PLoS ONE: SALL4 som Epithelial-Mesenchymale Transition and Drug Resistance Inducer gennem regulering af c-myc i endometriecancer

Abstrakt

SALL4 spiller vigtige roller i udviklingen og progressionen af ​​mange kræftformer. Men den rolle og molekylære mekanisme af SALL4 i endometriecancer forblive undvigende. I den foreliggende forskning har vi vist, at ekspressionen af ​​SALL4 blev opreguleret i endometriecancer og korreleret positivt med tumor stadium, metastaser og ringe overlevelse af patienter. Overekspressionen af ​​SALL4 fremmet invasivitet i endometriecancer-celler, som indikeret ved opregulering af mesenchymale cellemarkør N-cadherin og nedregulering af den epitheliale markør E-cadherin, og invasion assays in vitro. Derudover var der også en stigning i resistens i disse cellemodeller grund af opregulering af ATP-bindende kassette multilægemiddeltransportøren ABCB1 ekspression. Desuden har vi også fundet, at ABCB1 var kritisk for SALL4-induceret lægemiddelresistens. I modsætning hertil SALL4 knockdown restaureret lægemiddelfølsomhed, omvendt EMT, formindsket celle metastase og undertrykte nedregulering af E-cadherin og opregulering af N-cadherin og ABCB1. Desuden viste vi, at SALL4 opreguleret c-myc-ekspression og c-myc var et direkte mål for SALL4 af Chip assay, udtynding af c-myc med siRNA afskaffede SALL4-induceret nedregulering af E-cadherin, opregulering af N-cadherin og ABCB1 , hvilket antyder, at c-Myc var en nedstrøms mål for SALL4 og kræves til SALL4-induceret EMT, invasion og narkotika resistens i endometriecancer-celler. Disse resultater viste, at SALL4 kunne fremkalde EMT og modstandsdygtighed over for antineoplastiske lægemidler gennem regulering af c-myc. SALL4 og c-myc kan være nye terapeutiske mål for endometriecancer

Henvisning:. Liu L, Zhang J, Yang X, Fang C, Xu H, Xi X (2015) SALL4 som Epithelial-Mesenchymale Transition og Drug Resistance Inducer gennem regulering af c-myc i endometriecancer. PLoS ONE 10 (9): e0138515. doi: 10,1371 /journal.pone.0138515

Redaktør: Lu-Zhe Sun, University of Texas Health Science Center, UNITED STATES

Modtaget: April 27, 2015; Accepteret: August 30, 2015; Udgivet: 25 September, 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette projekt blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NSFC nr 81.172.478). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Endometriecancer er den syvende mest almindelige malignitet med næsten 200000 kvinder diagnosticeret på verdensplan hvert år [1]. I Europa er der cirka 9000 kvinder dør af endometriecancer hvert år. Tidlig diagnose og behandling har ingen signifikant effekt på dødeligheden [2]. Kirurgi, kemoterapi og adjuvans strålebehandling er de vigtigste terapeutiske metoder til endometrisk carcinoma. Ikke desto mindre er et mindretal af patienterne er følsomme over for disse behandlinger [3]. Derfor er det bydende nødvendigt at finde nye terapeutiske mål at udarbejde de molekylære mekanismer, der ligger endometrie carcinogenese.

SALL4, et medlem af Sall gen familien, er en transskription faktor. Det er en væsentlig faktor i vedligeholdelsen af ​​pluripotens og selv-fornyelse i embryonale stamceller [4-6]. De tidligere undersøgelser har vist, at SALL4 deltog i regulering af proliferationen af ​​hæmatopoietiske stamceller [7, 8]. SALL4 har vist sig at deltage i vedligeholdelse af kemosensitivitet gennem regulering af ATP-bindende kassette (ABC) drug transportør i leukæmi [8-10]. Den afvigende ekspression af SALL4 blev fundet i mange cancere, herunder kimcelletumorer [11], brystcancer [12], hepatocellulært carcinom [13, 14], gastrisk cancer [15]. Dog er den funktionelle rolle og molekylær mekanisme SALL4 ikke godt kendetegnet ved endometriecancer.

