PLoS ONE: Påvisning af human papillomavirus og p16 Immunhistokemi Expression i blærekræft med Pladecellekræft Differentiation

Abstrakt

Målsætninger

For at bestemme den potentielle sammenhæng mellem HPV-infektion og planocellulært komponent urothelial carcinom (UC) af blæren og at validere p16-overekspression som en surrogatmarkør for HPV-infektion i disse kræftformer blandt koreanerne.

Metoder

Vi analyserede tilstedeværelsen af ​​HPV-infektion under anvendelse af et HPV-DNA chip og udtryk for p16 hjælp immunhistokemi i 47 fag i perioden juli 2001 til marts 2011. undersøgelsen (n = 35) omfattede patienter med skællede differentiering af UC i blæren. Kontrolgruppen (n = 12) omfattede patienter med skællede metaplasi af blæren.

Resultater

Baseline karakteristika kontrol- og studiegrupper var ens. HPV-DNA-detektion satser var ca. 2 gange højere i undersøgelsen end kontrolgruppen (17,1% [6/35] versus 8,3% [1/12], henholdsvis), men forskellen var ikke statistisk signifikant. P16 overekspression blev påvist i 16/35 (45,7%) studiegruppe og 1/12 (8,3%) kontrol gruppe prøver (p = 0,034). Både HPV-positivitet og p16 overekspression var til stede i 3/35 (8,8%) studie gruppe prøver, men ingen af ​​kontrolgruppen (p = 0,295). I studiegruppen, procentdelen af ​​HPV-positive tilfælde, der var ikke-rygere var 2 gange højere end procentdelen af ​​HPV-negative sager, der var ikke-rygere (66,7% [4/6] versus 31,0% [9/29 ], henholdsvis); dog var statistisk signifikans ikke nået på grund af den lille stikprøve.

Konklusioner

HPV-infektion kan være forbundet med UC af blæren med skællede differentiering, især i ikke-rygere. Men p16 udtryk ikke ud til at være en stærk surrogat markør for tegn på HPV-infektion i denne type kræft

Henvisning:. Kim SH, Joung JY, Chung J, Park WS, Lee KH, Seo HK ( 2014) Påvisning af human papillomavirus og p16 Immunhistokemi Expression i blærekræft med Pladecellekræft Differentiering. PLoS ONE 9 (3): e93525. doi: 10,1371 /journal.pone.0093525

Redaktør: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences Center, USA

Modtaget: 8. oktober, 2013; Accepteret: 6 Mar 2014; Udgivet: Marts 27, 2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Cancer center (NCC-1.110.510), Republikken Korea. Men der finansierer havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft (BC) tegner sig for 3,2-4% af alle kræfttilfælde i hele verden, og ca. 90% af BC er urothelial karcinom (UC). Selv UC af blæren ofte har fokal pladedifferentiering, er det differentieret fra pladecellecarcinom (SCC) i blæren, som udelukkende indeholder keratin-dannende carcinomceller. BC sammensat af blandet urothelial og skællede fænotyper kaldes UC med pladedifferentiering (UC /SCC) [1].

Blandt de kendte carcinogener af UC i blære, cigaretrygning er den mest velkarakteriserede risikofaktor. Den er ansvarlig for næsten halvdelen af ​​BCs [2]. Andre risikofaktorer for BC omfatter erhvervsmæssig eksponering for en række aromatiske aminer; infektion relateret carcinogenese, såsom schistosomal infektion; og store doser af visse lægemidler, herunder cyclophosphamid og phenacetin [3]. Men et stort antal BCs forbliver uforklaret.

For nylig er rollen af ​​virus fået stor opmærksomhed som potentielle carcinogener, især human papillomavirus (HPV). HPV er en lille, rund, dobbeltstrenget DNA-virus, der inficerer stratificeret pladeepitel og er blevet anslået knyttet til næsten 10% af alle cancere i hele verden, især en delmængde af SCC’er af vulva, penis, anus, og oropharynx [4] – [7]. Blandt de forskellige HPV-typer, visse typer, såsom HPV-16 og HPV-18, har en etableret ætiologisk rolle i udviklingen af ​​anogenitale cancere. Selvom HPV-16 og /eller -18 genomiske sekvenser blev også identificeret i urinvejene af kvindelige patienter med tilbagevendende og vedvarende urethritis og blærebetændelse [8], [9], en række undersøgelser har undersøgt muligheden for, at HPV-infektion er en risiko faktor, der bidrager til UC af blæren; dog har deres resultater konflikt, så ingen endelige konklusioner er mulige [10] – [13].

