PLoS ONE: Ekspression af Bcl-2 Protein BAD Fremmer prostatakræft Growth

Abstrakt

BAD, en pro-apoptotisk protein af Bcl-2-familien, er for nylig blevet identificeret som en integrator af flere anti- apoptotisk signalveje i prostatacancerceller. Således aktivering af EGFR, GPCR’ere eller PI3K sti fører til BAD phosphorylering og hæmning af apoptose. Øget BAD i prostata carcinomer er også blevet rapporteret. Det ser selvmodsigende at i stedet for at begrænse ekspression af pro-apoptotisk protein, prostatacancerceller vælge at forøge BAD niveauer samtidig holde det under stram phosphorylering kontrol. Analyse af effekten af ​​BAD på prostatakræft implanteret har vist, at øget BAD udtryk øger tumorvækst, mens knockdown af BAD udtryk ved shRNA hæmmer tumorvækst. Tissue kultur eksperimenter påvist at øget BAD udtryk stimulerer proliferation af prostata kræftceller. Disse resultater antyder, at forøget ekspression af BAD tilvejebringer en proliferativ fordel til prostatatumorer, mens BAD dephosphorylering øger følsomheden af ​​prostatacancerceller over for apoptose. Kombination af proliferative og apoptotiske egenskaber beder prostata cancer celler, der skal “afhængige” til øget phosphoryleret BAD. Således kinaser, der phosphorylerer BAD er plausible terapeutiske mål; under overvågning BAD phosphorylering kunne anvendes til at forudsige tumor respons på behandlinger

Henvisning:. Smith AJ, Karpova Y, D’Agostino R Jr, Willingham M, Kulik G (2009) Ekspression af Bcl-2 Protein BAD Fremmer Prostata Cancer Growth. PLoS ONE 4 (7): e6224. doi: 10,1371 /journal.pone.0006224

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: Marts 10, 2009; Accepteret: 11 Juni 2009; Udgivet: 13 Jul 2009

Copyright: © 2009 Smith et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH /NCI tilskud R01 CA118329, Department of Defense Prostata Cancer Research Program Grant PC073548, tilskud fra Comprehensive Cancer center og WFUSM Interim Funding til GK; AS blev støttet af NIH Award T32CA079448. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den hyppigst diagnosticerede kræft og den anden hyppigste årsag til kræft dødsfald blandt mænd i USA [1]. I øjeblikket er der ingen effektiv behandling for androgen-uafhængig fremskreden prostatacancer [2]. Mekanismer, som sætter prostatacancerceller at unddrage apoptose kan bidrage til terapeutisk modstand. Således forhøjede niveauer af flere vækstfaktorer, herunder FGF, EGF, IL-6 og GPCR-agonister, som aktiverer anti-apoptotiske signalveje, er blevet rapporteret i androgen-uafhængig prostatacancer [3] – [7]. Anti-apoptotiske signaler kan enten posttranslationelt ændre apoptose regulatoriske proteiner eller ændre deres ekspressionsniveauerne. Faktisk har forøget ekspression af anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner såvel som inhibitorer af apoptose proteiner (IAP) i fremskreden prostatacancer blevet rapporteret [8], [9]. Vi har også for nyligt vist, at i prostatacancerceller, den pro-apoptotiske Bcl-2-protein BAD spiller en særlig rolle som en konvergens punkt af flere anti-apoptotisk signalveje, der omfatter grundlæggende aktiv PI3K, aktiveret EGFR og GPCR [6].

BAD, bcl-xl /bcl-2- antagonist forårsager celledød, blev oprindeligt identificeret i en gær to-hybrid skærm interaktion med Bcl-2 eller Bcl-xl [10]. BAD er et unikt BH3-only familiemedlem ved, at reguleringen primært medieres gennem dens konserverede phosphoryleringssteder (seriner 112, 136 og 155 baseret på musesekvensen) [11], [12]. Phosphoryleret BAD formår at binde Bcl-XL eller Bcl-2-proteiner, og har været betragtet som en apoptose sentinel inaktiveret ved anti-apoptotiske signaler. Ved tilbagetrækning af overlevelse faktorer BAD bliver dephosphoryleret forrykker balancen af ​​pro- og anti-apoptotiske Bcl proteiner, der udløser frigivelse af cytochrom c, SMAC og AIF fra mitokondrier og efterfølgende fører til apoptose [12]. Derved ville det ikke være overraskende, hvis kræftceller formindske BAD udtryk.

