PLoS ONE: Afvigende CCR4 Expression er involveret i Tumor Invasion af lymfeknuder-Negative menneskelige Gastrisk Cancer

Abstrakt

Cellulær kemotaksi er den bedst kendte funktion af kemokinreceptorer som er tæt forbundet med tumor metastase. I virkeligheden kunne positiv ekspression af kemokinreceptorer også identificeres endda i nogle patienter uden metastatiske tumorer, mens den kliniske relevans af disse data ikke er blevet fuldt etableret. Vores undersøgelser var designet til at tydeliggøre CCR4 udtryk profiler og til at udforske dens potentielle rolle i histologisk node-negative (PN0) gastrisk cancer (GC). Immunhistokemi (IHC) eller immunohistofluorescence (IHF) analyse blev udført på prøver taget fra 108 patienter med PN0 GC. Vi fandt, at CCR4 var aberrant overudtrykte inpN0 GC væv, med forskellige ekspressionsmønstre på tumorceller og er forbundet med T-fase (

P

= 0,002). Den matrigel

in vitro

invasion assay viste, at overekspression af CCR4 i GC cellelinier væsentligt forbedret den invasive kapacitet i disse celler. Resultater fra real-time RT-PCR og gelatinzymography viste en betydelig stigning i matrixmetalloproteinase (MMP) -9 produktion induceret af den tvungne ekspression af CCR4 i GC cellelinier. Vore data antyder, at den afvigende CCR4 ekspression er involveret i tumor invasion af PN0 GC og, tænkes, antagonister af CCR4 kan være nyttige kandidater til styring tidlige begivenheder i tumorudvikling

Henvisning:. Yang Y, Du L, Yang X, Qu A, Zhang X, Zhou C, et al. (2015) Afvigende CCR4 Expression er involveret i Tumor Invasion af lymfeknuder-Negative menneskelige Gastric Cancer. PLoS ONE 10 (3): e0120059. doi: 10,1371 /journal.pone.0120059

Academic Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, TAIWAN

Modtaget: September 29, 2014 Accepteret: 3 februar 2015; Udgivet: 19 Mar 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Forfatterne bekræfter at deres data er i manuskriptet og dens aktuelle støtte Information fil

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81.271.916 og 81.301.506), forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelse i Kina (nr 20120131110055), Uafhængig Innovation Foundation of Shandong University (IIFSDU, 2012TS174), Shandong teknologisk udvikling Project (STDP, 2013GSF11859), Natural Science Foundation of Shandong (Grant nr ZR2013HM104) og National Key Clinical Medicinsk Specialties Foundation

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Svarende til de fleste kræftformer, mavekræft (GC) er en meget. aggressiv malignitet som har tendens til at invadere omgivende væv og metastasere til fjerne organer. Selv patienter med lymfeknude-negativ mavekræft har bedre resultater end dem med nodal metastaser [1, 2], hvoraf nogle stadig lidt fra lokale gentagelser eller fjernmetastaser efter kurativ resektion [3-5]. Identifikation effektive faktorer eller nøglemolekyler forbinder med sygdomsprogression i iscenesatte patienter node-negative gastrisk kræft er nødvendige i betragtning af, at disse patienter kan have gavn af adjuverende behandlinger.

Kemotaksis spiller en central rolle i tumor metastase, lede motilitet metastatiske celler gennem gradienter af kemoattraktanter. Især kemokinreceptorerne medierer organspecifik metastase af tumorer ved at interagere med deres matchende chemokiner på målorganer [6]. Gastrisk cancer celler kunne udtrykke forskellige kemokinreceptorer, såsom chemokinreceptor 4 (CXCR4) og chemokinreceptor 7 (CCR7), og co-opt disse molekyler for metastase [7-12]. Andre roller kemokinreceptorer i kræft progression bortset kemotaksi er sjældent afsløret. CCR4, en C-C-type chemokinreceptor, er tidligere blevet fokuseret på dens biologiske funktion i immunopatogenese af hæmatologiske tumorer [13]. Til dato har relativt lidt opmærksomhed blevet betalt til den rolle, CCR4 at fremme metastase af nogle solide tumorer, herunder gastrisk kræft [14-17]. Vores gruppe har vist, at lymfocyt-rige GC’er tendens til at være mere hyppigt positive for CCR4, og fundet en hidtil ukendt rolle af CCR4 i tumorinduceret immunsuppression [18], hvilket indikerer forskellige udtryk profiler af CCR4 i GC væv og multifunktionelle roller dette molekyle i GC progression.