Et beslægtet problem indebærer den mulighed, at p16 protein er overudtrykt i UC af blæren. Ekspressionen af ​​p16 er velkendt for at være forbundet med høj risiko HPV-infektion i livmoderhalskræft og hoved- og halscancer og det er blevet foreslået som en kvalificeret surrogatmarkør for identifikation af biologisk aktive HPV-infektion [14] – [16]. Men på trods af mange nyere undersøgelser, der fokuserer på SCC komponent UC i blæren, er det fortsat uklart, om overekspression af p16 protein er forbundet med onkogenese af UC af blære [5], [10], [17] – [19].

Derfor er formålet med den foreliggende undersøgelse var at bestemme tilstedeværelsen af ​​HPV-infektion og til at validere muligheden for p16-overekspression som en surrogatmarkør for HPV-infektion i UC /SCC af blæren i koreanerne rygere og ikke-rygere .

Materialer og metoder

efter godkendelse af den undersøgelse, som vores Institutional Review Board, blev 47 patienter udvalgt fra arkiverne i hospitalet i juli 2001 til marts 2011 (IRB No. NCCNCS-12 -643). Alle patienter forudsat verbal informeret samtykke. Den skriftlige samtykke blev ikke opnået, fordi IRB af National Cancer Center godkendt til at fritage skriftlige samtykke procedure. Vi undersøgte paraffinindlejrede vævsprøver opnået under transuretral resektion af blæren eller cystektomi. Undersøgelsen bestod af 35 patienter med blandet UC /SCC af blæren og kontrolgruppen bestod af 12 patienter med skællede metaplasi af blæren. Af koncernens patienter undersøgelse, 33 havde tegn på blandet UC /SCC og to havde omfattende SCC med en historie af UC. UC af blære prøver blev klassificeret i henhold til World Health Organization (WHO) og International Society of Urologiske patologi (ISUP) indplaceringskriterier og iscenesat i henhold til TNM 2010 versionen. Ingen af ​​patienterne havde kendt eller mistænkt historier Schistosoma heamatobium infektion, livmoderhalsen SCC, eller hoved og hals SCC.

Et repræsentativt SCC komponent i hver paraffin blok prøve blev valgt baseret på tilstedeværelsen af ​​tilstrækkelig kvalitet og mængde af ekstraheret DNA. DNA blev ekstraheret under anvendelse af Qiagen BioRobot M48 arbejdsstation (Qiagen, CA) og kvaliteten og mængden af ​​DNA blev målt ved anvendelse NanoDrop ND 1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Tilstedeværelsen af ​​HPV-infektion blev analyseret under anvendelse af en HPV-DNA-chip. HPV-genotypebestemmelse blev udført som pr fabrikantens protokol under anvendelse af en polymerasekædereaktion (PCR) -baseret mikromatrice systemet (Greencross, Gyeonggi, Korea), der består af multiple prober HPV L1-sekvens [20]. Disse prober omfattede specifikke prober til HPV-typer højrisiko (HPV-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, og 68) og lav risiko HPV typer (HPV-6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 54, og 70). Konsensus PCR-produkter blev hybridiseret til proberne på chippen, scannes (Scanner GX, PerkinElmer, MA), og derefter analyseret. PCR-amplifikation blev udført ved anvendelse af 10 pi oprenset DNA.

Immunhistokemi (IHC) farvning af p16-protein blev udført under anvendelse af specifikke E6H4 antistoffer (DAKO, Carpinteria, CA). IHC p16-ekspression blev scoret med en semikvantitativ komposit scoringssystem som følger: (1) farvningsintensitet, defineret som 0 for negative, 1+ for svag, 2+ for moderat og 3+ for stærk; (2) positiv område, defineret som (10 X) fraktion af farvede tumorceller i hele tumoren; og (3) ekspression score, defineret som farvningsintensitet multipliceret med den positive område. Den højest mulige score var 30. Overekspression af p16 blev defineret som en score 20 (figur 1)

A:. Pladecellecarcinomet komponenter er placeret under urotelial foring. Tumorcellerne er stærkt positive for p16 (x100). B: Denne sag er en blandet papillær urothelial karcinom (venstre øvre) og pladecellekræft. Pladecellecarcinomet komponent er stærkt positive for p16. C:. Pladecellekræft metaplasi viser ingen ekspression af p16