EMT er en grundlæggende biologisk proces, hvor epitelceller gennemgå en dramatisk ombygning af cytoskelettet, mister basal-apikal polaritet og erhverve en øget kapacitet til at metastasere til fjerntliggende organer [16-18]. Myometriske invasion er et af de vigtigste prognostiske faktorer i endometrisk carcinom [19]. Imidlertid har EMT blevet dårligt forstået i endometriecancer i forhold til andre typer af kræft [20].

multiresistens er et almindeligt fænomen i næsten alle kræftformer og en væsentlig hindring for en vellykket kemoterapi [21]. Større mekanismer resistens blev tæt forbundet med ABC multidrug transportører aktiveret. De ABC multidrug transportører såsom ABCB1, ABCC1 og ABCG2 blev anset for at være ansvarlig for størstedelen af ​​narkotika efflux i human cancer [21, 22]. En stigning i ABC transportører udtryk havde noget at gøre med en dårlig prognose i mange typer af kræft. ABCB1, også opkaldt MDR1, var en af ​​de tidligste ABC transportører at identificere. Den høje ekspression af ABCB1 blev fundet i de fleste af endometriecancer væv [23]. Ikke desto mindre nøjagtige rolle for ABCB1 i endometriecancer endnu ikke blevet belyst.

c-myc-onkogenet kodet en evolutionært bevaret grundlæggende transkriptionsfaktor, og ekspressionen af ​​c-myc var almindeligt afvigende i mange cancere [24, 25]. har vist sig, at overekspression af c-Myc at være involveret i differentieringen, initiering og progression i endometriecancer [26]. Mange undersøgelser har vist, at overekspression af c-myc var tæt forbundet med kemoterapi modstand og EMT-processen. Derfor er vi interesserede i at afgøre, om c-myc er involveret i kemoterapi modstand og EMT i endometriecancer.

I den nuværende forskning, vi viste, at SALL4 ekspression blev opreguleret og forbundet med dårlig overlevelse i endometriecancer. SALL4 i endometriecancer celler ikke kun inducerede erhvervelsen af ​​egenskaberne af EMT, men også fremmet migration og invasion gennem aktivering af c-myc. Derudover fandt vi også, at c-myc tjente som et direkte mål gen af ​​SALL4 og var involveret i SALL4-induceret resistens narkotika ved at regulere ekspressionen af ​​ABCB1. Afslutningsvis disse resultater viser, at SALL4 spiller en vigtig rolle i endometriecancer metastaser og narkotika modstand, med c-myc som en stor nedstrøms mål.

Materialer og Metoder

Patienter og væv

80 endometriecancer prøver og 10 normale endometrie prøver blev opnået fra patienter, som gennemgik kirurgisk behandling 2010-2013 på Shanghai Jiao Tong University Affiliated Shanghai First Folkets Hospital (Shanghai, Kina). Yderligere seks par af frosne nontumorous væv og matchede tilstødende endometriecancer væv blev opnået fra seks patienter på Shanghai First Folkets Hospital fra 2014 til 2015. Ingen patient havde fået neoadjuverende terapi før operationen. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. The Human Investigation Etisk Komité Shanghai First Folkets Hospital Affiliated Shanghai Jiao Tong University godkendt denne undersøgelse.

Cell kultur

endometriecancer cellelinjer RL95-2, Ishikawa, HEC1-A, HEC1-B , AN3CA og KLE blev opnået fra det kinesiske videnskabsakademi Udvalg Type Culture Collection (Shanghai, Kina). Celler blev dyrket i DMEM tilsat 10% føtalt bovint serum

Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført på paraffinindlejrede væv under anvendelse primære antistoffer som følger:. Anti-SALL4 (Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, USA). Til vurdering af ekspressionen af ​​SALL4 blev farvningsintensitet scoret som 3 (kraftig), 2 (middel), 1 (svag), eller 0 (negativ). Graden af ​​farvning blev bedømt som 4 (76% -100%), 3 (51% -75%), 2 (26% -50%), 1 (1% -25%), eller 0 (0%). Summen af ​​omfanget score og intensiteten score blev betragtet som den endelige farvning score. En endelig farvning score ≥ 4 var positiv for ekspression.