En nylig undersøgelse har vist, at BAD udtryk er forhøjet i prostata carcinomer i forhold til lav udtryk i normal prostata epitel [13]. Det virker ulogisk, at prostata celler ville dedikere ekstra ressourcer til at opretholde BAD fosforylering i stedet for at fjerne sit udtryk. Det er muligt, at ud over at regulere apoptose, kan BAD spille en positiv rolle i prostata tumorvækst.

Her er vi rapportere, at øget BAD udtryk stimulerer proliferation af prostata cancer celler i vævskultur og prostata tumorvækst

in vivo

. Samtidig, BAD dephosphorylering øger følsomheden af ​​prostatacancerceller over for apoptose. Denne kombination af proliferative og apoptotiske egenskaber skaber betingelser for prostata kræftceller “afhængighed” til øget phosphoryleret BAD. Således kinaser, der phosphorylerer BAD er plausible terapeutiske mål.

Materialer og metoder

Cellelinjer

Prostatakræft cellelinjer, LNCaP og c4-2, var gaver fra Dr. Leland Chung (Emory University, Atlanta GA). C4-2BADLuc celler blev genereret ved transfektion af c4-2 celler med vildtype BAD (HA-BAD-pTRE2hygro) og ildflueluciferase (pGL3) henviser pTRE2hygro og ildflue luciferase (pGL3) blev transficeret ind c4-2 celler til frembringelse C4-2Luc . LNCaP-celler blev vedligeholdt med T-medium suppleret med 5% føtalt bovint serum, og c4-2 celler blev opretholdt med RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum. Alle celler blev holdt ved 5% CO

2 ved 37 ° C

antistoffer og andre reagenser

Antistoffer blev indhentet fra følgende kilder:. BAD, phospho-specifikke BAD (seriner 112 , 136, 155) fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA); ERK fra Zymed Laboratories (South San Francisco, CA); sekundær peberrodsperoxidasekonjugeret antistoffer anvendt til Western blots fra Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Alle andre kemikalier (medmindre andet er angivet) blev erhvervet fra Sigma (St. Louis, MO). Vævskultur reagenser blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA).

shRNA eksperimenter

A lentiviral vector (pLL3.7) [14] blev anvendt med en shRNA insert af annealede oligonukleotider. Den dårlige DNA målsekvenser blev anvendt, var 5′-TGAAGGGACTTCCTCGCCCGT-3 ‘og 5’ GGCTTGGTCCCATCGGAAG-3 ‘. HEK 293-celler blev transficeret med pLL3.7 vektor indeholdende en af ​​disse sekvenser eller en kodet sekvens 5’-GGTACGGTCAGGCAGCTTCT-3 ‘i kombination med emballage vektorer (VSVG, RSV-REV og pMDL g /p RRE). Efter 48 timer blev supernatanter opsamlet fra disse celler og anvendt til at inficere LNCaP eller c4-2 celler [6]. Otteogfyrre timer efter infektion blev cellerne udpladet for efterfølgende forsøg

proliferationsassays Salg

Celletællinger blev udført således:. 2 × 10

5-celler blev udpladet i seks cm skåle for hver forsøgsgruppe. Den oprindelige celletal var 24 timer efter cellerne var fæstnet til skålene (dag 1). To yderligere tællinger blev foretaget tre dage senere (dag 4) og seks dage senere (dag 7) og derefter sammenlignet med det oprindelige celletal. Tællinger blev foretaget ved trypsinbehandling og indsamle celler i medier, derefter manuelt regner med en hæmacytometer. MTT analyser blev udført i henhold til anvisningerne fra kit producenten (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) på celler forgyldt med 24-brønds plader ved varierende tætheder. Tredobbelte brønde blev anvendt for hvert datapunkt.