det er velkendt, at invasion er det første skridt, der fører til cancer metastase. Beviser har vist, at nogle chemokinreceptorer, såsom CXCR4 [19] og CCR7 [20], fremme kronisk lymfatisk leukæmi celleinvasion gennem opregulering af MMP-9. For nylig, Yu et al. viste, at CXCR4 kunne fremme cellemigration og invasion ved at inducere ekspression af MMP-9 og MMP-13 i oral pladecellecarcinom [21]. Li og kolleger fandt, at CCR7 var involveret i human invasion coloncancer via opregulering af MMP-9 [22]. Det er ikke klart, imidlertid, om CCR4 også kunne fremme kræft celle invasion.

I betragtning af den brede fordeling af kemokinreceptorer inden tumorer andtheir potentielle roller i tumor invasion og metastase, vi hypotese, at PN0 gastrisk kræftpatienter transporterer visse chemokin receptorer kan være mere tilbøjelige til at opleve yderligere progression. For at teste vores hypotese undersøgte vi udtrykket profiler af CCR4 i gastriske cancerceller af PN0 patienter og dens rolle i mavekræft celle invasion.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

Vævsprøver blev opnået fra 108 patienter (75 mænd og 33 kvinder i alderen 35-71 år, gennemsnitsalder 62 år) med PN0 mavekræft gennemgår kurativ resektion af den primære tumor i Qilu Hospital i Shandong University (Jinan, Kina). Vi brugte ovenfor matchede tilstødende normale mave væv og væv fra 56 gastrisk dysplasi patienter (36 mænd og 20 kvinder i alderen 35-68 år, gennemsnitsalder 48 år) som kontroller. Alle histopatologiske diagnoser og maligne klassifikationer blev bestemt ved ledende patologer på tidspunktet for diagnosen, ifølge World Health Organization International Histologisk klassifikation af tumorer [23], og den postoperative patologiske iscenesættelse blev fastsat på grundlag af Den Internationale Union Against Cancer (UICC) [24 ]. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Qilu Hospital, og skriftligt informeret samtykke fra alle patienter blev også opnået.

Immunhistokemi og immunohistofluorescence

IHC eller IHF blev udført på paraffinsnit bruger antistoffer mod human CCR4 (LS-A351, LifeSpanBioSciences, Seattle, WA, USA) og Anti-pan Cytokeratin (CK) antistof (ab80826, Abcam, Cambridge, MA, USA) ved at følge instruktionerne fra hver fabrikant. Fluorescerende antistoffer omfatter gede-anti-kanin TRITC-konjugerede antistoffer (E031320; Amyjet Scientific, Inc. Wuhan, Kina), ged anti-mus FITC-konjugerede antistoffer (E0312400; Amyjet Scientific, Inc. Wuhan, Kina). Prøverne blev visualiseret og observeret under et fluorescensmikroskop (IX81, Olympus, Tokyo, Japan), og de ICH resultaterne blev analyseret som tidligere rapporteret [18]

Cellekultur

Den humane gastriske. cancer cellelinjer SGC-7901 og BGC-823 blev købt fra Culture Collection af det kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina) og vedligeholdes i RPMI-1640 (HyClone, Logan, UT, USA) suppleret med 10% FBS (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved 37 ℃ i en fugtig atmosfære af 5% CO

2.

Forbigående overekspression af CCR4 i SGC-7901 og BGC-823 celler

Transient transfektion af plasmidet EGFP-CCR4 (CCR4) eller en EGFP-ekspressionsvektor (MOCK) i gastriske cellelinier blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) som tidligere rapporteret [18]. Og transfektionseffektiviteter blev bestemt ved fluorescens mikroskop, real-time revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR) og flowcytometri (FCM), henholdsvis.