Forholdet mellem tilstedeværelse af HPV-infektion og klinisk-patologiske parametre blev vurderet ved anvendelse af Fishers eksakte test og Mann-Whitney test. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af STATA (frigive 9,2, STATA Inc, Tex, USA). Resultaterne blev betragtet som statistisk signifikant, hvis det tosidede p-værdi var. 0,05

Resultater

klinisk-patologisk karakteristika for de 35 UC /SCC patienter studiegruppe og 12 planocellulære patienter metaplasi kontrol gruppe vises i tabel blev observeret 1. Ingen demografiske forskelle mellem studie- og kontrolgrupper, herunder alder (71,2 ± 7,7 vs. 66,5 ± 10,1 år, p = 0,246), mandlige og kvindelige forhold (82,9% vs. 66,7%, p = 0,251) og rygevaner (62,9% vs. 41,7%, p = 0,311). I studiegruppen, 4 (12,1%) patienter havde lav kvalitet carcinom og 29 (87,9%) havde høj kvalitet. For de resterende 2 patienter, de tilgængelige prøver (fremstillet ved transuretral resektion af blæren) indeholdt kun en SCC komponent og derved forbyder tildeling af en karakter.

HPV-DNA blev påvist i 6 af de 35 (17,1%) studie gruppe prøver, og en af ​​de 12 (8,3%) kontrol gruppe prøver (tabel 2). Alle HPV’er var 18, med undtagelse af gruppe prøve en undersøgelse, som var typen 35. Overekspression af p16 blev påvist i 16 (45,7%) studie gruppe prøver og 1 (8,3%) kontrolgruppen prøve (Tabel 2). Både HPV positivitet og p16 overekspression var til stede i kun 3 (8,8%) studiegruppe prøver og ingen kontrolgruppe prøve.

For studiegruppen, var der ingen forskelle i alder, køn, scene, eller klasse mellem HPV-negative og HPV-positive tilfælde. Af de 29 HPV-negative tilfælde, 20 (69,0%) var rygere eller tidligere rygere, mens de 6 HPV-positive tilfælde, kun 2 (33,3%) var rygere eller tidligere rygere. For rygere eller eksrygere, procentdelen med HPV-negative BC var ca. 2 gange højere end procentdelen med HPV-positive BC. Derimod BC prøver af ikke-rygere viste en ca. 2 gange højere procentdel af HPV-positivitet end HPV-negativitet (tabel 3).

Diskussion

Ud over cigaretrygning, erhvervsmæssig udsættelse for aromatiske aminer, og anvendelse af specifikke lægemidler, såsom cyclophosphamid og phenacetin, som kendte risikofaktorer for BC, har HPV-infektion også blevet foreslået som en potentiel forårsagende agens for UC i blæren [21], [22 ]. Prævalensen af ​​HPV i UC af blæren rapporteret i tidligere undersøgelser har varieret fra 0% til 81,3% [23] – [25]. Forskellen skyldes sandsynligvis prøveudtagning problemer, forurening, følsomhed afsløring systemer, og geografisk variation [26].

Youshya et al. [21]. rapporterede, at 60% af patienterne var positive for HPV L1-capsidprotein ekspression ved immunofarvning, selvom PCR under anvendelse konsensus GP5 + /6 + primere ikke har kunnet påvise HPV-DNA. Den foreslåede Årsagen til forskellen af ​​HPV afsløring satser var de antistoffer, der blev anvendt, og følsomheden af ​​analysen til påvisning af DNA [27]. I denne undersøgelse benyttede vi HPV DNA-chip-microarray-system. HPV oligonukleotid microarray system er en nyudviklet bioteknologi, som kan anvendes i klinisk praksis til påvisning og genotypebestemmelse af HPV. HPV-DNA-chip microarray har vist højere følsomhed til påvisning af HPV-DNA end PCR alene i væv blok [28], [29].

HPV har en affinitet for pladecellekræft celler og dens association med human SCC af livmoderhalsen, hoved og hals, og anus er blevet veletableret [7]. I den aktuelle undersøgelse, detektionsraten af ​​HPV-DNA var 2 gange højere i studiegruppen med blandet UC /SCC af blæren (17,5%) end kontrolgruppen med skællede dysplasi (8,3%). Men vi kunne ikke bekræfte en statistisk signifikant stigning i risiko for HPV-infektion i studiegruppen, sandsynligvis på grund af den relativt lille stikprøve størrelse (tabel 2). Vore resultater stemmer overens med andre studier, hvor HPV-DNA blev påvist i både UC af blæren og SCC af blæren [30].