Knockdown af SALL4 i AN3CA celler

Den høje SALL4 udtryk endometrialcarcinom cellelinje AN3CA blev brugt til at etablere stabile SALL4 knockdown cellelinje. SALL4-shRNA1 og SALL4-shRNA2 lentivirale plasmider (GenePharma, Shanghai, Kina) blev anvendt til at udføre knockdown eksperiment. AN3CA celler inficeret med en kodet shRNA var hensyn som kontrol. SALL4 knockdown effektivitet blev bekræftet ved Western blotting. Sekvenserne for røræg shRNA og SALL4 shRNAs er opført som følgende: SALL4shRNA1: 5’GCCTTGAAACAAGCCAAGCTA3 «SALL4shRNA2: 5’CTATTTAGCCAAAGGCAAA3«. Og Scr-shRNA: 5’CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG3 ‘

transfektion

Plasmid konstruktion blev udført i overensstemmelse med standardprocedurer. Til kloning af SALL4A (GenBank accession nr. AY172738) og (GenBank nr. AY170621) SALL4B isoformer, polymerasekædereaktion (PCR) primere blev udformet. SALL4A og SALL4B cDNA i en ekspressionsvektor blev syntetiseret fra GenePharma (Shanghai, Kina). Ishikawa-celler blev stabilt transficeret med SALL4A eller SALL4B. Sekvenserne for c-Myc siRNA: Sense: 5′-GGACUAUCCUGCUGCCAAGdTdT-3 ‘, antisense: 3′-DTDT CCUGAUAGGACGACGGUUC-5’. Sekvenserne for ABCB1 siRNA: Sense: 5′-AGAGAAGAAACCAGUGGUC-3 ‘, antisense: 5′-GACCACUGGUUUCUUCUCU-3’. Ifølge protokollen fra fabrikanten, blev siRNA transficeret ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Western blotting

Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [27]. Kort fortalt blev proteiner ekstraheret fra dyrkede celler og separeret ved SDS-PAGE. Proteiner af interesse blev bestemt ved anvendelse tilsvarende specifikke antistoffer efter overførsel til PVDF-membraner. Følgende antistoffer blev anvendt til analyse: antistof mod c-Myc (Polyklonalt, Cell Signaling (Beverly, MA, USA), D84C12), anti SALL4 (muse monoklonale, Santa Cruz Inc, SC-101.147) og anti-ABCB1 ( mus monoklonalt, Santa Cruz Inc, SC-55.510). Anti-E-cadherin (polyklonalt kanin, ab53226), anti-N-cadherin (polyklonalt kanin, ab18203) og GAPDH (Rabbit monoklonale, ab181603) blev erhvervet formular Abcam (Cambridge, UK).

Kvantitativ RT- PCR

Ifølge producentens anvisninger blev totalt RNA fremstillet under anvendelse TRlzol (Invitrogen) og revers transkriberet som beskrevet tidligere [28]. Primere til ABCB1, E-cadherin, N-cadherin, c-Myc og GAPDH-generne blev syntetiseret fra Invitrogen Bioengineering Corporation (Shanghai, Kina). QRT-PCR-reaktioner blev sat op med 2 pi cDNA template, 10 pi SYBR Green PCR Master Mix og 1 pi primer blanding. PCR-betingelserne var 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cykler af 94 ° C i 1 min, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 45 s.

chromatin immunoprecipitation Salg

Ifølge producentens protokol blev chippen assay udført ved anvendelse af chip-IT kit (Active Motif). Chromatinimmunoprecipitated DNA blev underkastet PCR-amplifikation for SALL4 bindingssted i promotoren af ​​c-Myc. Specifikke c-myc-primere er som følger: fremad: 5′-TCAAGAGGCGAACACACAAC-3 ‘; omvendt: 5’-GGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3 ‘. PCR-produktet (c-Myc: 110bp). Blev opløst ved elektroforese i en 1% agarosegel og visualiseret ved ethidiumbromidfarvning

Cellelevedygtighed assay

En anden koncentration af carboplatin (0, 20, 40 og 60 ug /ml) behandlede celler udpladet i plader med 96 brønde. Celletælling Kit-8 (Dojindo, Japan) blev anvendt til at vurdere cellernes levedygtighed efter behandling med carboplatin i 24 timer. Absorbansen blev undersøgt ved 450 nm gennem en mikropladelæser.

