PLoS ONE: Restaurering af miR-1228 * Expression Undertrykker Epithelial-Mesenchymale Transition i Gastric Cancer

Abstrakt

fejlreguleret miRNA spiller kritiske roller under carcinogenese og kræft progression. I den foreliggende undersøgelse, blev funktionen af ​​MIR-1228 * i reguleringen cancer progression undersøgt i gastrisk cancer. Nedsat udtryk for miR-1228 * blev observeret i humane gastrisk kræft væv sammenligne med normale væv. Efterfølgende blev rollen som miR-1228 * evalueret

in vivo

hjælp tumor xenograft model. I denne model MIR-1228 * overekspression undertrykt xenotransplantat tumordannelse. Desuden viste vi miR-1228 * negativt reguleret NF-KB-aktivitet i SGC-7901 gastrisk kræftceller og fandt, at CK2A2 var et mål på miR-1228 *. Opregulering af MIR-1228 * faldt ekspressionen af ​​mesenchymale markører og øget epitel markør E-cadherin, hvilket antyder dens mulige rolle i at undertrykke epitel-mesenkymale overgang. Kollektivt, disse resultater giver det første bevis på, at miR-1228 * spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​gastrisk kræft vækst og foreslå, at selektiv restaurering af miR-1228 * kan være gavnligt for mavekræft terapi

Henvisning:. Jia L Wu J, Zhang L, Chen J, Zhong D, Xu S, et al. (2013) Genoprettelse af miR-1228 * Expression Undertrykker Epithelial-Mesenchymale Transition i Gastric Cancer. PLoS ONE 8 (3): e58637. doi: 10,1371 /journal.pone.0058637

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Modtaget: 25 oktober, 2012; Accepteret: 5 feb 2013; Udgivet: 12 Marts 2013

Copyright: © 2013 Jia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af kort ( 20-23 nukleotider lange), endogene, enkeltstrengede RNA’er, der regulerer genekspression ved at forårsage translationel undertrykkelse eller mRNA nedbrydning [1], [2]. Via disse molekylære mekanismer, miRNA besidder normale biologiske funktioner, såsom regulering af celleproliferation, differentiering og apoptose. Endvidere er dysregulerede miRNA vist sig at spille kritiske roller i regulering carcinogenese og cancer progression [3], [4]. Abberant miRNA udtryk er blevet observeret i mange former for maligniteter, herunder gastrisk kræft [5].

Epithelial-mesenkymale overgang (EMT) er en biologisk omprogrammering begivenhed, der gør det muligt epitelcelle at undergå flere biokemiske forandringer til at erhverve en mesenchymal celle fænotype. Mens EMT er kritisk for passende embryonisk udvikling, stigende tegn på, at den afvigende aktivering af EMT fører til malign tumor progression [6]. Det er blevet vist, at EMT er en vigtig proces bidrage til udviklingen af ​​cancer, kendetegnet ved tab af epitel markør E-cadherin, en forøgelse af mesenchymale markør vimentin, og en stigning i den vandrende og invasive opførsel [7], [8].

i vores tidligere undersøgelse, ved at analysere miRNA array af bugspytkirtelkræft sfærer blev mIR-1228 * fundet som en af ​​kræftrelaterede miRNA (data ikke vist). Her har vi dokumenteret, at miR-1228 * blev nedreguleret i mavekræft væv sammenlignet med normale væv. Restaurering ekspression af MIR-1228 * i gastriske cancerceller signifikant inhiberer cellemigration og tumorvækst. Mekanistisk, vi viste, at miR-1228 * hæmmer NF-KB-aktivering og potentielt undertrykker EMT.

Materialer og metoder

Cell Culture

Humane mavekræft cellelinjer SGC-7901 , AGS og BGC-823 blev indkøbt fra Institut for Biokemi og Cellebiologi (Chinese Academy of Sciences). En normal gastrisk epitelcelle line GES-1 blev købt fra Beijing Institute for Cancer Research. Disse celler blev holdt ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i RPMI-1640 (SGC-7901 og BGC-823), F-12K (AGS) eller DMEM (GES-1) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum [ ,,,0],9], [10].

kliniske prøver

Halvtreds par mavekræft og tilstødende ikke-cancer vævsprøver blev opnået fra patienter, som gennemgik kirurgisk resektion på Second Affiliated Sygehus, College of Medicine , Zhejiang University. De matchede ikke-kræft tilstødende væv blev opnået mindst 5 cm fra tumor. Ingen af ​​patienterne havde undergået strålebehandling eller kemoterapi før operationen. Vævsprøver blev opsamlet, snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse [11]. Alle væv blev histologisk bekræftet at være gastriske adenokarcinomer. Undersøgelsen blev godkendt af Second Affiliated Sygehus etiske komité i Zhejiang University College of Medicine. Den underskrevne informerede samtykke blev opnået fra alle deltagere eller fra patientrepræsentanter hvis der ikke kunne opnås direkte samtykke.