Kvantificering af mRNA ved RT-PCR og real time RT -PCR

Totalt RNA blev isoleret fra celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og revers transcriptase reaktioner blev udført med kit ifølge producentens protokol (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland ). For RT-PCR blev primerne og PCR-betingelserne til amplifikation af CCR4 anvendes som tidligere [25] beskrevne. Og menneskelig glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) (fremad primer, 5′-GGTGGTCTC-CTCTGACTTCAACAG-3 ‘; revers primer, 5′-GTTGTTGTAGCCA-AATTCGTTGT-3’) var usedas en intern standard. For real time RT-PCR, blev primere for CCR4, MMP-9 og GAPDH og amplifikationsbetingelserne anvendes som tidligere beskrevet [18, 25, 26].

FCM analyse

Celler blev høstet inkuberet med en phycoerythrin (PE) -konjugeret anti-CCR4 monoklonalt antistof (FAB1567P, R og det fluorescerende fusionsprotein blev lokaliseret på cytoplasmaet og membranen af ​​CCR4 plasmid transficerede celler. Matrigel invasion assay viste, at antallet af EGFP-CCR4-transficerede gastriske cancerceller passerer gennem matrigel var signifikant højere end dem for mock-transficerede gastriske cancerceller (fig. 4D). Den CCK8 assay indikerede, at overekspression af CCR4 havde ingen virkning på gastrisk cancer celleproliferation (S1 Fig).

SGC-7901 og BGC-823-celler blev transient transficeret med tom (MOCK) eller CCR4-udtrykkende vektor (EGFP -CCR4) under anvendelse lipofectamin 2000, og transfektionseffektiviteten blev bekræftet ved et fluorescensmikroskop (a), RT-PCR (B) og FCM (C) ved 24 eller 48 timer efter transfektion hhv. D, celler blev resuspenderet i 200 pi serumfrit RPMI-1640 med en koncentration på 1,5 × 10

5 /ml efter transfektion ved 24 h, og fik derefter lov til at invadere Transwell inserts (8 um porer) coatet med Matrigel for en anden 24h. De celler, der invaderede gennem indsatserne blev talt og fotograferet under et lysmikroskopi ved 200 ganges forstørrelse. Dataene er præsenteret som repræsentative billeder eller som middelværdi ± SD (n = 3 i hver kolonne) fra mere end tre individuelle eksperimenter. Gray-fyldt histogram, CCR4; tom histogram, isotype. Data er præsenteret som repræsentative billeder og gennemsnit ± SD og for tre separate forsøg fra hver gruppe. *,

P

0,05; **,

P

0.01.

CCR4-regulerede MMP-9-produktion i gastrisk kræftceller

For at teste de mulige mekanismer bag CCR4-medieret tumor invasion, vi vurderede effekten af ​​CCR4 på MMP-9 udtryk og aktivitet. Real time RT-PCR-analyse (fig. 5A) viste, at EGFP-CCR4-transficerede gastriske cancerceller udtrykte højere niveauer af MMP-9 mRNA sammenlignet med mock-transficerede celler ved 24 timer efter transfektion. Gelatinezymografi analyse (fig. 5B) viste, at udskillelsen og aktiviteten af ​​MMP-9 var signifikant opreguleret i supernatanterne af EGFP-CCR4-transficerede celler sammenlignet med mock-transficerede celler ved 48 timer efter transfektion, med eller uden tilsætning af exogen CCL22.

A udviste real time RT-PCR, at MMP-9-mRNA-ekspression blev opreguleret i CCR4-transficerede GC-celler sammenlignet med den i mock-transficerede celler ved 24 timer efter transfektion. B, zymogrammer viser gelatine fordøjelse af pro-MMP-9 (92 kd) og aktiv MMP-9 (85 kd). Udskillelsen af ​​MMP-9 var klart opreguleret i supernatanterne af CCR4-transficerede celler sammenlignet med mock-transficerede celler ved 48 timer efter transfektion med eller uden tilsætning af exogent CCL22. Data er præsenteret som repræsentative billeder eller middel ± SD og for tre separate forsøg fra hver gruppe. *,

P

0,05; **,

P

0.01.

