PLoS ONE: CD44 Opregulering i E-Cadherin-Negativ Esophageal kræftformer Resultater i Cell Invasion

Abstrakte

E-cadherin ofte tabt under epitel-mesenkymale overgang og progression af epitelial tumorigenese. Vi fandt en markør for epithelial-mesenchymal overgang, CD44, opreguleret som svar på funktionelt tab af E-cadherin i esophageal cellelinier og cancer. Tab af E-cadherin ekspression korrelerer med forøget ekspression af CD44 standard isoform. Ved hjælp af en organotypisk rekonstruere model, viser vi øget CD44-ekspression i områder med celle invasion er forbundet med MMP-9 på forkant. Desuden Activin A øger celleinvasion gennem CD44 opregulering efter E-cadherin tab. Tilsammen vores resultater giver funktionel dokumentation for CD44 opregulering i spiserøret invasion kræft

Henvisning:. Le Bras GF, Allison GL, Richards NF, Ansari SS, Washington MK, Andl CD (2011) CD44 Opregulering i E- cadherin-Negative Esophageal kræft Resultater i Cell invasion. PLoS ONE 6 (11): e27063. doi: 10,1371 /journal.pone.0027063

Redaktør: Adam I. Marcus, Emory University, USA

Modtaget: Juli 29, 2011; Accepteret: 10. oktober 2011; Udgivet: November 1, 2011

Copyright: © 2011 Le Bras et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. CDA er modtageren af ​​en Research Scholar Award fra American Gastroenterologisk Association (AGA) /Institut til Digestive sundhed og ernæring (FDHN) og støttet af National Institutes of Health (DK075379). Vi vil gerne takke immunhistologi Core og Translationel Core på Vanderbilt University for sektionering og IHC farvninger, og andre Core faciliteter understøttes gennem Digestive Disease Research Center (P30-DK058404) og Vanderbilt Ingram Cancer Center Support tilskud (P30-CA068485). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

CD44, eller indisk blodtype, er et transmembrant glycoprotein og en receptor for hyaluronsyre (HA), en vigtig komponent i den ekstracellulære [1] matrix. CD44 spiller en vigtig rolle i vævsintegritet og er involveret i flere funktioner associeret med cancer progression såsom cellemigration [2], modstandsdygtighed over for apoptose [3] og præsentation af vækstfaktorer og proteaser [4], [5]. Desuden har CD44 blevet identificeret som en specifik markør for cancer stamceller [6], [7] og af tumorceller undergår en epitel-mesenkymale overgang (EMT) -lignende proces [8]. Forskellige isoformer omregnes grund alternativ splejsning af exoner 6-15 [9]. Den standard form for CD44 (CD44s) menes at være allestedsnærværende udtryk, mens nogle variant former, CD44v, har været forbundet med metastaser [10].

Et stort skridt i EMT er tabet af E-cadherin. E-cadherin er et centralt element i adherensovergange og medierer celleadhæsion ved at interagere med de cytoplasmatiske proteiner P-catenin [11] og p120 [12]. Adherensovergange er forbundet til actincytoskelettet gennem cytoplasmatiske linkere, såsom α-catenin [13]. E-cadherin kan transkriptionelt undertrykt gennem Snail1, Snail2, Twist, Zeb1 og Zeb2, der kan reguleres ved TGF [14]. Stimulering af brystcancerceller med TGFp resulterer i co-lokalisering af matrixmetalloproteinase MT1-MMP og CD44 på cellemembranen og inducerer CD44-spaltning resulterer i høje niveauer af opløseligt CD44 [15]. Omvendt interaktionen mellem hyaluronan og CD44 modulerer TGFp-receptor handel, som kan regulere TGFp signalering [16].

Under EMT, epitelceller udtrykkelige markører, såsom CD44, der er kendt for at blive udtrykt i cancer stamceller [ ,,,0],8]. Activin A har vist sig at være en vigtig regulator af stemness [17]. Activin A, et medlem af TGF-superfamilien, er også blevet beskrevet at påvirke udvikling, hæmatopoiese og tumorigenese [18] – [24]. Vi ønskede derfor at bestemme, om Activin A inducerer EMT i esophageal celler og forbinder således induktionen af ​​celleinvasion til activin A og CD44-ekspression.