RNA Extraction og Real-time PCR

Total RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler eller væv under anvendelse af TRIzol (Invitrogen), og koncentrationen af ​​total RNA blev bestemt. Syntese af cDNA og realtids-PCR blev udført under anvendelse af TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) og TaqMan MicroRNA Assay Kit (Applied Biosystems), hhv. Real-time PCR blev udført på et Applied Biosystems StepOnePlus ™ Real-Time PCR System ifølge protokollen. Ekspressionsniveauet af MIR-1228 * blev normaliseret til RNU6B. Real-time PCR-reaktioner blev udført tre gange. Den relative ekspression af miRNA blev beregnet under anvendelse af komparativ Ct-metoden [12].

tumorinokulation Assay i nøgne mus Salg

BALB /c athymiske nøgne mus i en alder af 4 uger blev fremskaffet fra Shanghai Laboratory Animal center (Chinese Academy of Sciences). Alle procedurer, der involverer dyr blev godkendt af Experimental Animal Ethics Committee, College of Medicine, Zhejiang University. MIR-1228 * eller MIR-NC stabil transfektion SGC-7901 celler suspensioner (2,5 x 10

7 celler /ml) i 200 pi serumfrit medium, blev subkutant injiceret i flankerne af nøgne mus, henholdsvis. Tumorvækst blev undersøgt to gange om ugen i 5 uger og tumorvolumen (V) blev overvåget ved måling af længden (L) og bredde (W) af tumoren med passere og beregnet med formlen V = 1/2 (L × B × W) [13].

Cell migration

migrationen evne miR-1228 * eller miR-NC stabil transfektion SGC-7901 celler blev påvist ved anvendelse Transwells (8 mm porestørrelse, Corning). Transbrøndene blev anbragt i 24-brønds plader. Frisk trypsiniseret og vaskede celler blev suspenderet i 100 pi serumfrit RPMI1640 indeholdende 1% føtalt bovint serum. Ca. 1 × 10

5 celler /brønd blev placeret i top kammer i hver indsats. 200 pi RPMI1640 indeholdende 20% føtalt bovint serum blev tilsat til de nedre kamre. Efter inkubering i 24-48 timer ved 37 ° C i en CO 5%

2 befugtet inkubator blev cellerne fikseret med 95% absolut alkohol og farvet med krystalviolet [14]. Cellerne i det indre kammer blev fjernet med en vatpind og cellerne fastgjort til undersiden af ​​membranen blev talt og afbildet under et omvendt mikroskop ved × 200 forstørrelse over fem tilfældige felter i hver brønd. Hvert eksperiment blev udført tre gange.

Western Blot

Total proteiner blev målt under anvendelse af BCA-kit (Pierce) ifølge producentens protokol. Proteinerne af celler blev fraktioneret ved elektroforese på 12% SDS-polyacrylamidgel og elektro-blottet til nitrocellulose (NC) membraner i 2,5 timer ved 200 V. NC-membraner blev inkuberet med blokeringspuffer i 1 time ved stuetemperatur, efterfulgt af behandling natten over med det primære antistof ved 4 ° C, og derefter med et HRP-konjugeret sekundært antistof (MBL). Efter vask blev detekteret de reaktive bånd ved anvendelse af et ECL Western blot-detektion kit (Millipore) ifølge producentens instruktioner. Antistoffer anvendt i dette forsøg var kanin-monoklonalt anti-E-cadherin (Epitomics), anti-vimentin (Epitomics), anti-β-catenin (Epitomics), anti-snail (Cell Signaling), anti-Slug (Cell Signaling), anti -ZEB1 (Cell Signaling), anti-ZEB2 (Santa Cruz), anti-CK2A2 (Santa Cruz) og muse-anti-GAPDH (KangChen Biotech).