Colony dannelse assay

Om 10

3 celler blev udsået i en seks-brønd kultur plade. Celler blev fikseret med 10% formaldehydopløsning og farvet med 10% Giemsa efter behandling med 20 ug /ml carboplatin ved 37 ° C inkubator i 10 dage. Antallet af kolonier indeholdende 50 celler blev talt under et mikroskop

sårheling assay

En ridse blev trukket ind i cellen lag efter 24 timers inkubation i en 6-brønds plade. . Fotografier blev taget ved 0 timer og 48 timer for at måle migration. Afstanden migration celler blev undersøgt.

Cell invasion assay

1 × 10

5-celler blev podet i det øvre kammer af 24-brønds transwell-plader (Corning, NY, USA) overtrukket med BD matrigel basalmembranmatrix med serum-frit medium. DMEM /F12 suppleret med 10% føtalt bovint serum blev tilsat til det nederste kammer. Efter inkubering i 16 timer blev invasive celler talt under et mikroskop. Alle prøver blev belagt i tre eksemplarer.

statistiske analyser

Alle data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse. Statistisk signifikans blev analyseret ved t-test. Chi square test for 2 × 2 tabeller blev anvendt til at sammenligne kategoriske data. Værdien af ​​P 0,05 blev betragtet som signifikant. Alle forsøg blev udført tre gange.

Resultater

Udtrykket af SALL4 opreguleres og forbundet med dårlig overlevelse i endometriecancer

For at identificere funktionen af ​​SALL4 i endometriecancer, vi først vurderede udtryk for SALL4 i seks friske nontumorous væv og matches tilstødende endometriecancer væv. Som vist i fig 1A, SALL4 ekspression i endometriecancer væv var signifikant højere end den, nontumorous væv (P 0,05). Udtrykket af SALL4 i 80 endometriecancer væv og 10 normale endometrie væv blev undersøgt gennem immunhistokemi. Vi fandt, at SALL4 var højere i endometriecancer (56/80) sammenlignet med normale endometriske væv (0/10) (Fig 1B, S1 tabel). Forskellen var statistisk signifikant i de to grupper (P 0,01). Sammenhængen mellem ekspression af SALL4 og klinisk-patologiske karakteristika var viste i tabel 1. Vi viste, at en øget SALL4 udtryk i endometriecancer var signifikant associeret med lymfeknude metastaser (P = 0,048), tumor stadie (P = 0,001), myometrisk invasion ( P = 0,007) og ringe overlevelse (fig 1C). Som konklusion viser disse resultater, at SALL4 ekspression i endometriecancer er tæt relateret til ringe overlevelse af patienter.

(A) Ekspressionen af ​​SALL4 i endometriecancer væv og nontumorous væv blev vurderet gennem western blotting. (B) Billederne viste immunhistokemisk farvning af SALL4 i normale endometrium og endometriecancer væv (00D7200). (C) Kaplan-Meier analyse viste, at ekspressionen af ​​SALL4 var forbundet med dårlig overlevelse af patienter.

SALL4 inducerer EMT og invasive fænotype i endometriecancer celler

Vi ønskede at undersøge, om SALL4 var involveret i EMT og metastase blandt endometriecancer celler blev SALL4 udtryk beregnet til at vælge passende cellelinier for vores forskning i endometriecancer cellelinjer: AN3CA KLE, HEC1-B, HEC1-A, RL-952 og Ishikawa. Som vist i figur 2A viste AN3CA og KLE celler indlysende mesenchymale fænotype, men Ishikawa og RL-952 celler viste tilsyneladende epiteliale karakteristika (S1 Fig). Ekspressionen af ​​SALL4 var forbundet med epitel /mesenkym karakteristika i disse endometriske cancercellelinier. Celler i forbindelse med relativt stærke mesenchymal karakteristika viste en høj SALL4 ekspression. To shRNAs specifikt rettet mod både SALL4A og SALL4B blev brugt til at banke ned endogen SALL4 i AN3CA celler med relativt højere udtryk SALL4. Knockdown af SALL4 proteinniveauer i AN3CA celler førte til forøget protein og mRNA-niveauer af epitel etiket E-cadherin og faldt den for mesenchymale markør N-cadherin, ledsager med celler morfologisk overgang fra en spredt spindelformet mesenkymale udseende til en runde, tætpakkede morfologi (fig 2B, 2C og 2D). Desuden knockdown af SALL4 (fig 2E og 2F) i AN3CA celler svækkede cellemigration og invasion evne. Tværtimod blev Ishikawa celler med lav endogen niveau af SALL4 transficeret med SALL4A og SALL4B cDNA vektor (Kontrol vektor). Overekspression SALL4 førte til en morfologisk ændring fra en tæt pakket, rund morfologi til en spindel-formet spredte morfologi i Ishikawa-celler, mindske protein og mRNA-niveauer af epitel etiket E-cadherin og øge det færdige mesenchymale markør N-cadherin (fig 2B , 2C og 2D). Overekspression af SALL4 dramatisk øget migration og invasion evne Ishikawa-celler (Fig 2E og 2F). Kort fortalt antyder disse data at SALL4 inducerer EMT og metastase i endometriecancer-celler