Vi har tidligere vist den koordinerede tab af E-cadherin og TGFp-receptor II (TGFβRII) i esophageal carcinoma [25]. Andre rapporter har indikeret betydningen af ​​CD44 i esophageal pladecarcinom viser en højere udtryk for CD44v6 [26], [27], men dens indvirkning på tumor invasion stadig kontroversielt. Derfor er vi til formål at studere CD44-ekspression i esophageal pladeepitel

in vivo

in vitro

. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at CD44-opregulering er associeret med E-cadherin tab i primære øsofageale tumorvæv og cancercellelinjer. Funktionelt, viser vi, at Activin A signalering i fravær af E-cadherin kan opregulere CD44. Desuden CD44 forankrer MMP-9 til invasive fronten oversætte til øget celle invasion. Disse resultater har stor betydning for en ny rolle Activin A i induktion af EMT gennem opregulering af CD44.

Metoder

Cell kultur

Primære esophageal epitelceller (keratinocytter) fra normal human spiserøret blev etableret som tidligere [25] beskrevne. Kort fortalt blev supernatanter indeholdende pFB-neo retrovirus koder for enten fuldlængde-E-cadherin eller et dominant negativ mutant af E-cadherin mangler den cytoplasmatiske hale (betegnet EF) anvendes til transfektion af hTERT-udødeliggjort, men ikke-transformerede, esophageal epitelceller [28]. Tomme pFBneo blev anvendt som kontrol. Derudover en dominant negativ mutant af TGFβRII (en gave fra Dr. H. Moses, Vanderbilt University, Nashville, TN), subklonet i pBabe.puro, blev anvendt til dannelse ECdnT celler og tomme pBabe.puro som kontrol. Fuldlængde E-cadherin i pFBneo blev også anvendt til at gendanne E-cadherin-ekspression i TE-8 og FLO-1-celler. Føtale øsofageale fibroblaster blev dyrket i DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA). Esophageal pladecarcinom cellelinjer, TE-celler, var en venlig gave fra Drs. Rustgi og Nakagawa (University of Pennsylvania, Philadelphia, PA). Esophageal adenocarcinom cellelinjer OE33, FLO-1 og SK-GT-4 [29] – [31], og hoved og hals kræft cellelinjer JHU-012 og JHU-013 blev udviklet fra primær hoved og hals pladecellekræft i afdelingen af hoved- og halscancer Forskning ved Johns Hopkins University.

for E-cadherin-inhibering, celler blev podet ved en densitet på 2 x 10

5 celler per brønd i en plade med 6-. Efter 24 timer blev mediet skiftet til serum-frit DMEM og celler blev transficeret med en slutkoncentration på 10 nM siRNA anvendelse af calciumphosphat-transfektion (400 pi RNAse-frit vand blev blandet med 50 pi 2,5 M CaCl

2, 50 pi 2 uM siRNA med 500 pi HBSP2x (280 mM NaCl, 1,5 mM NA

2PO

42H

2O, 12 mM glucose, 10 mM KCI, 50 mM HEPES pH7.05 i 500 ml RNAse- frit vand)). siRNA opnåedes fra Qiagen (Qiagen, Valencia, CA), Hs-CDH1_12 (SI1) og Hs_CDH1_13 (SI2) blev anvendt mod E-cadherin og AllStars negative, var ikke-dæmpende siRNA prober anvendes til styring (ctrl). For stimulation, 20 ng /ml Activin A (R Scientific Corp., Westbury, NY), der indeholder 80 esophageal skællede kræft formalin fast paraffin indstøbt (FFPE) væv fra 40 patienter og 4 normale kontroller blev brugt til immunhistochemical farvning. Sammen kan data indsamles til 166 planocellulære tumorprøver, 2 tilfælde med progression fra det normale, carcinom

in situ

til ESCC, og yderligere normale kontroller væv.