Selvom HPV-infektion er blevet associeret med BC i mange undersøgelser, er det vigtigt at indse, at en sådan sammenslutning ikke svarer til årsagssammenhæng. Ingen af ​​de tidligere undersøgelser har vist, at der findes en direkte sammenhæng mellem HPV-infektion og carcinogenese i BC, selv om muligheden for en kausal rolle er blevet foreslået på grund af ligheden til livmoderhalskræft og hoved og hals kræft, for hvilke en kausal sammenhæng har været etableret [19] [31], [32]. For at løse dette problem, vi har forsøgt at validere p16 overekspression som et surrogat markør for aktiv HPV-infektion i BC; men vi var ude af stand til at detektere en stærk forbindelse mellem p16 overekspression og HPV-infektion i UC /SCC af blæren (tabel 2)

HPV koder to oncoproteiner:. E6 og E7 [33]. E6-proteinet binder til vildtype (wt) p53, hvilket udløser ubiquitinmedieret nedbrydning af p53 eller direkte inaktivering wt-p53 ved kompleksdannelse [34], [35]. E7 binder til pRb og frigiver E2F transkriptionsfaktor, som efterfølgende letter celleproliferation. P16 er et cyclin-afhængig kinase (CDK) inhibitor, der blokerer CDK4-medieret phosphorylering af pRb og efterfølgende G1 til S progression. HPV-inficerede celler overekspression p16 i et forsøg på at kompensere for E7-induceret tab af pRb. På grund af disse negative feedbackmekanismer mellem pRb og p16, er overekspression af p16 nu ofte brugt som et surrogat markør for HPV onkogen udtryk. I denne undersøgelse blev p16 overudtrykkes i 45,7% af UC /SCC prøver; imidlertid både HPV-positivitet og p16-overekspression var til stede i kun 8,6%. Dette fund viser derved, at p16-ekspression ikke kunne være en stærk surrogatmarkør for tegn på HPV-infektion i UC /SCC, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne af Alexander et al. [10].

Ekstra fund af interesse i denne undersøgelse var de typer af HPV og højere procentdel af ikke-rygere i HPV-positive gruppe end i den HPV-negative gruppe. Næsten alle HPV-positive prøver i undersøgelsesgruppen var type 18. Den eneste undtagelse var en prøve med HPV-type 35, som er blevet betragtet som en variant af HPV 16, og som ikke tidligere er blevet isoleret fra blæren [36]. Som det er velkendt, at HPV-typerne 16 og 18 er kategoriseret som høj risikabelt HPV for en førende årsag til kræft blandt forskellige HPV-typer [7], [16], [37], [38], vores resultat med HPV type 18 og 35 kan være understøttet vores hypotese af HPV-infektion i forbindelse med carcinogenese af blærecancer. Selvom den øgede sandsynlighed for HPV-positivitet i ikke-rygere ikke nåede statistisk signifikans på grund af den lille prøvestørrelse, dette fund tyder på, at HPV-infektion yderligere kan være forbundet med udviklingen af ​​blandede UC /SCC af urinblære, især i ikke- rygere grund af dets to gange større procentdel af HPV positivitet end rygere (p = 0,286, tabel 3).

Denne undersøgelse havde nogle begrænsninger. En retrospektiv undersøgelse med et relativt lille antal prøver begrænset sin statistiske styrke og potentiel bias. Den serologi til HPV foreslået af Badawi kunne ikke udføres på grund af undersøgelsens design, selvom antistofresponsen (immunoglobulin [Ig] G) til L1 capsider kan anvendes som en markør af kumulative HPV eksponeringer [9]. Kontrolgruppen havde skællede metaplasi, mens en kontrolgruppe med normal urothelium kan have været mere passende at vise en stærk sammenhæng mellem HPV-infektion og carcinogenese af UC /SCC. Men denne undersøgelse er signifikant i bestemmelsen af ​​forholdet mellem HPV-infektion med forekomsten af ​​BC som en af ​​forårsagende faktorer i carcinogenese af blæren, og dette er den første papir, der beskriver den kliniske betydning af den mulige sammenhæng mellem HPV-infektion og blærecancer i ikke- rygere.

Konklusion

Baseret på resultaterne af denne undersøgelse, synes HPV-infektion at være forbundet med udviklingen af ​​blandede UC /SCC af urinblæren, især i ikke-rygere blandt koreanerne. Dog kan den rolle af HPV-infektion i udviklingen af ​​denne type kræft ikke være så stor som for SCC af livmoderhalsen eller hoved og hals. Derudover betyder p16-ekspression ikke at være en stærk surrogatmarkør for tegn på HPV-infektion i UC af blæren med pladedifferentiering.