PLoS ONE: ROS-medieret Autophagy induceret af dysregulering af Lipid Metabolism Afspiller en beskyttende rolle i Colorectal Cancer celler behandlet med Gambogic Acid

Abstrakt

Gambogic syre (GA), den vigtigste aktive komponent i gamboge harpiks, har potent antitumoraktivitet både

in vivo

in vitro

. Imidlertid er de underliggende molekylære mekanismer er fortsat uklare. I denne undersøgelse fandt vi, at GA kunne indlede autofagi i kolorektal kræftceller, og hæmning af autophagy processen fremskyndet effekten af ​​proliferativ hæmning og apoptotisk celledød induceret af GA, hvilket indebærer en beskyttende rolle autofagi. Todimensional elektroforese-baserede proteomics viste, at GA behandling ændrede ekspressionen af ​​multiple proteiner involveret i redox signalering og lipidmetabolisme. Funktionelle undersøgelser viste, at GA-induceret dysregulering af lipidmetabolisme kan aktivere 5-lipoxygenase (5-LOX), hvilket resulterer i intracellulær ROS akkumulering, efterfulgt af inhibering af Akt-mTOR signal- og autofagi indledning. Endelig resultater under anvendelse af en xenograftmodel foreslået ROS-induceret autofagi beskytte mod antitumorvirkningen af ​​GA. Tilsammen viste disse data nye biologiske aktiviteter af GA mod kolorektal cancer ligger til grund for beskyttende rolle af ROS-induceret autofagi. Denne undersøgelse vil give værdifuld indsigt til fremtidige undersøgelser vedrørende anticancer mekanismer GA

Henvisning:. Zhang H, Lei Y, Yuan P, Li L, Luo C, Gao R, et al. (2014) ROS-medieret Autophagy induceret af dysregulering af Lipid Metabolism Afspiller en beskyttende rolle i Colorectal Cancer celler behandlet med Gambogic Acid. PLoS ONE 9 (5): e96418. doi: 10,1371 /journal.pone.0096418

Redaktør: Spencer B. Gibson, University of Manitoba, Canada

Modtaget: December 25, 2013; Accepteret: April 7, 2014; Udgivet: 8. maj 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (Grant nummer: 30.672.480), National High Technology Research and Development Program Kina (863 Program, No.2012AA020201), National 973 Basic Research Program Kina (2013CB911300) og uddannelse Institut for Hubei-provinsen videnskabelige og teknologiske forskningsprojekter af udestående unge talenter projekt (Q20091207). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje hyppigste årsag til kræft og den fjerde til kræftrelaterede dødsfald på verdensplan [1], [2]. Hvis CRC kan diagnosticeres og behandles på et tidligt tidspunkt, kunne omkring halvdelen af ​​CRC patienter kureres ved kirurgi og multimodal behandling før metastase forekommer [3]. Men til dato effektive behandlingsstrategier til avanceret CRC er begrænsede. 40-50% af patienterne har metastatisk sygdom, hvoraf 90% dør inden for 5 år efter diagnosen [4], [5]. Trods voksende fremskridt i molekylær medicin, effektiv tidlig påvisning, overvågning og behandling af CRC fortsat et dilemma. Derfor er forbedrede systemiske terapeutiske strategier påkrævede for at effektivt at fjerne primær eller metastatisk cancer, for hvilken udvikling af nye lægemidler kan være gavnligt

Gambogic syre (GA;. C

38H

44O

8, MW 628,76), en polyprenylated xanthon, er en vigtig aktiv ingrediens i gamboge isoleret fra

Garcinia

[6], [7]. Det er blevet rapporteret i traditionel kinesisk medicin, at gamboge er koldt, surt, bitre og giftige [8]. I Sydøstasien, GA har en lang tradition for brug for afgiftning, homeostase, anti-inflammatoriske og antiparasitært medicin [7], [9], [10], [11]. I løbet af det sidste halve århundrede, har farmakologiske undersøgelser viste, at GA har stærke antitumoraktiviteter mod forskellige tumorer, herunder menneskelige leukæmi, hepatoma, oral, bryst-, mave-, bugspytkirtel, prostata, epitelial livmoderhalskræft og lungekræft [9], [12], [ ,,,0],13]. For nylig, GA er også blevet rapporteret at have en markant anti-tumor effekt for CRC celler

in vivo

in vitro

[14], [15]. På grund af det brede spektrum af anti-tumor aktivitet med minimal toksicitet over for normale celler, er GA blevet godkendt af de kinesiske Food and Drug Administration til behandling af forskellige kræftformer og er færdig kliniske fase II-forsøg [7], [16]. Selv GA kemiske struktur blev identificeret i 1980’erne fra både detaljerede NMR og røntgen krystallografiske undersøgelser [12], [17], [18] og multiple antitumor mekanismer (herunder induktion af programmeret celledød, cellecyklus regulering, telomerase depression, aktivering af T-lymfocytter, angiogenese hæmning, reaktive ilt arter (ROS) generation

osv.