Immunhistokemi

antistof farvning blev udført på histologiske snit af formalin-fikserede prostata tumorxenoplantater. Antigen genfinding blev udført ved opvarmning objektglas ved 95 ° C i 10 mM natriumcitratbuffer (pH 6,0) i 60 minutter. Derefter blev snit behandlet identisk som følger: 1) inkuberet i 2% hydrogenperoxid for at blokere endogen peroxidaseaktivitet; 2) inkuberet med blokeringsopløsning: 1% BSA, 0,1% Tween 20 i PBS (30 min, 25 ° C); 3) inkuberet med primære antistoffer, Ki-67 fra Abcam Inc. (Cambridge, MA) fortyndet 1:25-1:200 i blokeringsopløsning (natten over, 4 ° C); primære antistoffer blev efterfulgt af peroxidase-konjugeret anti-kanin-sekundære antistoffer (10 ug /ml, i blokerende opløsning, 30 min, 25 ° C) og afslørede med 3-3′-diaminobenzidin (DAB) som fremkalder-kromogen. Mellem trin, blev prøver vasket i PBS 3 gange.

subkutane implantationer

Nude mus (BALB /cAnNCrj-nu fra Charles River) modtog fire subkutane injektioner af 2 × 10

6 celler med Matrigel. Injektioner udførtes under anvendelse af en insulinsprøjte og en 27 gauge nål. Alle manipulationer med dyr blev udført på human måde, i nøje overensstemmelse med en protokol, der er godkendt af den institutionelle ACUC, der er designet til at minimere dyrenes lidelser.

Luminescence Imaging

Tumorvækst blev analyseret med en Xenogen IVIS® 100 optisk billeddannende system (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Dyrene blev immobiliseret til underlaget injektion og billeddannelse gennem en vedhæftet gas anæstesi bestående af 2% isofluran /O

2. At redegøre for baggrund og ikke-specifik luminescens blev mus afbildet før injektion af luciferase. Dyr blev injiceret med 100 pi af ildflue-luciferase-substrat luciferin (3,5 mg /ml i PBS) og afbildes 15 minutter senere i tilbøjelige og liggende stillinger (5 minutter hver). Whole-body billeder blev opnået ved hjælp af Living Image® software, der leveres med imaging system. En grå-skala fotografiske billede og bioluminescerende farvebillede overlejres at tilvejebringe anatomisk registrering af lyssignalet. En region af interesse (ROI) blev valgt manuelt over selvlysende signal, og intensiteten blev registreret som fotoner /sekund inden en ROI.

Statistisk analyse

For at bestemme, om forskelle mellem datasæt var statistisk signifikant, Students t-test analyse (tosidet distribution to stikprøver ulige varians). blev udført ved hjælp af Excel software

Resultater

BAD udtryk stimulerer proliferation af prostata kræftceller

Rapporter om forøget ekspression af BAD i prostatakræft førte os til at foreslå, at prostata kræftceller kan have gavn af at opretholde BAD udtryk. For at løse den mulige rolle af øget BAD udtryk, vi undersøgte spredning af prostata kræftceller, der overudtrykker BAD. Til dette formål har vi sammenlignet proliferation af cellelinier, ektopisk udtrykker dårlig og cellelinier transficeret med tom vektor. Celler med forhøjede niveauer af BAD var præget af øget proliferation i vævskultur (fig. 1A, B). For at udelukke, at en øget spredning af celler, der stabilt udtrykker BAD skyldtes klonede variationer, vi sammenlignet spredning i celler forbigående transficeret med enten dårlige eller tomme vektor. Disse eksperimenter viste øget spredning i flere cellelinier, der forbigående udtrykker BAD (Fig. 1C).

(A) HA-BAD udtryk i C4-2LucBAD klon. (B) C4-2LucBAD prolifererer hurtigere end C42 celler. C4-2LucBAD celler eller C4-2Luc celler blev udpladet i tredobbeltbestemmelse 6 cm skåle. På dag 1 og 4 efter udpladning blev cellerne trypsiniseret og talt. Resultater på 4 dage var signifikant forskellige med en p-værdi på 0,001. Sammenlignelige resultater blev opnået i forsøg, hvor proliferation blev målt med MTT-assayet. C) Forbigående ekspression af HA-BAD stimulerer proliferation. LNCaP-celler blev transficeret med 09:01 blanding af GFP og enten af ​​HA-BAD eller tom ekspressionsvektor. Syv dage efter transfektion, blev antallet af GFP-positive celler talt. Graf viser HA-BAD /tom vektor forholdet mellem GFP-positive celler. Proliferation af GFP-positive celler blev bekræftet ved time lapse videooptagelse. D) Knocking ned BAD udtryk med shRNA falder spredning. En lentiviral vector (pLentiLox 3.7) med en dårlig shRNA insert blev anvendt til at inficere C42cells. C4-2Luc celler blev udpladet i tredobbeltbestemmelse 6 cm skåle. På dag 1 og 4 efter udpladning blev cellerne trypsiniseret og talt. Forsøg blev gentaget mindst 3 gange. E) Western blot analyse af BAD udtryk i celler inficeret med tomme lentivirusvektor, krypteret shRNA eller BAD-specifikke shRNA. Angivelse af total ERK blev anvendt som lastning kontrol.