(A) N-cadherin, E-cadherin blev SALL4A og SALL4B vurderes ved western blotting i endometriske cancercellelinier:. AN3CA KLE, HEC1-B, HEC1-A, RL-952 og Ishikawa. (B) Cell morfologi blev undersøgt i Ishikawa-celler transficeret med SALL4A eller SALL4B ekspressionsvektor og AN3CA celler transficeret med SALL4-SH1 eller SALL4-SH2. (C) (D) Proteinet og mRNA-niveauer af E-cadherin og N-cadherin blev analyseret i Ishikawa-celler transficeret med SALL4A eller SALL4B ekspressionsvektor og AN3CA celler transficeret med SALL4-SH1 eller SALL4-SH2. (E) Cell migration og invasion af Ishikawa eller AN3CA blev undersøgt gennem sårheling assay og transwell invasion assay. (F) Graden af ​​migration og invasion i Ishikawa og AN3CA celler blev analyseret. * P. 0,01

SALL4 drev kemoterapeutiske resistens i endometriecancer celler

Lægemiddelresistens er en væsentlig hindring, der påvirker den samlede overlevelsesraten for avancerede og tilbagevendende endometrie kræftpatienter. Vi forsøgte at teste om SALL4 i endometriecancer celler deltog i mediere cellulær resistens over for kemoterapeutiske lægemidler. Det blev afsløret ved celleviabilitetstest at en stigning i cellelevedygtighed efter udsættelse for carboplatin var meget mere udtalt i Ishikawa-celler transficeret med enten SALL4A eller SALL4B end i celler transficeret med tom vektor (fig 3A). I mellemtiden var overekspression SALL4 i rollen som celleproliferation undersøgt gennem klon dannelse assay i Ishikawa-celler behandlet med 20 ug /ml carboplatin. Ishikawa celler transficeret med SALL4A eller SALL4B de viste forøget carboplatin modstand og celleproliferation sammenlignet med kontrol (Fig 3B). Tværtimod celleviabilitetstest og klon dannelse assay indikerede, at knockdown af SALL4 væsentligt reduceret resistens over for carboplatin i AN3CA celler (Fig 3A og 3B). Sammenfattende indikerer disse resultater, at SALL4 inducerer resistens i endometriecancer-celler.

(A) Ishikawa-celler transficeret med SALL4A eller SALL4B ekspressionsvektor og AN3CA celler transficeret med SALL4-SH1 eller SALL4-SH2 blev behandlet med angivne koncentrationer af carboplatin, og celleviabilitetstest blev udført. (B) Ishikawa-celler transficeret med SALL4A eller SALL4B ekspressionsvektor og AN3CA celler transficeret med SALL4-SH1 eller SALL4-SH2 blev behandlet med carboplatin, blev klon dannelse assay udføres. ** P 0,01, * P. 0,05