) har foreslået en række forskergrupper på verdensplan, [7], [12], [13], [18] [19], [20], de molekylære mekanismer med hensyn til dets potente anticancer aktivitet forbliver tvetydige og kræver yderligere undersøgelser.

Autophagy er et stærkt bevaret kataboliske proces karakteriseret ved transport af cellulære komponenter fra dobbeltlag autophagosomes til lysosomer for nedbrydning og genanvendelse som reaktion på næringsstofudsultning eller metabolisk stress [21]. Autophagosome kimdannelse initieres af PI3 kinase type III-Atg6 /Beclin en kompleks, mens forlængelsen overvåges af Atg12-Atg5 og Atg8 /LC3-phosphatidylethanolamin konjugat systemer, som begge er vigtige egenskaber for autophagy [21], [22] , [23]. Autophagy kan induceres ved en række kemoterapeutiske midler, såsom arsentrioxid og oxaliplatin [24], [25]: dog rolle autophagy i cancer er kontroversiel [26], [27], [28]. Et reguleret autophagic reaktion kan sikre den fysiologiske omsætning af beskadigede organeller og genbrugte makromolekyler til at opfylde de energibehov som reaktion på cytotoksiske lægemidler, hvilket fører til forlænget celleoverlevelse [26], [29]. Derimod kan en massiv akkumulering af autophagic vakuoler føre til enten autophagic celledød (type II programmeret celledød), eller en ultimativ forsøg af cellen til at overleve efter tumortype, stadium, genetiske sammenhæng og det omgivende cellulære miljø [26] , [29], [30]

Reaktive ilt arter (ROS) er en samlebetegnelse, der omfatter ufuldstændig reduktion af ilt, herunder superoxid anion (O

2

-)., hydrogenperoxid (H

2O

2) og hydroxylradikal (HO •) [31], [32]. De største kilder til cellulære ROS genereres fra mitokondrie elektron transportkæden (Mito-ETC), NADPH oxidase (NOX) kompleks og det endoplasmatiske reticulum [31], [32]. Kræftceller fra avancerede stadie tumorer ofte udviser høj oxidativ stress, hvilket tyder på, at forhøjede niveauer af ROS spiller en vigtig rolle i tumor progression og også skabe kræftceller med en lavere tolerance over for ROS [33], [34]. Aktivering af onkogener, tab af funktionel p53, afvigende metabolisme og kemisk behandling er blevet rapporteret at øge ROS-produktion i cancerceller [33], [34]. Den intracellulære redox homeostase er en afgørende faktor for celleskæbne: overdreven produktion af ROS normalt resulterer i cytotoksiske virkninger og kan føre til apoptotisk celledød, mens moderate niveauer af ROS kan fungere som en anden-budbringer for regulering af diverse cellulære processer, såsom celle overlevelse, spredning og metastaser [35], [36], [37]. Ophobning af ROS er blevet rapporteret til at associere med indledningen af ​​autophagy og være altid involveret i resultatet af autophagy (celle overlevelse eller død) [38], [39]. Det er almindeligt accepteret, at ROS kan inducere autofagi, og at autofagi til gengæld hjælper i clearance af overdreven ROS at beskytte celler mod oxidativ skade, hvilket kan afspejle balancen enten celleoverlevelse eller død [28], [38], [39].

Nylige undersøgelser viser, at GA kan inducere akkumulering af ROS i cancerceller bidrager til anticanceraktivitet [40], [41], [42], mens autophagy kan inhibere den terapeutiske virkning af GA på glioblastomceller [43]. I denne undersøgelse fandt vi, at GA kunne fremme apoptose og autofagi i kolorektal cancer celler

in vitro

in vivo

, og hæmning af autofagi forbedret følsomheden mod GA behandling. Desuden blev akkumulering af intracellulære ROS hidrørende fra 5-LOX kræves til GA-induceret autophagy.