Immunhistokemi

Paraffinsnit, 3- um i tykkelse, blev bagt i 2 timer ved 60 ° C og afparaffineres. Antigen genfinding blev udført under anvendelse citrat natrium (pH 7,2) ved 95 ° C i 15 minutter og derefter Objektglassene blev afkølet ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter at være blevet behandlet med 3% hydrogenperoxid i 15 minutter for at blokere endogen peroxidase blev sektionerne behandlet med normalt gedeserum begrænse væske i 30 minutter for at reducere ikke-specifik binding og derefter kanin-polyklonalt anti-E-cadherin (Santa Cruz) eller kanin monoklonalt anti-vimentin (Epitomics) inkuberet sektionerne i 12 timer ved 4 ° C. Efter genopvarmning i 1 time og vask i 5 gange, blev snit inkuberet med sekundært antistof i 30 minutter ved stuetemperatur. Diaminobenzidin blev brugt til farve reaktioner.

Plasmid Byggeri og Cell transfektion

MIR-1228 * ekspressionsvektor (miR-1228 *) eller negative kontrol (miR-NC) blev konstrueret ved kloning af annealede oligonukleotider, der indeholdt den optimerede miR-1228 * hårnåle-(oligonukleotider blev designet som: top-streng, 5′-TGC TGG TGG GCG GGG GCA GGT GTG TGG TTT TGG CCA CTG ACT GAC CAC ACA CCC CCC CGC CCA C-3 ‘ ;. nederste streng, 5’- CCT GGT GGG CGG GGG GGT GTG TGG TCA GTC AGT GGC CAA AAC CAC ACA CCT GCC CCC GCC CAC C-3 ‘) eller negativ kontrol stem-loop i pcDNA6.2-GW /EmGFP vektor ( Invitrogen) [15]. Det 2 kb MIR-1228 * promotorregionen blev amplificeret (Primere blev designet som: forward, 5’-ATC TAG GGT ACC CTC ACT TGG AG CCA CAC AGA-3 ‘; revers, 5’-GAC TGA AGA TCT ACC TCA AGA GTT GGG GTG TG-3 ‘.), og coloned til pGL3-Enhancer Vector (Promega) [16], navngivet som pGL3-miR-1228 * -promoter. Den tomme pGL3-Enhancer Vector fungerede som en negativ kontrol (pGL3-kontrol). MIR-1228 * målområdet af CK2A2 3’UTR sekvens blev kemisk syntetiseret af Shanghai Biotech og indsat nedstrøms for pMIR-RAPPORT luciferase plasmid (Applied Biosystems), navngivet som pMIR-CK2A2. Preceiver-c-Rel ORF klon med GFP-tag blev købt fra GeneCopoeia. For at generere stabile transficerede celler, blev det MIR-1228 * og MIR-NC ekspressionskonstruktioner transficeret i SGC-7901 cellelinie ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Efter 48 timer, blasticidin (14 ug /ml) blev tilsat til mediet. Den pGL3-miR-1228 * -promoter /kontrol, GFP-c-Rel /kontrol, pMIR-CK2A2 /kontrol eller NF-KB-reporter vektor (Promega) blev kortvarigt transficeret ind i SGC-7901 celler ved hjælp af Lipofectamine 2000, pRL-TK ( Promega) blev anvendt som intern normalisering [17].

Luciferase reporter assay

Luciferase reporter assay blev udført i SGC-7901 celler. Cellerne blev vasket med PBS to gange og lyseret i Passive Lysis Buffer (Promega), og de luciferaseaktiviteter blev målt fra 20 pi lysat under anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) på GloMax 20/20 luminometer (Promega). Alle data blev opnået ved at tage gennemsnittet af resultaterne fra mindst tre uafhængige gentagelser.

Statistisk analyse

Forskelle mellem ekspressionsniveauerne af den miR-1228 * i mavecancerpatienter blev bestemt ved Wilcoxon undertegnet-rank test. De kliniske data blev analyseret ved anvendelse af chi-square test. T-test og ANOVA blev anvendt til at analysere de

in vitro

og

in vivo

data. Alle

P

værdier var tosidede og forskelle blev defineret som statistisk signifikant for

P

0,05. Resultater blev analyseret ved anvendelse af SPSS V.16.0 software (SPSS Inc). * P 0,05, ** P 0.01.