One-hundrede-og- treogtredive esophageal adenocarcinom (EAC) FFPE prøver blev analyseret efter immunhistokemisk farvning. Disse prøver blev indhentet fra de arkiver departementerne patologi ved Vanderbilt University (Nashville, TN, USA), Otto-von-Guericke University (Magdeburg, Tyskland) og fra CHTN [33]. Histopatologisk diagnose af Barretts øsofagus, dysplasi og esophageal adenocarcinom blev kontrolleret på grundlag af H anti-CD44-klon 2C5 (R CD44 F10-44-2 og α-tubulin (Abcam, Cambridge, MA) blev anvendt til immunhistokemi på FFPE og Western Blot, henholdsvis; E-cadherin indkøbt fra BD Bioscience (Franklin Lakes, NJ), β-actin og αSMA klon 1A4 blev begge anskaffet fra Sigma (Saint Louis, MO), anti-MMP-9 fra Calbiochem (EMD Chemicals, Rockland, MA); S100A4 er fra Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA) og vimentin klon V9 fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).

Immunhistokemi og Immunofluorescens

Immunhistokemi blev udført med Vecta Elite kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) efter fabrikantens protokol ved hjælp af deres reagenser. Primært antistof blev inkuberet natten over ved 4 ° C og sekundært antistof i 30 minutter ved 37 ° C. Derefter blev signalet udviklet under anvendelse af DAB-substrat kit til peroxidase. For immunfluorescensfarvning blev et biotinyleret sekundært antistof påvises under anvendelse Texas-Red-streptavidin eller FITC-mærket sekundært antistof. Farvede snit blev monteret med DAPI-holdigt monteringsmedium.

Zymografi og in situ zymografi

Konditionerede medier fra organotypisk kultur dyrket under serumfrie betingelser i 48 timer blev separeret på en 10% acrylamidgel indeholdende gelatine ved 4 ° C. Geler blev farvet med Coomassie blue R250 i 2 timer og overskud af farvning blev fjernet med affarvning puffer (10% eddikesyre 20% methanol). Billeder blev taget ved hjælp af Gel Doc ™ XR (Bio Rad, Hercules, CA).

I in situ zymografi, DQ-Gelatine fluorescein konjugat (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA) blev resuspenderet i 1 ml deioniseret vand ved en koncentration på 1 mg /ml. 100 ug /ml DQ-Gelatine blev anvendt til at overlejre 5 mikrometer tykke frosne snit af organotypiske kulturer i 18 timer ved 37 ° C. Fluorescein signal på sektionerne blev afbildet under anvendelse af et fluorescensmikroskop (Zeiss, Thornwood, NY).

Western blotting

Western blots blev udført som beskrevet før [35]. Forsøgene blev gentaget mindst to gange.

Resultater

Primære humane esophageal tumorer viser omvendt udtryk for E-cadherin og CD44

For at fastlægge den rolle, CD44 i esophageal celle invasion og EMT, udførte vi immunhistokemisk farvning af E-cadherin og CD44 på væv microarrays af 166 pladecellecarcinom (SCC) og 131 adenocarcinomer. For to esophageal SCC patienter, prøver, der repræsenterer progressionen fra normal til karcinom

in situ

(CIS) og efterfølgende ESCC (fig. 1A til 1C), observerede vi en gradvis forøgelse af CD44-ekspression. Generelt blev E-cadherin stort set begrænset til områder med lav eller ingen CD44-ekspression i normalt epitel (fig. 1D, E) og 20 ud af 166 tumorer. For esophageal SCC observerede vi opregulering af CD44 i fravær af E-cadherin i 54% af tumorerne (90 ud af 166 tumorer). Sammen 110 ud af 166 (66%, p 0,02) af vores kliniske prøver viste denne omvendte forhold af E-cadherin og CD44. Esophageal adenocarcinom prøver viste en omvendt korrelation af E-cadherin og CD44-ekspression i 63 ud af 131 prøver (48%), med 41 prøver med betydelig E-cadherin, men ingen CD44 ekspression. Tyve-to prøver havde øget CD44-ekspression og er negative for E-cadherin. Tilsammen viser vi en statistisk signifikant (p 0,05) omvendt korrelation til ekspression af E-cadherin og CD44. Billeder af repræsentative immunohistokemiske farvninger af tumorvæv demonstrerer associering af E-cadherin og CD44 er vist i fig. 1 F-l.