Materialer og metoder Salg

Celledyrkning og reagenser

human colon carcinoma celle linjer, HCT116 og SW620, og den murine koloncarcinomcellelinie C26 blev fremskaffet fra ATCC. Celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum, 10

5 U /l penicillin og 100 mg /l streptomycin ved 37 ° C i en atmosfære indeholdende 5% CO

2.

de følgende reagenser blev anvendt i denne undersøgelse: Gambogic syre (Gaia Chemical Corp, G1000), MTT (Sigma, M2128), 3-methyladenin (3-MA) ​​(Sigma, M9281), NAC (Sigma, A9165), Z-VAD -fmk (Sigma, V116), acridinorange (Sigma, A6014), dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma, D2650) apocynin (Sigma, A10809), Rotenone (Sigma, R8875), nordihydroguaiaretsyre (NDGA) (Sigma, 74.540) , pepstatin A (Sigma, P4265), E64D (Sigma, E8640). Til opbevaring blev en 10 mM opløsning af GA fremstillet i DMSO, opbevaret ved -20 ° C, og derefter fortyndet efter behov i dyrkningsmedium

Antistoffer mod følgende proteiner blev anvendt:. Spaltet Caspase 3 (cellesignalering , 9664S), Beclin 1 (Santa Cruz, sc-11427), LC3 (Abcam, ab58610), Atg5 (Abcam, ab78073), Atg7 (Abcam, ab53255), P62 (Abcam, ab91526), ​​5-LOX (Abcam, ab39347 ), actin (Santa Cruz, sc-1616), Akt (Cell signalering, 4685), fosfor-Akt (cellesignalering, 4051), mTOR (Cell signalering, 2983), fosfor-mTOR (cellesignalering, 2971), p70 S6K (Santa Cruz, sc-9027), phosphor-p70 S6K (Santa Cruz, 7984-R), peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret anti-kanin sekundært antistof (Santa Cruz, sc-2004), HRP-konjugeret anti-muse-sekundært antistof (Santa Cruz, sc-2005).

cellelevedygtighed Assay

Celler blev podet i 96-brønds dyrkningsplader og behandlet i 12 timer, 24 timer og 36 timer henholdsvis. Efterfølgende cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse af MTT-assayet [44]. Absorbans blev målt ved 490 nm (test bølgelængde) og 570 nm (referencebølgelængde) med en multi-brønd spektrofotometer (MDC, Sunnyvale, CA).

Annexin V-FITC /PI Double-mærket flowcytometri

for at detektere den apoptotiske forhold mellem celler behandlet med GA (0,25, 0,5 eller 1,0 uM), ekspressionen af ​​Annexin V-FITC og udelukkelse af PI blev påvist under anvendelse tofarvet flowcytometri (FCM). HCT116 eller SW620-celler blev opsamlet under anvendelse EP rør, vasket to gange med PBS og resuspenderet i 500 pi bindingsbuffer. Prøverne blev inkuberet med 5 pi Annexin V-FITC i 10 minutter ved stuetemperatur og derpå 5 pi PI blev tilsat. Hver prøve blev inkuberet i yderligere 10 minutter ved stuetemperatur i mørke før fluorescensintensiteten blev kvantificeret under anvendelse af et flowcytometer (Beckman Coulter, Miami, FL, USA).

GFP-LC3 Farvning af Autophagosomes

HCT116 og SW620-celler blev transficeret med en pEGFP-LC3 plasmid (benævnt GFP-LC3) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11.668.027) ifølge producentens instruktioner. Fluorescensen af ​​GFP-LC3 blev set og satsen for GFP-LC3-labled vacuole dannelse (autophagosomes) blev talt under et fluorescensmikroskop [45], [46]. Celler med GFP-LC3 punktformig prikker blev defineret som positive, hvis celler, der var 5 eller flere GFP-LC3 prikker i cytoplasmaet [47].