Resultater

MIR-1228 * er ofte nedreguleret i Human Gastric Cancer

For det første, at afgøre, om miR-1228 * udtrykkes differentielt i menneskets primære gastriske cancere, blev ekspressionsniveauet af det modne mIR-1228 * undersøgt under anvendelse af TaqMan real-time PCR i 50 par af humane gastriske cancer væv og parvist sammensat tilstødende noncancerous gastriske væv. Vores resultater viste, at ekspressionsniveauet af MIR-1228 * blev signifikant reduceret i gastrisk cancer væv i sammenligning med de tilstødende noncancerous gastriske væv (fig. 1A). Omkring 72% af tumorprøver var lavere udtrykkes med MIR-1228 * (fig. 1B). Brug 2

-ΔΔCT værdier, fold skift af miR-1228 * 1.0 blev betragtet som lav, mens det 1,0 blev betragtet som høj ekspression [18]. MIR-1228 * ekspression blev også evalueret i gastrisk cancer cellelinjer og en udødeliggjort normal gastrisk mucosal epitelial cellelinje (GES-1). Som vist i fig. 1C, miR-1228 * var signifikant lavt udtryk i alle cancer cellelinjer sammenlignet med GES-1. Tilsammen disse resultater giver stærke beviser for, at miR-1228 * blev nedreguleret i mavekræft.

(A) I humane mavekræft væv sammenlignet med parrede tilstødende noncancerous (normale) gastrisk væv, den miR-1228 * blev nedreguleret. Udtrykket af miR-1228 * blev analyseret ved real-time PCR og normaliseret til RNU6B. Resultaterne vises på en logaritmisk skala. De statistiske forskelle mellem prøver blev analyseret med Wilcoxon-test (n = 50). (B) Relativ ekspression af MIR-1228 * i 50 gastriske cancervæv sammenlignet med matchede normale væv. Data er vist som 2

-ΔΔCT værdier. (C) Udtrykket af miR-1228 * i 3 gastrisk cancer cellelinjer og en udødeliggjort normal maveslimhinden epitelial cellelinje (GES-1) blev udført af real-time PCR og normaliseret til RNU6B. Resultaterne er gennemsnit ± SEM, n = 3.

Desuden MIR-1228 * ekspression blev vurderet med hensyn til de klinisk-patologiske karakteristika patienterne. Alle patienter havde ingen fjernmetastaser og alle væv blev histologisk bekræftet med gastriske adenokarcinomer. Alle tilfælde (n = 50) blev stratificeret i to grupper: MIR-1228 * lav ekspression (n = 36) og MIR-1228 * høj ekspression (n = 14). MIR-1228 * lavt udtryk gruppe havde tilbøjeligheder i retning af større tumorstørrelse. Der var imidlertid ingen signifikante relationer mellem miR-1228 * udtryk og andre clinicopathologic funktioner såsom alder, køn, histologisk type eller TNM stadie (tabel 1).

Øget miR-1228 * Expression Undertrykker xenograft tumordannelse

for at vurdere funktionel rolle mIR-1228 * i gastrisk cancer, den optimerede mIR-1228 * hårnåle-blev klonet i pcDNA6.2-GW /EmGFP vektoren. Gastrisk cellelinie SGC-7901-celler blev transficeret med pcDNA6.2-GW /EmGFP-MIR-1228 * eller pcDNA6.2-GW /EmGFP-NC vektor- og stabile cellelinjer blev frembragt og betegnet MIR-1228 * eller MIR-NC, henholdsvis. Som forventet viste RT-PCR-analyse, at miR-1228 * stabile celler havde en stigning af moden miR-1228 * udtryk, når man sammenligner med miR-NC stabile celler (Fig. 2A). Der var ingen morfologisk ændring i MIR-1228 * stabile-transficerede celler sammenlignet med ikke-transficerede celler. SGC-7901 celler med eller uden transfektion af miR-1228 * blev implanteret subkutant i flankerne af nøgne mus for at vurdere de potentielle virkninger af miR-1228 * om gastrisk kræft vækst

in vivo

. Overekspression af MIR-1228 * undertrykte signifikant tumorvæksten (fig. 2B). Ved udgangen af ​​forsøgsperioden, størrelsen og vådvægt af tumorer med MIR-1228 * overekspression var signifikant mindre og lavere end den for kontrolgruppen (Fig. 2C-D). dataene angiver således, at miR-1228 * hæmmer xenograft tumorvækst af gastriske kræftceller

in vivo

.