IHC med anti-CD44 antistof-shows øget CD44-ekspression under progression fra normal (A) til carcinom

in situ, Salg CIS (B), og tumor (C). Antistof mod E-cadherin og CD44 viser ekspressionen af ​​E-cadherin (D) og i fravær af CD44 (E) i den normale epitel. I EAC væv med tilbageholdt E-cadherin ekspression (F, stiplet sort linje) signalet for CD44 er lavt (G). (H) Tab af E-cadherin er forbundet med en intens signal for CD44 (I). Scale bar er 50 mikron.

E-cadherin-negativ kræft i spiserøret cellelinjer viser øget CD44-ekspression

For at undersøge den inverse korrelation af E-cadherin med CD44 i esophageal cancer cellelinjer analyserede vi esophageal planocellulært karcinom cellelinier (TE-1, -7, -8, -11 og -12), hoved-og-hals skællede kræft cellelinier (JHU-012, JHU-013) samt adenocarcinom cellelinier (FLO-1, OE33 og SK-GT-4) af Western Blot for E-cadherin og CD44-ekspression samt TGFβRII og vimentin. Mens standard form af CD44 (CD44s) udtrykkes i mesenkymale celler, er nogle variant former, CD44v, udtrykt i epitelceller [36]. Vi fandt, at celler, som bevarer E-cadherin-ekspression havde lavere niveauer af standard (85 kDa på grund af mangel på exon 6-15) og variant (150 kDa) af CD44. Tabet af E-cadherin korrelerer med forøget ekspression af CD44s og en stigning i ekspression af EMT markør vimentin (Fig. 2A). For at bestemme om genoprettelse af E-cadherin kan påvirke ekspressionen af ​​CD44s og CD44v, transficerede vi TE-8 og FLO-1 cellelinjer, både udtrykker lave niveauer af E-cadherin, med fuld længde E-cadherin. Efter genoprettelse af E-cadherin ekspression, blev det samlede niveau for CD44-ekspression faldt, men den variant (epithelial) formen (125 kDa) forøget (fig. 2B).

(A) Western blot-analyse af esophageal squamous carcinoma cellelinier (TE-1 -7, -8, -11, og -12), esophageal adenocarcinom cellelinier (FLO-1, OE33, SK-GT-4) og hoved og hals kræft cellelinier (JHU-012, JHU-013) viser, at ekspression af E-cadherin og TGFβRII er associeret med lave niveauer af CD44, mens tab af E-cadherin og TGFβRII korrelerer med opregulering af CD44 og EMT markør vimentin. (B) Genoprettelse af E-cadherin, ECAD, udtryk ved retroviral transfektion af TE-8 og FLO-1 celler i forhold til vektor kontrol (neo) viser et samlet fald i CD44-ekspression sammen med et skifte til øget CD44v løbet CD44s (CD44v: CD44variant, CD44s:. CD44 standard)

CD44-ekspression er opreguleret i esophageal epitelceller undergår EMT

Vi har tidligere etableret en model til at analysere virkningerne af E-cadherin tab på esophageal keratinocytter ved retroviral udtryk for dominant-negative E-cadherin (EF) eller dominant-negative E-cadherin i kombination med dominant-negativ TGFβRII (ECdnT) [25]. Vi udførte immunohistokemiske farvninger med antistoffer mod E-cadherin og CD44 og markører for EMT at belyse den rolle, CD44 i esophageal EMT og celleinvasion. EF og ECdnT celler er opreguleret CD44-ekspression, og den positive CD44 signal vid udstrækning lokaliseres til områder med epitelcelle invasion ind i den underliggende matrix (fig. 3). Både EF og ECdnT celler har øget niveauer af S100A4, vimentin og αSMA indikerer, at disse celler undergår EMT i organotypiske kulturer (fig. 3D-F).