Påvisning af sure vesikulær organeller

Celler (1 × 10

5) blev udpladet i 6-brønds plader. Efter lægemiddelbehandling blev cellerne farvet med 1 pg /mL acridinorange i 15 minutter, vasket med PBS og undersøges ved fluorescensmikroskopi [48], [49].

elektronmikroskopi

Celler blev høstet, pelleteret og fikseret i paraformaldehyd (0,1% glutaraldehyd i 0,1 M natriumcacodylat) i 2 timer, efterfikseret med 1% OSO

4 i 1,5 timer, vasket og til sidst farvet i 1 time i 3% vandig uranylacetat. Prøverne blev derefter skyllet med vand igen, dehydreret med gradueret alkohol (50%, 75% og 95-100% alkohol) og indlejret i Epon-Araldite resin (Canemco, 034). Ultratynde snit blev skåret på en Reichert ultramikrotom, kontrastfarvet med 0,3% bly citrat og undersøgt på et Philips EM420 transmission elektron mikroskop. Celler med autophagic vakuoler blev defineret som positiv, hvis de havde 5 eller flere autophagic vakuoler. Området besat af autophagic vakuoler og cytoplasmaet blev bestemt med Image Pro Plus Image Analysis Software version 3 og anvendes til at beregne den cytoplasmatiske område besat af autophagic vakuoler [50].

TUNEL Assay

TUNEL-assayet blev udført under anvendelse af deadend fluorometrisk TUNEL-systemet (Promega, G3250) ifølge producentens instruktioner. TUNEL positive celler blev undersøgt under et fluorescensmikroskop [51].

RNA Interference

Atg5

,

Beclin 1, 5-LOX

negativ kontrol siRNA blev syntetiseret ved Genepharma. Sekvenserne af siRNA var som følgende: menneskelig

Atg5

siRNA, fornemmer 5′-GAC GUU GGU AAC UGA CAA ATT-3 ‘og antisense 5′-UUU GUC AGU UAC CAA CGU CTT-3’; menneskelig

Beclin 1

siRNA, fornemmer 5′-GGA GCC AUU UAU UGA AAC UTT-3 ‘og antisense 5′-AGU UUC AAU AAA UGG CUC CTT-3’. 5-LOX designet ifølge tidligere undersøgelse (targeting sekvens: 5′-GCGCAAGTACTGGCTGAATGA-3 ‘; NM_000698) [52]. SiRNA blev transficeret med Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, 11.668.027) i 24 timer i HCT116 celler ifølge producentens protokol.

reaktive oxygenspecies (ROS) Måling

Intracellulær ROS niveau blev påvist ved farvning af celler med 2 ‘, 7’-dichlorfluorescein-diacetat (DCFH-DA) (GENMED, GMS10016.2) ifølge producentens instruktioner. Den DCFH-DA-signalet blev målt med en Molecular Devices SpectraMax M5 fluorimeter (490 nm excitation og 530 nm emission).

Immunblot

Proteiner blev ekstraheret i RIPA-buffer (50 mM Tris-base, 1,0 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxycholat 1 mM PMSF) og kvantificeret med DC proteinassaykit (Bio-Rad). Prøver blev separeret med 12% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Membranerne blev blokeret natten over med Tris-bufret saltvand med Tween 20 (TBST) (20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) i 5% skummetmælk ved 4 ° C, og efterfølgende probet under anvendelse af de primære antistoffer: kanin-anti-Beclin 1 (fortyndet 1:500), kanin-anti-Atg5 (fortyndet 1:1,000), kanin-anti-atg7 (fortyndet 1:500), kanin-anti-LC3 (fortyndet 1:1,000), kanin -Anti-5-LOX (fortyndet 1:1,000), kanin-anti-Akt (fortyndet 1:1,000), kanin-anti-phospho-Akt (fortyndet 1:1,000), kanin-anti-mTOR (fortyndet 1:1,000) , kanin-anti-phospho-mTOR (fortyndet 1:1,000). Blots blev inkuberet med de respektive primære antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur. Efter vask tre gange i TBST, blev blottene inkuberet med HRP-konjugeret anti-kanin sekundært antistof (fortyndet 1:5,000) eller HRP-konjugeret anti-muse-sekundært antistof (fortyndet 1:6,000) i 1 time ved stuetemperatur. Blots blev visualiseret under anvendelse Immobilon vestlige kemiluminescens reagenser (Millipore, WBKLS0500).

Som et mål for autophagic flux blev immunoblots til LC3 udført i fravær eller nærvær af lysosomale enzymhæmmere. LC3 flux blev bestemt ved forholdet mellem densitometrisk værdi LC3-II vedrørende tilsvarende DMSO-behandlet kontrol uden lægemiddel behandling som beskrevet andetsteds [23], [53].