(A) miR-1228 * var mere end ti-fold ændringer i miR- 1228 * stabil transficeret SGC-7901 i forhold til NC. Resultaterne er gennemsnit ± SEM, n = 3. (B) Øget MIR-1228 * ekspression undertrykker xenograft tumorvækst. Stabil transfektion af SGC-7901 celler med MIR-1228 * eller MIR-NC blev injiceret subkutant i nøgne mus. Volumenet af hver tumor blev målt to gange om ugen. Den gennemsnitlige mængde af tumorer udviklet i nøgne mus er vist som middelværdier ± SEM, n = 6 pr behandlingsgruppe. De statistiske forskelle mellem prøver blev bestemt ved to-vejs ANOVA. (C) i forhold til kontrol, xenotransplantaterne med miR-1228 * overekspression var betydeligt mindre. Musene blev aflivet 5 uger efter inokulering. To grupper ‘fotografi af tumorer er vist. (D) Tumorer fra hver gruppe blev vejet umiddelbart efter fjernelse. Tumoren vægt er angivet som middelværdier ± SEM, n = 6.

NF-KB-aktivering er ansvarlig for den nedre Expression af miR-1228 * i Gastric Cancer

Nyt arbejde har viste, at de fleste miRNA har transkriptionsfaktor (TF) bindingssteder og mange undersøgelser har rapporteret, at miRNA kunne reguleres af TF’er [19]. Her udnyttede vi bioinformatiske programmer (Promoter 2.0 og P-match) til at identificere potentielle regulatorer af miRNA-1228 * [16], [17]. Vi fandt tre c-Rel bindende domæner i 2-kb MIR-1228 * promotorregionen (fig. 3A). Da c-Rel underenheden er medlem af NF-KB familie og hyperaktivering af NF-KB-aktivitet har vist sig at være forbundet med gastrisk cancer [20], [21]. Vi antager, at NF-KB-aktivering tilskrives nedregulering af MIR-1228 * i gastrisk cancer.

(A) Skematisk fremstilling af MIR-1228 * promotorregionen (de sorte pilespidser er c-Rel binding domæner), jo lavere er den pGL3-mIR-1228 * -promoter konstrukt. (B) 24 timer efter transfektion med pGL3-MIR-1228 * -promoter eller pGL3-kontrol blev SGC-7901 celler stimuleret med eller uden TNF-α og /eller PDTC i 8 timer, derefter relativ luciferaseaktivitet blev målt. Luciferaseaktiviteten blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet udtrykt af pRL-TK og derefter sammenlignet med den relative luciferase niveau af pGL3-kontrol. *

P

0,05 sammenlignet med kontrol.

#

P

0,05 sammenlignet med TNF-α-behandlede gruppe. (C) SGC-7901 celler blev co-transficeret med pGL3-miR-1228 * -promoter /pGL3-kontrol og GFP-c-Rel /GFP-kontrol, og den relative luciferase udtryk blev fundet 48 timer senere. Luciferaseaktiviteten blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet udtrykt af pRL-TK og derefter sammenlignet med den relative luciferase niveau af GFP-kontrol. Data blev udtrykt som middelværdi ± SEM, n = 3.

For at bevise vores hypotese, vi skabt en luciferase konstruere med miR-1228 * promoter region og evalueret sine aktiviteter som svar på NF-KB-aktivering. Et forsøg blev udført ved dyrkning af SGC-7901 celler i 8 timer i nærvær af TNF-α (50 eller 100 ng /ml, klassiske NF-KB-vejen aktivator) og /eller pyrrolidindithiocarbamat (PDTC, 100 uM), et meget anvendt inhibitor af transkriptionsfaktoren NF-KB [22]. SGC-7901-celler blev transficeret med pGL3-MIR-1228 * -promoter eller pGL3-kontrol, 24 timer senere, transficerede SGC-7901 celler blev udsat i 8 timer til TNF-α med eller uden PDTC at undersøge, om NF-KB-aktivering regulerer mIR-1228 * promotoraktivitet. Vi observerede, at TNF-α behandling markant inhiberet MIR-1228 * promotoraktivitet og inhibering af NF-KB med PDTC forhindrede TNF-α-medieret nedregulering af aktivitetsniveauerne (fig. 3B), hvilket antyder, at NF-KB negativt kan regulere miR- 1228 * ekspression. For yderligere at bestemme, om NF-KB-underenhed c-Rel er ansvarlig for deregulere MIR-1228 *, transficerede vi SGC-7901 celler MIR-1228 * -promoter med eller uden GFP-c-Rel og observeret et signifikant fald i luciferaseaktivitet i GFP -c-Rel gruppe end kontrol (fig. 3C). Kollektivt, data tyder på, at NF-KB underenheder c-Rel funktionelt bidrager til nedregulering af miR-1228 * i mavekræft.