Immunhistokemi af paraffinsnit med anti-E-cadherin antistof ( A), anti-TGFβRII (B) og anti-CD44 (C) viser CD44-positive celler i EF og ECdnT celler invaderer ind i den underliggende collagen /matrigel matrix (pile), der er negative for E-cadherin og TGFβRII. Immunohistokemisk farvning for EMT markører S100A4 (D), vimentin (E) og αSMA (F) viser øget positivt signal i invaderende celler. Scale bar er 50 mikron.

CD44 co-lokaliserer med MMP-9 på forkant af invasive områder og opreguleres af Activin A

For at analysere den mekanisme, hvormed CD44 medierer celleinvasion fokuserede vi på aktiveringen af ​​matrixmetalloproteinaser, fremtrædende proteaser fordøje den ekstracellulære matrix. For at visualisere MMP-aktivitet i områder af invasionen vi brugte i stedet zymografi. Fluorescein-positive områder afsløre MMP aktivitet var begrænset til den førende kant i EF og ECdnT celler og celle invasion ind i den underliggende matrix (fig. 4A). Konditionerede medier fra organotypiske kulturer viste en gradvis forøgelse af MMP-9-sekretion og MMP-2 og MMP-9-aktivitet i de invasive celler (fig. 4B). MMP-9 er blevet beskrevet som en bindingspartner af CD44 [37], [38]. Anvendes dobbelt immunfluorescensfarvning med antistof mod CD44 og MMP-9 vi illustrere deres co-lokalisering på celleoverfladen på forkanten af ​​invasive områder (fig. 4C). For at demonstrere en forøget invasiv potentiale som respons på activin A, et TGFp familiemedlem, sekretion, der er steget i de invasive organotypiske kulturer (data ikke vist), vi stimulerede ECdnT celler og esophageal cancercellelinie TE-11 og udviser forbedret celle invasion

in vitro

(fig. 4D).

(a) for

in situ

zymografi, er områder af MMP-aktivitet fremhævet af et positivt fluorescein signal på frosne snit af ECAD, EF og ECdnT organotypiske kulturer. (B) Zymografi hjælp organotypisk kultur konditioneret medium indsamlet fra ECAD, EF og ECdnT celler illustrerer forøget sekretion af MMP-2 og MMP-9. (C) Dobbelt immunfluorescensfarvning af ECAD, EF og ECdnT viser MMP-9 (rød) colokalisering med CD44 (grøn) i invasive celler. Scale bar er 50 mikron. (D) Stimulering med activin A inducerer forøget invasion af ECdnT og TE-11-celler i invasion assays. Sammenligning mellem grupper blev gjort ved Mennesket og Whitney ikke- parametrisk test, * p 0,05, ** p 0,001. (E) Western Blot af cellelysater fra TE-11 transficeret med AllStars negative ikke-silencing siRNA celler (Ctrl), og TE-11 celler transficeret med siRNA mod E-cadherin (SI1, SI2) viser opregulering af CD44 efter stimulation med Activin A.

Activin a er også blevet beskrevet at regulere stemness [17], og vi hypotese, at CD44 som en stamcelle markør kan være reguleret af activin A. for at identificere en potentiel signalvej ansvarlig for opregulering af CD44, vi analyserede esophageal cancer cellelinje, TE-11, efter knockdown af E-cadherin hjælp siRNA. Vi stimulerede TE-11 celler transficeret med siRNA mod E-cadherin-celler med activin A og analyseret ekspressionen af ​​CD44. Activin En behandling øget CD44-variant udtryk i TE-11 i fravær af E-cadherin (fig. 4E).