2-DE og MS /MS-analyse

2-DE og MS /MS-analyse blev udført som tidligere [54] beskrevne. Kort fortalt blev cellerne opløst i lysepuffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% CHAPS, 100 mM DTT, 0,2% pH3-10 amfolyt, Bio-Rad, USA) i nærvær af proteaseinhibitor (Sigma). Prøver blev fyldt i IPG strimler (17 cm, pH3-10NL, Bio-Rad) ved anvendelse af en passiv rehydrering metode, og derefter udsat for isoelektrisk fokusering (Bio-Rad). Den anden dimension separation blev udført under anvendelse 12% SDS-PAGE efter ækvilibrering. Gelerne blev farvet med CBB R-250 (Bio-Rad). Identifikation og kvantificering af protein pletter i gelen blev opnået under anvendelse PDQuest software (Bio-Rad).

-gel protein fordøjelse blev udført under anvendelse af massespektrometri trypsin i overensstemmelse med producentens anvisninger. De gel spots blev affarvet med 100 mM NH

4HCO

3/50% acetonitril (ACN) og dehydreret med 100% ACN. Gelerne blev derefter inkuberet med trypsin (Promega, V5280), efterfulgt af dobbelt ekstraktion med 50% ACN /5% trifluoreddikesyre (TFA). Peptid ekstrakter blev tørret i en Speed-Vac koncentrator (Thermo) og underkastet massespektrometrisk analyse under anvendelse af en Q-TOF massespektrometer (Micromass, Manchester, UK) forsynet med en ESI kilde.

Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført under anvendelse af Dako EnVision System (Dako Cytomation GmbH, Hamburg, Tyskland). Fortløbende paraffin vævssnit (3-5 um) blev afvokset og rehydreret. Antigen genfinding blev udført ved forbehandling af objektglassene i citratbuffer (pH 6,0) i en mikrobølgeovn i 12 minutter. Derefter objektglas blev afkølet til stuetemperatur i deioniseret vand. Endogen peroxidaseaktivitet blev standset ved inkubation af objektglassene i methanol indeholdende 3% hydrogenperoxid efterfulgt af vask i PBS i 5 minutter, hvorefter sektionerne blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med normalt gedeserum og efterfølgende inkuberet ved 4 ° C natten over med primære antistoffer. Næste blev snittene skyllet med vaskebuffer (PBS med 0,1% bovint serumalbumin) og inkuberet med peberrodsperoxidase- bundet gede-anti-kanin-antistoffer efterfulgt af omsætning med diaminobenzidin og kontrafarvning med Mayers hematoxylin.

Tumor xenograft model

Eksperimentelle protokoller blev foretaget i overensstemmelse med de Europæiske Fællesskabers Rådets direktiv af 24. november 1986 (86/609 /EØF) med godkendelse fra den etiske komité i Tongji Medical College. Sund hunmus (BALB /c, 6-8 uger gamle, ikke-frugtbare og 18-20 g hver) blev injiceret subkutant med C26-celler (en million celler per mus). Når tumorer var ca. 5 mm x 5 mm i størrelse (sædvanligvis ti dage, efter inokulering), blev dyrene tilfældigt parvist sammensat i to grupper (ni mus pr gruppe) som følger: en kontrolgruppe (intraperitoneal injektion af vehikel: 5% DMSO , 50% PEG-400 i PBS) og en gambogic syregruppe (intraperitoneal injektion på 8 mg /kg gambogic syre gang hver anden dag i seks gange). Tumorvolumenerne blev evalueret som følger: tumorvolumen (mm

3) = (længde x bredde

2) /2. Dyr blev aflivet 12 dage efter injektion. Tumorer blev dissekeret og frosset i flydende nitrogen eller fikseret i formalin straks.

For at teste effektiviteten af ​​combinative behandlinger, når tumorer blev ca. 600 mm

3, dyrene var pair-matchede i fire grupper (8 mus per gruppe): en kontrolgruppe, GA, GA + NAC, og GA + 3-MA. Kontrolgruppe: intraperitoneal injektion af vehikel: 5% DMSO, 50% PEG-400 i PBS. GA behandling: intraperitoneal injektion på 8 mg /kg gambogic syre gang hver anden dag i ti gange. NAC behandling: dyr fik enten deioniseret vand eller vand indeholdende NAC (7 mg /ml; neutraliseret til pH 7,4 med NaOH); Vi overtog en gennemsnitlig mus vægt på 25 g og daglig vandforbrug på 6,7 ml, den estimerede daglige moderens dosis var 1,9 g /kg /d [55]. 3-MA behandling: subkutane injektioner af saltvand (kontrol) eller 1 mg /kg 3-MA, og injektionen blev gentaget hver dag [56]. De tumor volumen blev vurderet som følger: tumor volumen (mm