MIR-1228 * Undertrykker NF-KB aktivitet og CK2A2 Expression i SGC-7901

for at undersøge indflydelsen af ​​mIR-1228 * på NF-KB-signalvejen, blev NF-KB reporterkonstruktioner transficeret ind enten mIR-1228 * eller mIR-NC stabil transficeret SGC-7901-celler og aktiviteten af NF-KB luciferase blev bestemt efter 48 timer. Vores resultater viste, at aktiviteten af ​​NF-KB blev signifikant reduceret ved overekspression af MIR-1228 * (fig. 4A), hvilket indikerer en negativ feedback loop mellem MIR-1228 * ekspression og NF-KB-aktivitet. For yderligere at identificere nedstrøms mål for MIR-1228 * i NF-KB-vejen, udførte vi bioinformatik analyse og fundet CK2A2 var en af ​​de putative målgener, der blev forudsagt. Brug Miranda og RNA22 [23], [24], vi ligger en potentiel bindingssted for miR-1228 * på 3’UTR af CK2A2 (fig. 4B). CK2A2 er en underenhed af protein kinase CK2 som er involveret i NF-KB-vejen [25], [26] og er blevet observeret sit udtryk skal opreguleret i flere kræftformer, herunder gastrisk kræft [27], [28]. Yderligere undersøgelser på sammenhængen mellem CK2A2 og miR-1228 * vist, at protein niveauer af CK2A2 var samtidigt nedreguleret på miR-1228 * stabil overekspression i SGC-7901-celler (Fig. 4C). For at kontrollere, om CK2A2 er en sand mål for miR-1228 * blev et segment af CK2A2 3’UTR indeholder det bindingssted klonet ind i 3’UTR af luciferasegenet i pMIR-RAPPORT plasmid [29]. Fluorescensintensiteten af ​​reportergenet blev signifikant reduceret i den gruppe, der var co-transficeret med pMIR-CK2A2 og MIR-1228 * sammenlignet med kontrollen (Fig. 4D). Disse resultater antydede, at miR-1228 * interagerer med CK2A2 mRNA 3’UTR.

(A) SGC-7901-miR-1228 * og SGC-7901-miR-NC blev transficeret med NF-KB-reporter konstruere henholdsvis. 48 timer efter transfektion blev luciferaseaktiviteten målt. Luciferaseaktiviteten blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. Resultaterne er gennemsnit ± SEM, n = 3. (B) Skematisk diagram af det formodede bindingssted MIR-1228 * i CK2A2 forudsagt af Miranda. (C) Western blot-analyse afslørede, at protein niveau af CK2A2 i MIR-1228 * stabil overekspression SGC-7901 celler signifikant var faldet i forhold til MIR-NC. Niveauet af GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (D) MIR-1228 * reducerede signifikant luciferase læsning når cotransficeret med pMIR-CK2A2 3’UTR plasmid, hvilket indikerer interaktion mellem MIR-1228 * og CK2A2 3’UTR på dette sted. Luciferaseaktiviteten blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet udtrykt af pRL-TK. Data blev udtrykt som middelværdi ± SEM, n = 3.

MIR-1228 * Forhindrer EMT

Det er blevet rapporteret, at aktivering af NF-KB spiller en afgørende rolle i EMT for cancer progression [30], [31], og inhibering af NF-KB-aktivitet i nogle tumorcellelinier forårsagede en tilbageførsel af EMT [32]. Siden miR-1228 * synes negativt regulerer NF-KB-aktivitet, vi derfor undersøgt, om miR-1228 * kunne også negativt regulere EMT i mavekræft. Western blot viste, at overekspression af MIR-1228 * i SGC-7901 celler nedreguleret mesenchymal markører (vimentin, β-catenin, snegle, Slug, og ZEB1 /2), mens opreguleret epithelial markør E-cadherin (fig. 5A ). Endvidere MIR-1228 * overekspression forårsagede et fald på cellemigrering (fig. 5B-C). Immunohistokemisk farvning blev ansat til yderligere at bekræfte EMT-relaterede proteiner ændringer af miR-1228 * transfekterede SGC-7901 celler i xenograft model. Det blev vist, at ekspressionen af ​​vimentin faldt og ekspressionen af ​​E-cadherin øget sammenlignet med hvilke i kontrolceller (fig. 5D). De lignende fund blev observeret i en anden mavekræft cellelinje AGS (fig. S1). Dataene giver den første bevis på, at MIR-1228 * restaurering i gastrisk cancer negativt regulerer EMT.