Siden c4-2 celler stammer fra metastatisk prostatacancer [15], er det muligt, at de kan have allerede etablerede optimale niveauer af BAD. Derfor undersøgte vi effekten af ​​banker ned BAD udtryk på proliferation af disse celler. C4-2Luc celler blev inficeret med lentivirusvektorer der koder scrambled shRNA eller DÅRLIG shRNA. Reduceret udtryk for BAD ført til nedsat proliferation af c4-2 celler (Fig. 1D, E).

BAD udtryk stimulerer prostata tumorvækst

Eksperimenter i vævskultur har vist, at ekspressionen af ​​BAD stimulerer deling af prostatacancerceller, samt andre cancerceller. For at bestemme om øget ekspressionsniveauer af BAD stimulerer prostata tumorvækst

in vivo

, vi sammenlignet vækst C4-2Luc og C4-2LucBAD celler implanteret i immunsvækkede mus. C4-2Luc og C4-2LucBAD celler udtrykker ildflueluciferase, der tillader overvågning af xenograft vækst ikke-invasivt ved optisk billeddannelse. Måling luminescens i stedet for fysisk tumorstørrelse tillader påvisning af xenograft vækst før forekomsten af ​​følbare subkutane tumorer. Denne fremgangsmåde reducerer den tid der kræves for at måle kinetikken af ​​tumorvækst. Analyse af luminescens af C4-2Luc og C4-2LucBAD xenografter viste øget tumor tage og hurtigere tumorvækst i C4-2LucBAD xenografter (fig. 2AB). I overensstemmelse med resultaterne af luminescens analyse, C4-2LucBAD celler produceret tydelige tumorer ved højere frekvens sammenligne med C4-2Luc celler (Fig. 2C). I overensstemmelse med den hurtigere vækst af C4-2LucBAD xenotransplantater viste immunohistokemisk analyse et øget antal celler, der farvede positivt for den proliferative markør Ki-67 sammenlignet med C4-2Luc xenografter (fig. 2D). Salg

Nøgne mus modtaget fire subkutane injektioner af 2 × 10

6 C4-2Luc eller C4-2LucBAD celler. A) Repræsentative hele kroppen billeder af dyrene er opnået ved 1 dag og 2 uger efter implantationer vha IVIS100 og Living Image® software (Xenogen). B) Dot plot viser dobling og median luminescens i mus injiceret med C4-2Luc og C4-2LucBAD celler. C) Procent af tydelige tumorer (over 5 mm) udvikles på injektionssteder. D) Repræsentative vævssnit af formalin-fikserede tumorer farvet for spredning markør Ki67.

Knockdown af BAD udtryk ved shRNA hæmmer tumorvækst

Sideløbende med eksperimenter med C4-2LucBAD celler, eksperimenter blev udført med C4-2Luc celler, hvori endogen BAD ekspression blev inhiberet af shRNA fremgangsmåde. C4-2Luc celler blev inficeret med den lentivirale vektor pLL3.7 som udtrykte BAD shRNA eller krypteret shRNA, og cellerne blev derefter implanteret subkutant i nøgne mus. Luminescens af C4-2Luc xenotransplantater blev fulgt i en uge som vist i fig. 3. C4-2Luc xenografter med en reduceret ekspression af BAD viste reduceret tumor tage og voksede i et langsommere tempo end celler med intakt BAD udtryk.

Nude mus modtog to subkutane injektioner af 2 × 10

6 C4 -2Luc celler inficeret med lentiviral vektor med BAD shRNA (højre side) eller en tom vektor (venstre side). Billeder og kvantificering er som i figur 2. A) Repræsentative billeder af C4-2Luc og C4-2LucBAD tumorer. B) Dot plot viser forholdet mellem luminescens på én uge /dag 1. Efter otte uger blev palpable tumorer registreres kun på steder injiceret med C4-2Luc celler inficeret med tom vektor.

Diskussion

romanen rolle BAD at fremme tumorvækst

de resultater, der præsenteres i dette papir viser, at BAD, BH-3 kun Bcl-2-protein, kan fungere i en dobbelt kapacitet i prostatakræft. Når dephosphoryleret, BAD fremmer apoptose [11], mens der i et phosphoryleret form den stimulerer proliferation og tumorvækst

in vivo

. Denne sammenhæng mellem BAD udtryk og spredning giver en mulig forklaring på en stigning i udtryk for phosphoryleret BAD protein i prostata tumorer.