ABCB1 er kritisk for SALL4-induceret resistens narkotika

De fleste af resistens i human cancer er forbundet med ATP-bindende kassette (ABC) multidrug transportører. Det er ikke klart, om ABCB1 er involveret med SALL4-induceret kemoterapi modstand og en nedstrøms target gen direkte reguleret af SALL4 i endometriecancer. Det blev afsløret ved western blotting, at SALL4 opregulering i SALL4A- eller SALL4B-transficerede Ishikawa-celler signifikant forøgede protein ekspression af ABCB1 sammenlignet med tom vektor (fig 4A). Et lignende SALL4 knockdown eksperiment blev sat i kraft i AN3CA celler. Som vist i fig 4A, kunne SALL4 silencing tilsyneladende formindske ABCB1 proteinekspression. Disse data viste, at SALL4 kunne opregulere udtryk for ABCB1. Fordi ABCB1 (MDR1) var afgørende for lægemiddelresistens og opreguleret i endometriecancer, vi ønskede at afgøre, om ABCB1 var involveret i SALL4-induceret resistens stof. Vi yderligere lyddæmpet ABCB1 ekspression ved specifik siRNA i Ishikawa-celler overudtrykker SALL4, og fandt, at nedregulering af ABCB1 reduceret SALL4-induceret lægemiddelresistens (Fig 4B og 4C). Nedreguleringen af ​​mRNA og protein niveauer af ABCB1 blev bekræftet ved QRT-PCR og western blotting (Fig 4D og 4E). Tilsammen viser disse data, at SALL4 inducerer kemoterapeutisk resistens gennem regulering af ABCB1 i endometrie kræftceller.

(A) Western blotting viste, at ektopisk overekspression af SALL4 opreguleret ABCB1 proteinekspression i Ishikawa-celler og knockdown af SALL4 i AN3CA celler nedreguleret ABCB1 udtryk. (B) (C) Ishikawa-celler transficeret med SALL4A eller SALL4B vektor eller kontrol vektor blev transficeret med si-ABCB1 eller kontrol siRNA. Drug følsomhed Ishikawa-celler til carboplatin blev undersøgt ved celleviabilitetstest og klon dannelse assay. (D) (E) Proteinet og mRNA-niveauer af ABCB1 blev vurderet ved Western blotting og QRT-PCR. ** P. 0,01

c-myc er nødvendig for SALL4-induceret EMT og lægemiddelresistens

c-myc spiller en vigtig rolle i mange onkogene processer, herunder tumor lægemiddelresistens og metastase. Den tidligere forskning har vist, at SALL4 i endometriecancer celler fremmes c-myc transkriptionel aktivitet [29]. Vi var interesseret i at bestemme, om c-Myc var nødvendig for SALL4-induceret EMT og kemoterapi modstand. I overensstemmelse med den tidligere undersøgelse viste vi, at ekspressionen af ​​c-myc var positivt korreleret med den for SALL4 ved Western blotting, og c-myc var et direkte mål for SALL4 gennem chip assay endometriecancer-celler (Fig 5A, 5B og S2 fig). Vi næste tavshed c-myc-ekspression med siRNA i SALL4A- og SALL4B-transficerede Ishikawa-celler, og viste, at c-Myc nedregulering drastisk reduceret SALL4-induceret celleinvasion og lægemiddelresistens (Fig 5C, 5D og 5E). Protein- og mRNA-niveauer af c-myc blev påvist ved western blotting og QRT-PCR (Fig 5F og 5G). Desuden blev tilbageførsel af den invasive fænotype fremkaldt af c-myc tavshed i SALL4 overekspression i Ishikawa-celler bekræftet ved nedregulering af mesenkymale markør N-cadherin og opregulering af epitelial markør E-cadherin ved western blotting og QRT-PCR (Fig 5F og 5H ). Samtidig, vi fandt også, at c-Myc siRNA behandling signifikant formindsket SALL4-induceret ABCB1 proteinniveau (figur 5F). Disse resultater indikerer, at c-Myc er påkrævet for SALL4-induceret EMT og kemoterapi modstand.