(A) Western blot-analyse af epitelial markør (E-cadherin) og mesenchymale markører (vimentin, β-catenin, snail , Slug, og ZEB1 /2) i miR-1228 * stabil transficeret SGC-7901 celler og kontrol. (B) Transwell migration assay viste, at SGC-7901 celler stabilt transficeret med miR-1228 * havde lavere vandrende potentiale i sammenligning med miR-NC (× 100). (C) Den relative grad af cellemigrering præsenteres som middelværdi ± SEM, baseret på tre uafhængige forsøg. (D) Ekspression af EMT-relaterede markører i xenograft tumor. Immunhistokemisk farvning angivet faldt Vimentin og øget E-cadherinekspression i miR-1228 * xenograft tumor sammenlignet med kontrolgruppen (× 400).

Diskussion

mavekræft er den fjerde mest almindelige malign tumor verdensplan og i øjeblikket er den næststørste årsag til kræft dødelighed [33], [34]. Selv om den nuværende praksis, der kombinerer kemoterapi eller strålebehandling med kirurgisk resektion i høj grad har øget den samlede overlevelse mavecancerpatienter, den samlede 5-års overlevelse er stadig lav. Gastrisk carcinogenese anses for at være en multifaktoriel og flertrins proces, der involverer aktivering af onkogener og inaktivering af tumorsuppressorgener [35].

miRNA er endogene non-protein-kodende korte RNA’er, der spiller en vigtig rolle i cellulær fysiologi, udvikling og sygdomme ved negativ regulering af genekspression. Analyser af miRNA udtryk profiler har vist, at mange miRNA afvigende udtrykkes og korreleret med tumorigenese, progression, og prognose af forskellige hæmatologiske og solide tumorer, herunder gastrisk kræft [36]. At identificere og belyse de biologiske funktioner af miRNA deregulering i gastrisk kræft kan hjælpe os til bedre at forstå patogenesen af ​​denne dødelige sygdom og giver nye muligheder for at udvikle miRNA-baserede terapier. For eksempel er MIR-221 og MIR-222 blevet vist at være positivt regulerer gastrisk cancer celleproliferation og invasion, hvilket antyder, at vælge inhibering af disse miRNA være gavnligt for gastriske kræftbehandling [37]. miRNA spiller en rolle i ætiologien og patogenesen af ​​forskellige kræftformer ved at målrette en række onkogener eller tumorsuppressorer gener. MIR-21 overudtrykkes i H. pylori-inficerede gastrisk mucosa og gastrisk cancer væv. Tvungen udtryk for miR-21 øger invasiv af gastrisk kræftceller, RECK er det direkte mål for miR-21 [38]. MIR-218 inhiberer invasion og metastase af gastrisk cancer ved at målrette Robo1 receptoren [39]. Ueda et al [40] identificeret 22 opreguleret og 13 ned-regulerede miRNA i mavekræft versus ikke-tumor slimhinde, Lav udtryk for lad-7g og miR-433 og høj ekspression af miR-214 blev forbundet med ugunstige resultat i den samlede overlevelse uafhængig af kliniske kovariater, herunder dybde af invasion, lymfe-node metastase, og scene. MIR-375 er ofte nedreguleret i gastrisk cancer og fungere som en tumorsuppressor at regulere gastrisk cancer celleproliferation potentielt ved at målrette JAK2 oncogenet [10]. Vores anden undersøgelse viste miR-1228 * blev en epitelial kræft-relaterede miRNA (upubliceret). Imidlertid har der kun været få undersøgelser af miR-1228 *. Guled et al [41] viste, at MIR-1228 * blev højt udtrykt i malignt mesotheliom prøver sammenlignet med normale prøver. Men den biologiske funktion af denne miRNA er endnu ikke blevet evalueret. I den foreliggende undersøgelse identificerede vi, at MIR-1228 * blev nedreguleret i mere end 70% af gastrisk cancer prøver sammenlignet med deres nontumor modparter og give eksperimentelt bevis, at det kan fungere som en tumorsuppressor gennem negativt regulerer EMT og inhibering NF -κB aktivitet.