3) = (længde × bredde

2) /2

Statistisk Dataanalyse

Sammenligninger mellem to grupper var. udført af Students test. Statistisk signifikans blev defineret som

* p 0,05;

** p 0,01;

*** p 0,001

Resultater

GA fremkalder apoptose i Kolorektal Cancer Cells

For at bestemme virkningen af. GA på colorektale cancerceller, blev HCT116 og SW620-celler behandlet med forskellige koncentrationer af GA i 12 timer, 24 timer eller 36 timer hhv. MTT-assay blev anvendt til bestemmelse af cellelevedygtighed. Som vist i figur 1A, behandling med GA resulterede i proliferativ inhibering af HCT116 celler i både en dosis- og tidsafhængig måde med IC

50 værdier på ca. 1,1 pM, 0,6 pM og 0,5 pM i 12 timer, 24 timer og 36 t. SW620-celler viste kun dosisafhængig hæmning med en IC

50 værdi på ca. 2 uM. Desuden blev virkningen af ​​GA på kolorektal cancer celledød undersøgt under anvendelse Annexin-V fluoresceinisothiocyanat (FITC) og propidiumiodid (PI) dobbelt farvning, samt TUNEL assays. Som vist i figur 1B, var procentdelen af ​​Annexin-V-positive celler, som indikerer døde celler, betydeligt efter behandling med GA. Disse resultater var i overensstemmelse med dem opnået fra TUNEL-assayet (figur 1C). Dernæst undersøgte vi, om GA-induceret celledød var caspase-afhængig. Som vist i figur 1 D, blev spaltet-caspase 3 akkumuleret upon GA behandling. Desuden kunne GA celledød blive markant vendes ved en pan-caspaseinhibitor, Z-VAD-fmk (Figur S1), hvilket tyder på, at GA inducerede en caspase-afhængig apoptotisk celledød.

(A) HCT116 og SW620-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af GA i 12 timer, 24 timer eller 36 timer, og cellelevedygtigheden indekset blev målt ved MTT-assayet. (B) HCT116 og SW620-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af GA i 24 timer blev celle apoptose detekteret ved annexin-V fluoresceinisothiocyanat (FITC) og propidiumiodid (PI) dobbelt farvning efterfulgt af flowcytometri analyse. Punktdiagram visning af Annexin-V FITC-fluorescens versus propidiumiodid fluorescens er vist i logaritmisk skala. Levende celler testet negative for både annexin V-FITC og PI. Befolkninger tester annexin V positiv /PI negativ blev klassificeret som debuterende apoptotiske celler, og dobbeltklik positive celler blev klassificeret som døde celler. Bar diagram, som viser procentdelen af ​​døde celler efter forskellige behandlinger. (C) HCT116 og SW620-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af GA i 24 timer blev døde celler detekteret ved TUNEL-assay. Tunel-positive celler blev talt fra mindst 100 tilfældige felter. (D) Immunoblotanalyse af spaltet-caspase 3 fra lysater af HCT116 og SW620 celler behandlet med forskellige koncentrationer af GA i 24 timer, eller behandledes med 1 pM GA i 12 timer og 24 timer.

GA Starter Autophagy i Colorectal cancer Cells

for bedre at forstå den anti-cancer effekt af GA, ultrastruktur HCT116 celler behandlet med GA eller DMSO ( 0,1%) blev analyseret ved transmission (TEM). Talrige membranbundne vakuoler, karakteristisk for autophagosomes, blev observeret i cytoplasmaet i GA-behandlede celler, hvorimod membranbundne vakuoler sjældent kunne findes i de celler behandlet med DMSO (figur 2A). Desuden blev acridinorange-farvning anvendes til at analysere dannelsen af ​​sure vesikulære organeller (AVOS), en anden vigtig funktion af autofagi. Som vist i figur 2B, HCT116-celler behandlet med GA resulterede i indlysende dannelse gulorange AVOS sammenlignet med DMSO-behandlede celler. Salg