(A) Ekspressionen af ​​c-Myc var positivt associeret med den for SALL4 i Ishikawa og AN3CA celler ved Western blotting-analyse. (B) c-myc var et direkte mål for SALL4 gennem chip-analysen. (C) nedregulering af c-Myc ved specifik siRNA reduceret SALL4-induceret invasion i Ishikawa-celler overudtrykker SALL4 af Transwell assay. (D) (E) nedregulering af c-Myc reducerede SALL4-induceret resistens i Ishikawa-celler overudtrykker SALL4 gennem levedygtighedsassay og klon dannelse assay. (F) Ekspressionen af ​​EMT-relaterede markører og ABCB1 blev bedømt ved western blotting i Ishikawa-celler. (G) (H) mRNA niveauer af c-Myc, E-cadherin og N-cadherin blev påvist gennem QRT-PCR i Ishikawa-celler. ** P. 0,01

Diskussion

Det bliver mere og mere klart, at aggressive tumorceller viser en plastik, multipotent fænotype svarende til pluripotente /stamme-lignende tilstand i embryonale celler og basal-lignende tumorceller [30]. Den embryoniske stamcelle-lignende genekspression signatur har vist sig at være tæt forbundet med dårligt differentieret aggressive humane tumorer og er blevet betragtet som et potentielt mål for fremtidige kræftbehandling [31]. SALL4 er en transkriptionsfaktor, der opretholder pluripotens og selvfornyelse i embryonale stamceller og spiller en vigtig rolle i embryonisk udvikling. Imidlertid er de funktionelle roller og molekylære mekanisme SALL4 i endometriecancer ikke godt karakteriseret.

I den foreliggende undersøgelse, vi demonstreret, at SALL4 ekspression blev opreguleret i endometriecancer og positivt korreleret med dårlig prognose og aggressive egenskaber. Vi viste, at en øget ekspression af SALL4 fremmet metastase af EMT proces samt kemoterapi modstand gennem modulering ABCB1 i endometriecancer-celler. Betydeligt, fandt vi, at en nedstrøms mål for SALL4, c-myc, var uundværlig for SALL4-induceret EMT og udtryk for ABCB1. Disse resultater viste, at SALL4 og c-myc kan være lovende terapeutiske mål i endometriecancer (figur 6).

SALL4 induceret EMT og ABCB1 udtryk, som efterfølgende har bidraget til invasion og kemoresistens i endometrie kræftceller. ABCB1 var afgørende for SALL4-induceret kemoresistens. Derudover SALL4 opreguleret også c-myc-ekspression, som var nødvendig for SALL4-induceret EMT og ABCB1 ekspression. Sammenfattende SALL4-induceret EMT og resistens gennem aktivering af c-myc i endometriecancer.

SALL4 spiller vigtige roller i flere tumor-associerede processer, herunder celle metastase og resistens. Metastase er ikke kun den vigtigste årsag til kræft død, men også de maligne egenskaber for kræft. Kræftceller, der undergår EMT proces vil erhverve invasionsevne og metastase evne. Den foreliggende forskning viste, at SALL4 induceret EMT-relaterede proteiner, herunder et fald i cellulære adhæsionsmolekyler E-cadherin og en stigning i mesenkymal markør N-cadherin. Ekspressionen af ​​E-cadherin og N-cadherin blev tæt forbundet med kræftceller invasive og metastatiske kapacitet. Vores resultater blev understøttet af de tidligere undersøgelser, der viser, at den nedreguleret ekspression af E-cadherin blev signifikant associeret med myometrielle invasion og patientoverlevelse i endometrisk carcinom [32, 33]. De seneste undersøgelser har vist, at SALL4 var involveret i metastaser og progression i kolorektal cancer [34]. Desuden SALL4 overekspression inducerede EMT i gastriske cancerceller, med øget ekspression af Twist1, N-cadherin og nedsat ekspression af E-cadherin [15]. I mellemtiden blev det rapporteret, at SALL4 undertrykte ekspressionen af ​​adhæsion gen CDH1 (E-cadherin), og reguleres positivt af CDH1 suppressor ZEB1 og vedligeholdes celle dispersion i basal-lignende brystcancer [35]. Dette beviser, at der SALL4 kunne inducere EMT og fremme invasion i en række tumorer. Efter aftale med en tidligere undersøgelse [29], fandt vi, at opregulering af SALL4 signifikant øget endometrie migration og invasion kræftceller. Vigtigere, demonstrerede vi at overekspression SALL4 var i stand til at inducere EMT og fremme metastase i endometriecancer-celler.