Vores data viste nedregulering af miR-1228 * i mavekræft væv og gastrisk cancer cellelinjer. Forskellige molekylære mekanismer fører til miRNA dysregulering, såsom genetisk mutation, epigenetisk aberration og dereguleret transkriptionel aktivitet [42]. TF’er kunne regulere miRNA udtryk ved at binde til promotorområder, enten fysiologiske eller patologiske sammenhænge [43]. For at undersøge hvordan MIR-1228 * dereguleret i gastrisk cancer, analyserede vi 2 kb promotorregion opstrøms for MIR-1228 * og fundet tre formodede c-Rel bindingsdomæner. Selvom NF-KB er bedst kendt for sin transkriptionsaktivering funktion, seneste arbejde med p65, RelB og c-Rel viste, at NF-KB kan nedregulere specifikke gener [17], [44], [45]. Ved hjælp af en MIR-1228 * promotor-reporter-konstruktionen, der indeholdt 2-kb fragmenter af MIR-1228 * promotor, fandt vi, at NF-KB-vejen aktivator TNF-α faldt MIR-1228 * promotoraktivitet. Og NF-KB inhibitor PDTC bemærkelsesværdigt antagoniserede TNF-α-medieret MIR-1228 * promotor lav aktivitet. Vores data viste også, at c-Rel var i stand til at bindes direkte med miR-1228 * promotor og negativt regulere sit udtryk. Da c-Rel underenheden er medlem af NF-KB-familien, NF-KB-aktivering phenocopied virkningerne af c-Rel i reguleringen MIR-1228 * ekspression, hvilket antyder, at NF-KB-vejen negativt var involveret i nedregulering af MIR-1228 * i gastrisk cancer. Endvidere MIR-1228 * overekspression resulterede også i nedregulering af NF-KB-aktivitet. Derfor er vores data skitsere en dobbelt negativ feedback loop mellem NF-KB og miR-1228 *. Den nøjagtige mekanisme for, hvordan denne negative feedback opstår behov for at blive yderligere undersøgt.

CK2A2 er en underenhed af protein kinase CK2, som er et stærkt konserveret og allestedsnærværende protein serin /threonin kinase. Overekspression af CK2 er blevet observeret i en række af cancere, herunder dem af mælkekirtlen, prostata, nyre, lunge, hoved og hals og mave [27], [46]. Overekspression af CK2 i mælkekirtler transgene mus forårsager hyperplasi og dysplasi, der i sidste ende føre til adenocarcinomer [47]. CK2 blev overudtrykt i hoved og hals pladecellekræft linjer og væv. Knockdown af CK2 underenheder differentielt hæmmet kBa nedbrydning, NF-KB kernelokalisering, phosphorylering, DNA binding, og reporter aktivitet [25]. CK2 spiller en vigtig rolle i Her-2 /neu-signalering, fremme IKB-nedbrydning og NF-KB-aktivering [26]. I denne undersøgelse viste vi, at MIR-1228 * reducerede ekspressionen af ​​CK2A2 på proteinniveauet. Luciferase assay med en reporter indeholdende MIR-1228 * bindende sekvens ved 3’UTR af CK2A2 mRNA foreslog, at MIR-1228 * direkte målrettet mod 3’UTR af CK2A2. Tilsammen indikerer disse data, at undertrykkelsen af ​​NF-KB-aktivitet ved miR-1228 * kan være gennem målrettet CK2A2 udtryk. EMT er nu alle vides at forekomme i en række forskellige sygdomme, herunder udvikling af kræft. Det erkendes, at EMT er en vigtig proces til dannelse diffus histologi og initiere metastase ved at forbedre motilitet af tumorceller [48]. EMT reguleres af forskellige onkogene signalveje såsom AKT og NF-KB [49], [50]. Specifikt aktivering af NF-KB har vist sig at fremme EMT mens inhibering af NF-KB-aktivitet i mesenchymal celle forårsager en tilbageførsel af EMT [30]. Tab af E-cadherin ekspression og forstærkningen af ​​vimentin udtryk anses for at være de vigtigste molekylære markører for EMT [51].