Samlet set viser disse data reguleringen af ​​CD44-ekspression af E-cadherin gennem Activin A og give funktionel evidens for en kausal rolle i induktionen af ​​celle invasion.

diskussion

Vi viser det gradvise tab af E-cadherin er forbundet med en progressiv stigning i CD44

in vitro

og

in vivo

. I mangel af E-cadherin, kan Activin A fremkalde CD44 udtryk. Activin A blev vist at være en vigtig regulator for stemness [17] og ligesom andre medlemmer af TGF-superfamilien, er også blevet rapporteret at påvirke udviklingen og tumorigenese [20], [22] – [24]. Overekspression af activin A er blevet beskrevet i esophageal pladecellecarcinom og er forbundet med dårlig prognose. Activin A fremmer tumorcelle aggressivitet ved forøget ekspression af MMP-7 og N-cadherin [22] – [24]. Her viser vi, at activin A kan opregulere CD44, som igen forankrer MMP-9 til den forreste kant og inducerer celleinvasion. Foreningen af ​​E-cadherin, CD44 og MMP’er med EMT foreslår en stor rolle for Activin A i EMT.

Vi fandt, at E-cadherin tab er ledsaget af en ændring i CD44 isoform udtryk. Skønt tidligere undersøgelser har vist, at alternativ splejsning af CD44 kunne styres via Ras-signalvejen til at fremme ekspression af variantformer [39], Warzecha et al. har for nylig identificerede epiteliale splejsning faktorer (ESRP1 og ESRP2) fremme ekspression af CD44v at opretholde den epitel fænotype [40]. Disse faktorer er tabt under EMT [41] – [43]. Tænkes, ekspression af standard CD44 er afhængig af tabet af ESRP1 og 2 i esophageal carcinoma. ESRP1 og 2-ekspression er blevet yderligere erkendt at være impliceret i EMT-associerede splejsning programmer i brystcancer [44]. Interessant silencing af ESPR1 /2 i epitelceller induceret ekspression af mesenchymale cadherin, N-cadherin, uden ændringer i E-cadherin ekspression. Omvendt kan ekspressionen af ​​ESPR1 reverse Twist-induceret EMT i mammaepitelceller. Desuden transskriptionsfaktoren Twist2 bidrager til udvidelse af stamceller-lignende cellepopulationer gennem nedregulering af E-cadherin og forøget ekspression af stamcellemarkører såsom CD44 [45].

Tilsammen er der flere mekanismer hvorved CD44-isoformer, alle deler den samme cytoplasmatiske domæne, kan inducere EMT, hvoraf mange involverer interaktionen af ​​det ekstracellulære domæne med mikromiljøet. CD44 kan fungere som en co-receptor for c-Met og er bona fide receptor for hyaluronsyre, som kan fremme EMT [9]. E-cadherin regulerer negativt interaktionen af ​​CD44 med hyaluronsyre resulterer i en suppression af tumorinvasion og celle forgrening morfogenese [46]. Vi viser her, at tabet af E-cadherin ekspression korrelerer med CD44s formen og induktion af en invasiv fænotype.

Vi har tidligere vist, at invasionen af ​​esophageal keratinocytter mangler funktionelle E-cadherin og TGFβRII blev medieret af cathepsin B [35]. Cathepsin B kan aktiveres i et surt miljø initieres ved interaktionen mellem CD44 med en Na + -H + veksler [37]. Mens øget cathepsin B aktivitet medfører TGF-aktivering [35], kan MMP-9 også aktivere TGF [47] forbinder data præsenteret her med vores tidligere undersøgelse. Parakrin TGFp signalering aktiverer fibroblaster, og også inducerer kapillær dannelse [48]. Disse observationer understreger betydningen af ​​den epitel-mesenkymale krydstale i tumorigenese.

Som konklusion viser vi, at CD44-opregulering er associeret med tabet af E-cadherin i esophageal carcinoma og at CD44 fremmer MMP-9 medieret tumorinvasion .

tak

Vi vil også gerne takke medlemmerne af Beauchamp laboratorium, Drs. Deane og Beauchamp, og Dr. Anil K. Rustgi og Vanderbilt Institut for Biostatistik for nyttige diskussioner.