Kemoterapeutica er den mest effektive behandling af patienter med metastatisk cancer. Men resistens fortsat en alvorlig hindring for en vellykket kemoterapi [21]. Blandt de forskellige mekanismer involveret i kemoterapeutisk modstand, blev ABC transportører menes at være tæt forbundet med resistens. Stærke beviser indikerede, at ABC transportører spillede en vigtig rolle i SALL4-induceret kemoterapeutisk modstand i en række forskellige cancere. For eksempel blev det for nylig rapporteret, at SALL4 var involveret i kemoterapeutisk modstand ved direkte at regulere nedstrøms målgen ABCA3 i akut myeloid leukæmi [10]. Endvidere har nylige rapporter vist, at SALL4 reguleres positivt ekspressionen af ​​ABCA3, påvirker følsomheden over for kemoterapi stof i kronisk myeloid leukæmi [36]. Overekspression af SALL4 førte til en øget celleproliferation associeret med opreguleret udtryk (ATP) -bindende kassette-G2 (ABCG2) i hepatocellulære karcinomer [13]. ABCB1 er prototypen af ​​dette gen superfamilien, og dets deregulering er blevet forbundet med lægemiddelresistens i flere typer af cancere [21]. Beviser havde vist, at ekspressionen af ​​ABCB1 var unormal i endometrie karcinom [23]. Disse resultater fik os til at undersøge, om ABCB1 deltog i SALL4-induceret kemoterapi modstand i endometrie karcinom. I overensstemmelse med den rolle SALL4-induceret resistens narkotika via modulerende ABC transportører i andre kræftformer, fandt vi, at ABCB1 var involveret i SALL4-induceret resistens lægemiddel i endometriecancer. Nedregulering af ABCB1 signifikant blokeret SALL4-induceret resistens. Disse data antydede, at ABCB1 var en vigtig mediator blandt SALL4-induceret resistens lægemiddel i endometriecancer.

Den tidligere undersøgelse har vist, at c-myc induceret EMT i mammae epitelceller [37]. Desuden kan c-myc bidrage til kræftceller kemoresistent fænotype gennem regulering ABC transporter-gener [38]. Det blev rapporteret, at c-Myc kombineret med epigenetiske mekanismer reguleret ABC transportproteiner gener ekspression i CML [39]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at c-Myc var et direkte mål for SALL4 og kræves til EMT og ABCB1 ekspression induceret af SALL4, hvilket fører til metastase og medikamentresistens i endometriecancer-celler. Det blev demonstreret ved tidligere undersøgelser, at højere ekspression af c-Myc var signifikant forbundet med nedsat samlet overlevelse i endometriske carcinoma patienter [40, 41]. Endvidere blev det også rapporteret, at den transkriptionelle aktivitet af c-Myc blev reguleret direkte af SALL4 i endometriecancer-celler [29]. Vores data var i overensstemmelse med den tidligere disse resultater. Men den foreliggende undersøgelse var manglen på data, der er involveret i vurderingen af ​​ekspressionen af ​​ABCB1 og c-myc i endometriecancer prøver. Det ville være mere overbevisende, hvis de data, ekspressionsniveauet af SALL4 var positivt associeret med de ABCB1 og c-myc i en undergruppe af endometriecancer prøver blev suppleret. Sammenfattende c-myc var af afgørende betydning i SALL4-induceret EMT og lægemiddelresistens og kan være et terapeutisk mål for endometrie karcinom.

Samlet set vi demonstreret, at SALL4 ekspression blev opreguleret i endometriecancer og positivt korreleret med dårlig prognose og aggressive egenskaber. Vi identificerede at SALL4 ikke kun induceret EMT, men også øget resistens gennem ABCB1 i endometrie kræftceller. Vi viste desuden, at c-myc var uundværlig for SALL4-induceret EMT og kemoterapi modstand. Afslutningsvis vores undersøgelse forudsat en potentiel molekylære mekanismer relateret til SALL4-induceret invasion og kemoterapi modstand i endometriecancer. SALL4 og c-myc kan være nye terapeutiske mål for endometriecancer.

Støtte Information

S1 Fig. SALL4 inducerer EMT i endometriecancer celler Hotel (A) mRNA niveau af E-cadherin og N-cadherin blev vurderet gennem QRT-PCR i endometriecancer cellelinier:. AN3CA, KLE, HEC1-B, HEC1-A, RL . -952 og Ishikawa

doi: 10,1371 /journal.pone.0138515.s001

(TIF)

S2 fig.