(a) de øvre paneler. Repræsentative transmission elektronmikroskopiske optagelser skildrer ultrastructures af HCT116-celler behandlet med enten DMSO (kontrol, 0,1%) eller 1 uM GA i 24 timer. Lavere paneler. Cellerne med autophagic vakuoler blev defineret som celler, der havde fem eller flere autophagic vakuoler. Procentdelen af ​​cellerne med autophagosomes og det gennemsnitlige antal vakuoler per celle blev analyseret fra mindst 100 tilfældigt udvalgte TEM felter. Scale barer: 1 um; 100 nm (angivet udvidelser). (B) Acridin Orange farvning i HCT116-celler behandlet med DMSO (kontrol, 0,1%), 0,5 uM GA eller 1,0 uM GA i 12 timer. Alle data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. ** P. 0,01

lokalisering og sammenlægning af LC3 er kendt for at være vigtige for transport og modning af autophagosome [57]. Derfor blev pEGFP-LC3 plasmid forbigående transficeret ind i begge HCT116 og SW620 celler til yderligere bekræfte, om GA indleder autofagi i kolorektale cancerceller. Som angivet i figur 3A, procentdelen af ​​GFP-LC3-positive celler og gennemsnitlig mængde af GFP-LC3 prikker var begge signifikant forøget ved GA behandling på en dosis-afhængig måde. Den lipiderede form af LC3 transformerende fra LC3-I til LC3-II er korreleret med omfanget af autophagosome formation [57]. GA også markant forbedret omsætningen fra LC3-I til LC3-II, som blev yderligere akkumuleret i nærvær af E64D og pepstatin A (begge lysosomale proteaseinhibitorer) (figur 3B), hvilket antyder, at GA kunne forbedre autophagic flux. Foruden LC3, udtrykkene for en række autophagic relaterede proteiner, herunder p62, Beclin 1, Atg7 og Atg12-Atg5, har vist sig at blive ændret under autofagi [23]. Derfor undersøgte vi ekspressionen af ​​disse proteiner upon GA behandling. Som vist i figur 3C, GA opreguleres ekspressionen af ​​Beclin 1, Atg7 og Atg12-Atg5 på en dosis-afhængig måde, medens akkumulering af P62 blev reduceret. Disse resultater viste endvidere, at GA kan inducere dannelsen af ​​autophagosomes i kolorektale cancerceller.

(A) HCT116 og SW620 celler transficeret med en pEGFP-LC3 plasmid blev behandlet med angivne koncentrationer af GA i 24 timer. Celler blev defineret som positiv, hvis de havde 5 eller flere GFP-LC3 prikker i cytoplasmaet. Procentdelen af ​​cellerne med GFP-LC3 prikker og det gennemsnitlige antal GFP-LC3 dots per celle blev analyseret fra mindst 100 tilfældige felter. (B) Immunoblotanalyse af omdannelsen af ​​LC3-I til LC3-II i HCT116-celler og SW620 celler efter behandlet med angivne koncentrationer af GA i 24 timer, eller med 1,0 uM af GA i 12 timer og 24 timer i fravær eller nærvær af lysosomale inhibitorer (E64D og pepstatin, hver ved 10 ug /ml). (C) Immunoblotanalyse af ekspressionsniveauet for Atg12-Atg5 konjugat, Atg7, Beclin 1 og P62 efter behandling med angivne koncentrationer af GA i 24 timer, eller med 1 uM af GA i 12 timer og 24 timer. Actin tjente som en belastning kontrol. * P 0,05; ** P. 0,01

Blokering af Autophagy Forbedrer GA-induceret apoptose

I betragtning af den paradoksale rolle autophagy at fremme celledød eller overlevelse, vi yderligere behandlet kolorektal cancer celler med et almindeligt anvendt autophagy inhibitor (3-MA) ​​enten alene eller i kombination med GA at bestemme den funktionelle rolle af autofagi i GA-induceret apoptose. Som vist i figur 4A, forbehandling af HCT116-celler med 3-MA væsentligt forbedret virkningen af ​​GA-induceret proliferativ suppression. I overensstemmelse hermed resultaterne af Annexin-V /PI double-farvning (figur 4B) og TUNEL assays (figur 4C) viste også, at GA i kombination med 3-MA udviste en stærkere pro-apoptotisk virkning i forhold til GA alene. Hertil kommer, transient transfektion med Atg5- eller beclin1 målrettet siRNA ablatere Atg5 eller beclin 1 ekspression kan inhibere GA-induceret LC3-II akkumulering, samt forstærker den antiproliferative og pro-apoptotiske virkninger af GA i HCT116-celler (figur 4D-G). Disse data antyder, at autofagi beskytter GA-behandlede colorektale cancerceller fra apoptotisk celledød.

