer i meget intratumoral lymphovascular invasion og fattigere prognoser i den foreliggende undersøgelse.

I den foreliggende undersøgelse, MYH9 udtryk var signifikant korreleret med dårligere tumor differentiering. Dårligt differentieret carcinom er kendetegnet ved lettelse af cytokinesen. I cytokinese, celler bygge en kontraktil ring, der bremsende plasmamembranen at generere to datterceller forbundet af et cytoplasmatisk bro. MYH9 bidrager til sammentrækning af den kontraktile ring og spiller en central rolle i cytokinese [26,27]. Desuden er en tidligere undersøgelse rapporterede, at behandling med Blebbistatin, en inhibitor af MYH9, fører til svigt af cytokinesen [28]. Det er således ikke overraskende, at MYH9 udtryk er forbundet med dårligere tumor differentiering i nærværende undersøgelse.

Konklusion

Vi har rapporteret, at MYH9 udtrykkes i en delmængde af NSCLC, og dens udtryk er relateret til adenocarcinom histologi, dårligere differentiering, intratumoral vaskulær invasion, intratumoral lymfatisk invasion, og en dårligere prognose. MYH9 udtryk er en uafhængig prognostisk faktor for overlevelse hos patienter med operativt fjernede NSCLCs, selv om dens prognostisk betydning stadig kræver bekræftelse med større patientpopulationer.