For nylig flere undersøgelser har vist, at funktioner af BAD kan strække sig ud over sensibiliserende celler til apoptose. For eksempel har udgivelser fra Peter Vogt og Elizabeth Yang laboratorier foreslået, at BAD protein kan være involveret i at fremme cellecyklusprogression [16], [17]. Således er fibroblaster med forøget ekspression af Bcl-2 /BclXL kendetegnet ved reduceret apoptose og også ved nedsat proliferation. Men når Bcl-2 eller BclXL danner et heterodimert kompleks med BAD, kan celler overvinde G0 /G1 vækst anholdelse og indgå S fase [17], [18]. Disse resultater blev udvidet til T-celler ved at vise, at T-celler over-udtrykker BAD var mere tilbøjelige til at forblive i S-fase [19].

I andre nylige rapporter, BAD i phosphorylerede form viste sig at fremme samling af aktive glucokinase komplekser, et indledende trin i den glycolytiske vej [20], [21]. Selvom både øget proliferation og glykolyse er kendetegnende for tumorvækst, har det eksperimentelle beviser, der forbinder BAD udtryk med tumorvækst manglet.

Kunne BAD spille en dobbelt rolle i prostata kræftceller?

Flere rapporter har vist, at celler, som udtrykker BAD breder hurtigere; dog mekanistiske oplysninger om, hvordan BAD fremmer spredning afviger. En mulighed er, at BAD giver en modvægt til øgede niveauer af BclXL og Bd-2, der er kendt for at bremse spredning [22]. Hvis dette scenario er korrekt, ville enhver pro-apoptotiske Bcl2 /BclXL antagonist forventes at have en BAD-lignende effekt. Men hvis ekspression af en sådan antagonist er konstitutiv, vil det virke mod hensigten med forøget Bcl-2 /BclXL ekspression ved at øge apoptose følsomhed. Da andelen af ​​dårlige, der kunne danne heterodimerer med anti-apoptotiske modstykker afhænger fosforylering status, kan BAD være unikt egnet til rollen som modulator af Bcl2 /BClXL, tilgængelighed, der er fint afstemt med proteinkinaser. Det er også muligt, at ved at øge hastigheden af ​​glukoseudnyttelse, BAD udtryk giver konkurrencefordel til cellerne i hypoxiske tumorer, der skifter fra oxidativ fosforylering til glykolyse [23].

Den præcise mekanisme for, hvordan Bd proteiner regulerer spredning er obskur. Det er endnu ikke afgjort, om en enkelt mekanisme spiller en dominerende rolle eller BAD-afhængig stimulering af proliferation medieres via flere mekanismer samtidigt, og om dårlig lokalisering til en bestemt organel (fx mitokondrier, ER, nuklear kuvert) er vigtig. Også denne positive virkning på celledeling kan ikke være ensartet udtryk i alle cancerceller. Således BAD sigende hæmmer G1 til S overgang i MCF7 brystkræftceller [24]. Indtil virkningerne af BAD på proliferation er dissekeret på molekylært niveau, forbliver vi med forestillingen om, at virkningerne af BAD udtryk på proliferation er celletype-afhængige.

Konklusioner

Uanset den nøjagtige mekanisme der tillader dårligt at stimulere tumorvækst, kan denne kapacitet tilvejebringe selektivt tryk for at forøge BAD ekspression i tumorer. Aktivering af protein kinaser, der phosphorylerer BAD skaber en eftergivende betingelse for øget ekspression af BAD. Det er fristende at spekulere, at den høje BAD udtryk bør gøre disse tumorer stadig mere følsom over for inhibitorer af signalveje, der kontrollerer BAD. Hvis det er tilfældet, kunne høje niveauer af phosphoryleret BAD bruges til at identificere patienter, der vil få gavn af behandling med sådanne inhibitorer. Fremtidige studier i dyremodeller og analyse af kliniske forsøg data med hensyn til BAD udtryk /phosphorylering er nødvendige for at bestemme den translationelle værdien af ​​omfattende indsats brugt studere protein kinaser, der phosphorylerer BAD.

Tak

Vi takker James Wood for FACS-analyse, og til Karen Klein til redigering.