(A-C) HCT116-celler blev behandlet med vehikelkontrol (1 ‰ DMSO, Control), 3-MA, 1 uM GA (GA), eller 1 uM GA i nærvær 3-MA (GA + 3-MA) ​​i 24 timer. Og derefter cellelevedygtigheden blev vurderet ved MTT-assay (A), og den apoptotiske virkning blev påvist ved PI /annexin-V-farvning (B) og TUNEL assays (C). (D) Immunoblot påvisning af ekspressionen af ​​ATG5, beclin-1 og LC3 i HCT116-celler behandlet med GA i den foreliggende eller fraværende med siATG5 eller siBeclin 1. (E-G) HCT116-celler blev behandlet med Lipofectamine 2000 (kontrol), kontrol siRNA (siControl), siATG5 (siATG5), 1 pM GA (GA), GA i tilstedeværelse kontrol siRNA (GA + siControl), siATG5 (GA + siATG5) eller siBeclin1 (GA + siBeclin 1) i 24 timer. Og derefter cellelevedygtigheden blev vurderet ved MTT-assay (E), og den apoptotiske virkning blev påvist ved PI /annexin-V-farvning (F) og TUNEL assays (G). * P 0,05; ** P. 0,01

Redox Dysregulering blev induceret på GA Behandling

At udforske den mekanisme, hvormed GA inducerer autophagy, vi profilerede differentielt udtrykte proteiner i HCT116 celler behandlet med eller uden GA. Ved at sammenligne 2-DE-mønstre, blev differentielt udtrykte proteiner defineret som statistisk meningsfuld (p 0,05), hvis begge følgende to kriterier var opfyldt: 1) intensitet ændringer af 2,0-fold og 2) observeret i mindst tre individuelle eksperimenter. 25 pletter, der opfyldte disse kriterier, blev udvalgt og analyseret under anvendelse ESI-Q-TOF tandem-massespektrometri, og i alt 27 proteiner blev identificeret (fig. 5A, tabel I). De MS /MS-data blev forespurgt ved hjælp af søgealgoritme MASCOT mod proteinet-database ExPASy. Proteiner blev identificeret ud fra en række kriterier, herunder pI, MW, peptididentifikation, og dækning (tabel I). Af disse blev 13 proteiner nedreguleret mens 14 proteiner blev opreguleret indlæg GA behandling (fig. 5D). De identificerede proteiner blev opdelt i forskellige grupper baseret på deres subcellulære lokalisering og biologiske funktioner (fig. 5b og 5c). Proteinerne viste sig at være lokaliseret i cytoplasmaet (59%), nucleus (4%), mitokondriet (15%), cellemembran (11%), eller endoplasmatisk reticulum (11%). Denne implicerede roller i spredning og Apopotosis (37%), Redox regulering (22%), Lipid metabolisme (15%), glycometabolismen (15%), Translational Proteinmodifikation (4%), og molekylchaperone (7%). Efter spredning og Apopotosis, de næste mest ændrede proteiner var involveret i redox regulering på GA behandling, hvilket tyder ROS kan være involveret i GA-induceret autophagy.

(A) Repræsentative todimensionale gel billeder af kontrol og GA -behandlede (1 uM, 24 timer) HCT116 celler. Totale proteinekstrakter blev separeret på pH 3-10 ikke-lineær immobiliseret pH-gradient strimler i den første dimension, efterfulgt af 12% SDS-PAGE i den anden dimension og visualiseret ved CBB-farvning. (B) De identificerede proteiner blev kategoriseret i grupper efter deres subcellulære placeringer. (C) 27 distinkte proteiner blev klassificeret i 6 grupper baseret på deres biologiske funktioner. (D) Protein klynge kort genereret af cluster software. Ekspression af proteiner i kontrollen var konstant ved 0, hvorimod proteiner opreguleret i GA-behandlede celler er i rødt, og de nedreguleres proteiner er grønt. Intensiteten af ​​farven grøn eller rød svarer til graden af ​​ændring, henholdsvis efter farve stribe i bunden af ​​figuren.

ROS er påkrævet for GA-induceret Autophagy < ** P 0,01.