Diskussion

Samspillet mellem kemokinreceptorer af kræftceller og deres matchende kemokiner repræsenterer kritiske trin i tumormetastaser. Men resultaterne af vores nuværende studyshowed, at et vist antal af gastrisk kræftpatienter uden lymfe metastaser var også positive for CCR4 farvning. Modsætning til de fleste tidligere undersøgelser af funktioner af kemotaxi medieret af nogle kemokinreceptorer, denne forskning afsløret en hidtil ukendt, invasiv adfærd CCR4.

Kemokinreceptorer tilhører en familie af syv-transmembrane G-protein-koblede receptorer, som er membran proteiner og de funktionelle konsekvenser af kemokinreceptoraktivitet menes generelt at afhænge af stimulering med ekstracellulære ligander [27]. de histologiske prøver af den foreliggende undersøgelse viste imidlertid, at der var tydelige udtryk mønstre for CCR4. CCR4 i ikke neoplastiske celler viste negativ farvning, med kun svag membranfarvning i gastriske dysplasi læsioner. Membran og cytoplasmatisk ekspression af CCR4 hyppigst optrådte i moderat til veldifferentierede tumor reder, medens ekspression i mindre differentierede celler havde tendens til at være begrænset primært til cytoplasmaet. Og flere interessante, som vist på typiske sektioner, tumorceller udviser høje invasive kapacitet, såsom muskel invasion, vaskulær gennemtrængning og nerve invasion, viste ofte en forøget cytoplasmisk ekspression af CCR4. Vores data indikerer en tæt forbindelse mellem cytoplasmatisk CCR4 udtryk mønster og aggressiv adfærd af gastriske kræftceller. Denne konstatering er i modstrid med almindelig antagelse, at det ekstracellulære domæne af en kemokinreceptor nødvendigvis påkrævet i tumormetastase gennem interaktion med dets ligand. Lignende fænomener er blevet observeret med kemokinreceptoren CXCR4, hvis kernelokalisering var forbundet med progressionen af ​​forskellige tumorer [28-30]. Disse data indictate at mavens kræftceller kan invadere nærliggende væv via CCR4 i en ligand-uafhængig måde. Den anden hypotese var, at CCR4 internalisering forårsaget af dets ligand kan repræsentere en mekanisme, der har udviklet sig i den cytoplasmatiske CCR4 udtryk mønster. CCL22 er CCR4 ligand produceret af humane gastriske cancer væv [31], også kendt for at causeCCR4 internalisering fra membran til cytoplasmaet [32, 33], hvilket tyder cytoplasmatisk farvning kan vise aktiveret signalering efter CCR4-CCL22 ligering. Flere undersøgelser er nødvendige for at afsløre de nøjagtige mekanismer bag disse unormale mønstre af kemokinreceptor-ekspression er involveret i tumorudvikling. Derudover langsomt intensiverede ekspression af CCR4 i præmaligne væv, selvom statistisk ubetydeligt højere end i tumor-tilgrænsende normale væv, foreslog, at CCR4 også kan deltage i præneoplastiske stadier af tidlig tumorudvikling.

I vores tidligere undersøgelse fandt vi, at CCR4 blev overudtrykt i GC væv, men vi fandt ikke signifikante forskelle mellem patienter med og uden lymfeknude metastaser [18]. vi den hypotese derfor, at kemokinreceptorer også kan spille en vigtig rolle i cancer udvikling af PN0 patienter. I den foreliggende undersøgelse, viste vores resultater en positiv sammenhæng mellem CCR4 udtryk og T-scenen, som var i overensstemmelse med vores immunhistokemi fund at CCR4 udtryk havde tendens til at stige som dybden af ​​tumor invasion skred frem. Virkningen af ​​CCR4 på gastrisk cancercelleinvasion blev delvist bekræftet ved Transwell celleinvasion assays. Disse assays blev udført under betingelser, hvor ingen eksogen CCR4 receptorligand blev tilsat. Det var muligt, at forskellige mekanismer kan eksistere for at regulere tumorcelleinvasion medieret af CCR4 i et ligand-uafhængig måde i overensstemmelse med fænomenet cytoplasmatiske mønster af CCR4, der var relateret til stærkt invasive opførsel af tumorceller i GC væv. Vi bekræftede, at overekspression af CCR4 var tæt forbundet med en højere grad af tumorindtrængen, hvilket indikerer, at CCR4 overekspression kunne give metastatisk potentiale i GC celler og yderligere fremme tumor progression. Vi hypotese også, at autokrine CCR4 ligander også var involveret i celle motilitet

in vitro

. Koncentrationerne af CCL22 i de kulturelle supernatant GC cellelinier transficeret med eller uden CCR4 var ganske lav som vi evaluerede (data ikke vist). Men muligheden kunne ikke udelukkes, at den autokrine eller parakrin produktion af CCL22 kunne bidrage til tumor invasion via CCL22 /CCR4 akse

in vivo

. CCL17 og CCL22, som med høj affinitet CCR4 ligander, fremstilles ved GC og andre kræft væv. Især CCL22, som fremstilles enten ved cancerceller eller tumorassocierede makrofager, er blevet rapporteret at være involveret i metastasen af ​​flere kræftformer [15-17]. Dette tyder på en mulig autokrin /parakrin loop involverer CCL22 og CCR4 mellem forskellige celletyper.

MMP-2 og MMP-9 er de mest berørte og godt karakteriserede MMP’er med stærke proteolytisk aktivitet i den ekstracellulære matrix (ECM). Konsistensen mellem real time RT-PCR test og gelatinezymografi eksperimenter viste klart, at overekspression af CCR4 i gastriske cancerceller signifikant forøget MMP-9-ekspression og aktivitet. Disse eksperimenter yderligere understreget og angivet dens faktiske rolle i tumor invasion under visse betingelser, med eller uden stimulation af eksogen CCL22. Det antages, at matrix MMP-9 nedbryder type IV-kollagen, som er en væsentlig bestanddel af basalmembranen og er relateret til cancercelleinvasion og metastase hos patienter med gastrisk cancer [34]. Her har vi givet nye spor på den underliggende mekanisme, CCR4 kunne fremme mavekræft celleinvasion ved opregulering af MMP-9. Der er også gjort lignende observationer med hensyn til tumorinvasion via nogle kemokinreceptorer såsom CXCR4 og CCR7 [19, 20, 22]. Og MMP-2, hvis struktur svarede til MMP-9 blev også rapporteret at være forbundet med gastrisk cancer [35]. Vi fandt imidlertid MMP-9, men ikke MMP-2, var et centralt molekyle involveret i CCR4-medieret tumorinvasion, hvilket kan skyldes forskellige co-regulatorer, der interagerer med CCR4 i forskellige mikromiljøer. Selvom MMP-2-ekspression i CCR4-transficerede gastriske cancerceller også syntes at være højere end den i mock-transficerede celler, var forskellen statistisk insignifikant (data ikke vist). Cellelevedygtighed assay viste, at overekspression af CCR4 havde ingen virkning på den gastriske vækst cancercellen

in vitro

, hvilket var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viste de CCR4 ligander kunne ikke inducere celleproliferation [14], således at undgå eventuelt som kan påvirke invasion indeks eller MMP-9 beløb. Disse assays blev udført med eller uden exogent CCL22, med signifikante forskelle i MMP-9-ekspression mellem CCR4 og mock-transficerede celler. Vi spekulere de mulige mekanismer forbedret MMP-9-ekspression ved CCR4-overekspression kunne være delvist skyldes den autokrine eller parakrin udtryk for CCL22

in vivo

. Stadig andre MMP’er, der kan være involveret i denne proces, og de præcise signalveje forblev der undersøges nærmere i fremtiden.

Som konklusion, vi rapporteret for første gang, at CCR4 var afvigende overudtrykt i PN0 gastrisk kræft og kunne fremme tumorinvasion. Desuden vores data indikeret, at CCR4-induceret MMP-9 produktionen kunne i det mindste delvist grund for ny mekanisme til CCR4-medieret tumor invasion. Således kan antagonister af CCR4 være nyttige kandidater til styring tidlige begivenheder i tumor progression.

Støtte Information

S1 Fig. Overekspression af CCR4 havde ingen effekt på den gastriske vækst kræftcellen

in vitro

.

Efter transfektion med CCR4 eller modeller plasmid og stimulering med eller uden exogen CCL22, SGC-7901 og BGC-823 celler blev podet i 96-brønds plade. Celler levedygtighed blev vurderet ved CCK8 assay ved angivne tidspunkter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120059.s001

(TIF)